Summary
Imagiologia de ultra-sons de diagnóstico tem provado ser eficaz para o diagnóstico de várias doenças respiratórias, em seres humanos e animais. Nós demonstramos um protocolo ultra-som abrangente utilizado pelo laboratório do Dr. Zuo para analisar a cinética de diafragma especificamente em modelos do rato. Esta é também uma técnica de pesquisa não-invasivo, que pode fornecer informações quantitativas sobre a função de mouse da musculatura respiratória.
Abstract
A análise funcional dos músculos esqueléticos respiratórias de roedores, em particular o diafragma, é geralmente realizada através do isolamento de tiras de músculo usando procedimentos cirúrgicos invasivos. Embora este seja um método eficaz de avaliação da atividade do diafragma vitro, envolve cirurgia não-sobrevivência. A aplicação de ultra-som não-invasivo, como um processo in vivo, é benéfico, uma vez que não só reduz o número de animais sacrificados, mas é também adequado para a monitorização da progressão da doença em ratinhos vivos. Assim, o nosso método de imagem de ultra-som pode provavelmente auxiliar no desenvolvimento de novas terapias que aliviam a lesão muscular induzida por várias doenças respiratórias. Particularmente, em diagnósticos clínicos de doenças pulmonares obstrutivas, imagiologia de ultra-som tem o potencial para ser usado em conjunto com outros testes padrão para detectar o aparecimento precoce de fadiga muscular diafragma. No protocolo atual, nós descrevemos como avaliar com precisão diafragma contratilidadelidade em um modelo de camundongo usando uma técnica de imagem de ultra-som diagnóstico.
Introduction
Recentemente, técnicas de imagem de ultra-som de diagnóstico foram aplicados a modelos de ratos com hipertensão renovascular e 1,2 câncer no pâncreas. No entanto, estas técnicas não têm sido amplamente utilizados no ensaio de função da musculatura respiratória roedor. Por isso, desenvolvemos um método de imagem de ultra-som diagnóstico como uma ferramenta valiosa para a avaliação in vivo longitudinais da mobilidade diafragmática em camundongos.
Existem várias vantagens para ultra-sonografia diagnóstica. Por exemplo, é não-invasivo, seguro, portátil, e permite medições em tempo real a um custo relativamente baixo 3. Particularmente, certos dispositivos de ultra-som de baixa freqüência foram capazes de detectar o aprisionamento de ar, uma característica clínica da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) com leve a grave limitação do fluxo aéreo 4. Assim, a ultra-sonografia de diagnóstico pode servir como um método de triagem de fácil acesso e reprodutível para monitoramento em tempo real de doenças respiratórias.
Técnicas de imagem de ultra-som diagnóstico são freqüentemente aplicada aos animais maiores ou seres humanos. No entanto, tem havido um número limitado de estudos de imagem de ultra-som em modelos de ratos, o que é provável, devido aos desafios da realização de ultra-som sobre assuntos de pequena escala. O protocolo atual delineia um novo procedimento para medir a função do diafragma no mouse. Além disso, embora tenha havido vários estudos com roedores para a função de diafragma, a maior parte dos resultados foram obtidos por isolamento a partir de tiras de músculo directamