Summary
L'imagerie par ultrasons de diagnostic s'est avéré être efficace dans le diagnostic de diverses maladies respiratoires chez les sujets humains et animaux. Nous démontrons un protocole d'échographie complet utilisé par le laboratoire du Dr Zuo pour analyser la cinétique de diaphragme spécifiquement dans les modèles de souris. C'est aussi une technique de recherche non-invasive qui peut fournir des informations quantitatives sur la fonction des muscles respiratoires de la souris.
Abstract
Analyse fonctionnelle des muscles squelettiques respiratoires rongeurs, en particulier le diaphragme, est généralement réalisée en isolant des bandes de muscles en utilisant des procédures chirurgicales invasives. Bien que ce soit une méthode efficace pour évaluer l'activité in vitro de la membrane, il s'agit d'une chirurgie non-survie. L'application de l'imagerie par ultrasons non invasif comme une procédure in vivo est bénéfique, car elle réduit non seulement le nombre d'animaux sacrifiés, mais est également approprié pour la surveillance de la progression de la maladie chez des souris vivantes. Ainsi, notre procédé d'imagerie par ultrasons peut vraisemblablement contribuer à la mise au point de nouvelles thérapies qui atténuent blessure musculaire induite par diverses maladies respiratoires. En particulier, dans le diagnostic clinique de maladies pulmonaires obstructives, l'imagerie par ultrasons a le potentiel pour être utilisé en conjonction avec d'autres tests standards pour détecter l'apparition précoce de la fatigue musculaire diaphragme. Dans le protocole actuel, nous décrivons comment évaluer précisément diaphragme contractilité dans un modèle de souris en utilisant une technique d'imagerie par ultrasons de diagnostic.
Introduction
Récemment, des techniques d'imagerie de diagnostic à ultrasons ont été appliqués à des modèles murins de l'hypertension rénovasculaire et 1,2 de cancer pancréatique. Cependant, ces techniques n'ont pas été largement utilisés dans respiratoire dosage de la fonction musculaire de rongeur. Par conséquent, nous avons développé une méthode d'imagerie par ultrasons de diagnostic comme un outil précieux pour l'évaluation in vivo longitudinales de la mobilité de la membrane chez la souris.
Il existe plusieurs avantages à l'imagerie par ultrasons de diagnostic. Par exemple, il est non invasive, sûre, portable, et permet des mesures en temps réel à un coût relativement faible 3. En particulier, certains dispositifs à ultrasons basse fréquence étaient capables de détecter le piégeage de l'air, une caractéristique clinique de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) d'intensité légère à grave limitation du débit 4. Ainsi, l'imagerie par ultrasons de diagnostic peut servir de méthode de dépistage facilement accessible et reproductible pour surveiller en temps réel des troubles respiratoires.
Les techniques d'imagerie par ultrasons de diagnostic sont souvent appliqués à de plus grands animaux ou des sujets humains. Cependant, il ya eu un nombre limité d'études d'imagerie par ultrasons sur des modèles de souris, ce qui est probablement dû aux difficultés de l'exécution des ultrasons sur des sujets de petite taille. Le protocole décrit une procédure de courant selon l'invention pour la mesure de la fonction de la membrane dans la souris. En outre, même si il ya eu plusieurs études sur les rongeurs sur la fonction de la membrane, la plupart des résultats ont été générés par l'isolement des bandes de muscle directement à partir de l'animal euthanasié 5-7. En revanche, en utilisant une méthode de diagnostic d'imagerie à ultrasons in vivo d'analyse de l'activité du diaphragme diminuerait le nombre d'animaux sacrifiés pour l'expérimentation. En outre, les traitements à long terme axées sur le renforcement de la contractilité diaphragme peuvent être évalués avec précision par ultrasons dans des modèles de rongeurs sans sacrifier les animaux.
ntent "> Dans notre laboratoire, nous avons développé une méthode efficace pour la visualisation ainsi que l'analyse de l'activité de la membrane de la souris en utilisant une machine à ultrasons, ce qui permet la compréhension de la fonction de la membrane in vivo, évite méthodes invasives pour les animaux, et des aides dans le développement de thérapeutiques traitements de la dysfonction respiratoire.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés et achevés conformément et la conformité avec le soin et l'utilisation des animaux institutionnel Comité Ohio State University (IACUC) les règlements et les lignes directrices.
1. Souris anesthésie
- Mettre en place un tableau de la procédure de nettoyage avec un tampon isotherme chauffée enveloppée dans une serviette chirurgicale. Le coussinet chauffant doit être maintenue entre 30 ° C et 34 ° C pour stabiliser la température interne de l'animal, tout en réduisant le stress potentiel de l'animal.
- Placez la souris dans une chambre d'induction de l'anesthésie avec les paramètres suivants: débit d'oxygène fixé à 1,5 L / min et vaporisateur isoflurane fixé à 3,5%. Sédation complète devrait avoir lieu dans les 1-2 min. Si une chambre d'induction n'est pas disponible, une cloche peut être utilisée avec une grille métallique placée dans le bas pour éviter le contact direct avec l'animal de l'isoflurane.
- Retirer immédiatement la souris de la chambre de l'induction foisest complètement anesthésié (atteint lorsque la souris perd la fonction motrice volontaire). Appliquer une ogive à l'animal pour l'entretien de l'anesthésie. Le débit d'oxygène doit être réduite à environ 0,5 L / min et le vaporisateur isoflurane doit être réglé dans la plage de 1,5 à 2,5%.
- Appliquez une petite quantité de pommade ophtalmique directement à la cornée afin de réduire la sécheresse oculaire 8. En outre, pendant l'anesthésie, la souris doit maintenir une absence du réflexe de retrait de la pédale, les muqueuses doivent rester une couleur rose, et la respiration doivent apparaître régulier.
2. Préparation de Diagnostic Ultrasound Imaging procédure
- Retenez chaque jambe de la souris sur la table de procédure chauffée avec un adhésif amovible, tel qu'une bande chirurgicale.
- L'utilisation d'un rasoir électrique, enlever les poils sur la surface ventrale du corps entre le moyen et l'abdomen jusqu'à la moitié de la cavité thoracique. Appliquer la crème d'épilation à réexamendéplacer le reste des cheveux qui n'est pas coupé par le rasoir. Essuyer la crème avec un tampon de gaze humide après 2-3 min.
- Enlever les poils en excès en utilisant un tampon de gaze humidifiée à l'eau et nettoyer la région rasée avec 70% d'alcool ou équivalent antiseptique. La sonde à ultrasons est appliqué à cette zone de visualiser la fonction de diaphragme. Un analgésique topique peut être prévu pour animaux connaissent une légère irritation de la peau due à l'épilation.
3. Diagnostic Ultrasound Imaging Protocole
- Allumer le dispositif à ultrasons et d'ajuster la puissance de sortie (si nécessaire) sur l'appareil en pourcentage pour obtenir une résolution optimale.
- Régler l'appareil à ultrasons soit B (luminosité)-mode, M (mouvement)-mode, ou les deux, avant l'imagerie, ce qui permet à la bonne visualisation de la contraction de la membrane de la souris.
- Appliquez une petite quantité de gel à ultrasons sur l'abdomen supérieur de la souris et masser le gel vers la cavité thoracique.
- Placez l'ultrason transducteur dans ce domaine et l'angle vers le haut vers le cœur. Ajuster la sonde jusqu'à ce qu'une résolution optimale de l'image est obtenue. Remarque: pour ce protocole, un réseau de micro-convexe ou linéaire progressive transducteur en réseau est une sonde idéal à utiliser en raison de la faible encombrement et une excellente résolution axiale 9; la fréquence doit être réglée dans la largeur de bande et pour ces expériences, une gamme de 6,5 à 12 MHz peut être utilisée.
- Appuyez sur la touche de congélation pour enregistrer temporairement les images de l'iris et afficher les contractions sélectionnés.
- Sauvegarder l'enregistrement en boucle ciné, qui permet des mesures ultérieures de course diaphragmatique ainsi que le taux de respiration. Remarque: vues d'images peuvent être enregistrées dans la mémoire de l'ordinateur ou sur un disque dur externe pour une analyse ultérieure 9.
- Mesurer avec précision la profondeur du mouvement de la membrane de détente à la contraction à l'aide des étriers électroniques qui font partie du logiciel d'ultrasons.
- Convertir lecine fichier en un fichier MPEG en boucle et déterminer le taux de respiration en comptant le nombre de contractions du diaphragme au cours de la période d'enregistrement. En variante, le nombre de contractions par minute (fréquence respiratoire) peut être comptée à partir de l'image en mode M.
4. Postanesthésiques récupération des animaux
- La souris devrait récupérer complètement de l'anesthésie en 1 heure. Ne pas laisser l'animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal.
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Representative Results
Une image ultrasonore typique d'un diaphragme de souris est représentée sur la Figure 1A. Le diaphragme de la souris déplacement vertical maximal a été enregistré. Cette distance a été calculée en mesurant avec précision la profondeur du mouvement de la membrane de relaxation de la contraction à l'aide des étriers électroniques qui font partie du logiciel d'ultrasons. Tableau 1 affiche ces indications de mesures de distance des contractions du diaphragme à partir de trois souris différentes. Après la conversion du fichier de boucle ciné dans un fichier MPEG, le taux de respiration a été déterminée en comptant le nombre de contractions du diaphragme au cours d'une seconde période d'enregistrement de six. Cette analyse peut être effectuée en utilisant B-mode. Sinon, en mode M fournit une image visualisée de la membrane mouvement vertical ainsi que le taux de respiration comme le montre la figure 1B. Ces résultats démontrent que ce procédé est efficace pour observer avec précision les contractions du diaphragme de souris. En outre, par recordi ng fonction de diaphragme, ce protocole permet également d'évaluer deux paramètres importants, y compris diaphragme excursion et le taux de respiration. Cette méthode d'imagerie est utile pour une comparaison directe entre le muscle du diaphragme sains et malades. Cependant, la figure 2 montre les artefacts d'imagerie potentiels qui peuvent survenir lors de l'exécution d'imagerie à ultrasons de diagnostic.
Figure 1. D'image par ultrasons représentative d'un diaphragme muscle de la souris (mode B) A.. Les lignes pointillées représentent solides et le diaphragme pendant les états contractés et détendu, respectivement. B. Une image de l'échographie représentant d'un diaphragme pouvoir de la souris (en mode M).pg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Une image échographique de la souris muscle du diaphragme avec la présence de réverbération possible (A) et la comète queue (B) objets (indiquées par les flèches). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| 1 er mesure (mm) | 2 ème mesure(Mm) | 3 ème mesure (mm) | Moyenne (mm) ± SD | |
| Souris 1 | 0,96 | 0,92 | 1,06 | 0,980 ± 0,072 |
| Souris 2 | 0,93 | 0,99 | 1.01 | 0,977 ± 0,042 |
| Souris 3 | 0,91 | 0,93 | 0,89 | 0,910 ± 0,020 |
Mesures Tableau 1. Distance de mouvement de la membrane de la souris. Averages ont été calculés à partir de trois valeurs enregistrées séparées pour chaque souris individuelle. L'écart-type est défini comme SD. Remarque, variance de l'animal n'a pas d'effet significatif sur la mesure des contractions du diaphragme (P = 0,1224).
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Discussion
Le protocole expérimental actuel au point des techniques d'imagerie par ultrasons de diagnostic propres à l'activité de la membrane dans un modèle de souris par le biais d'une approche non invasive, in vivo. Les réglages de l'appareil d'anesthésie sont des valeurs approchées, qui peuvent être légèrement ajustés pour chaque animal puisque les souris individu peut réagir différemment à l'anesthésie. Pour éviter l'administration de l'anesthésie inappropriée, il est important de surveiller régulièrement les signes vitaux de la souris, y compris la fréquence cardiaque, le rythme respiratoire et la température corporelle. En outre, les cheveux doivent être retirés avant l'échographie parce que les cheveux rasé peut rendre l'image floue et empêcher la visualisation précise des contractions du diaphragme.
Nous avons utilisé en mode B imagerie par ultrasons pour fournir une à deux dimensions (2D), l'image en coupe transversale du diaphragme et de la souris utilisé en mode M pour suivre la cinétique de mouvement diaphragme. Il est important d'utiliser un capteur de réseau de micro-convexe pour les images 2D, car il profournit amélioration de la résolution axiale des structures anatomiques superficiellement situés par rapport aux capteurs de réseau linéaire traditionnels 10. Il est également important de noter que la focalisation électronique de l'image se dégrade lorsque la longueur focale est prolongé 9. En outre, une quantité suffisante de gel d'ultrasons doit être appliqué sur l'abdomen de la souris pour acquérir des images distinctes. Le gel limite la possibilité de poches d'air entre la peau et le transducteur pour produire une image haute résolution 11.
Bien que l'application de l'imagerie par ultrasons de diagnostic est prometteur, il existe des limitations à l'utilisation de cette technique comme outil de recherche. Par exemple, il est essentiel que l'utilisateur final est bien formé pour obtenir des images précises et reproductibles et est capable d'interpréter l'activité de la membrane de manière cohérente. En outre, des artefacts d'image de miroir se produisent quand une structure anatomique, comme la membrane, est affichée deux fois sur le moniteur. C'est considérered un artefact de propagation et de résultats dans la réflexion étant situé dans le mal 12,13 du système d'exploitation à ultrasons. Par exemple, des transducteurs à ultrasons peuvent produire plusieurs faisceaux hors axe qui peut se refléter sur une structure anatomique qui n'est pas dans la voie de la principale 12,14 faisceau. En outre, en raison de la réfraction, le faisceau peut ne pas toujours se déplacer en ligne droite à partir du réflecteur. Depuis l'échographie ne peut traiter le signal qui est renvoyé au transducteur et ne peut pas déterminer le moment de la réfraction, le moniteur peut afficher probablement la même structure anatomique à deux reprises à des distances différentes et présentent ainsi un artefact d'image de miroir.
Un artefact de propagation supplémentaire que l'on rencontre est la réverbération. Cet artefact affiche régulièrement espacées des lignes parallèles qui sont généralement positionnés perpendiculairement au faisceau d'ultrasons (figure 2A) 15. Ce type d'artefact peut perturber un véritable champ devision et masque structures anatomiques spécifiques d'intérêt. Ainsi, la prudence devrait être prise lors de l'analyse des données. Un sous-ensemble de la réverbération artefact est la comète queue ou B-lignes. Il s'agit d'un type de réverbération artefact qui forme une trajectoire verticale d'échos denses, s'étendant à partir de la membrane sur le bord de l'écran d'ultrasons 16 (comme illustré sur la figure 2B). Ces artefacts sont produites par des réflexions multiples qui se produisent entre ou à l'intérieur d'une structure et au transducteur 13, qui peut être minimisée en inclinant le transducteur afin d'éviter un contact perpendiculaire avec les objets de la 17 spéculaire. Malgré ces limites, l'imagerie à ultrasons de diagnostic permet une analyse sûre, sensible et rapide de la fonction de la membrane dans un modèle de souris, ce qui peut potentiellement évaluer rongeur dysfonction du diaphragme et aider à développer des thérapies pré-cliniques de nouveaux pour les troubles respiratoires.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par des subventions du Fonds général et du Fonds OU G110 d'excellence en recherche de l'OSU-HRS Fonds 013000 la recherche biomédicale et. Les auteurs tiennent à remercier Lauren Chen pour son aide dans la préparation de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
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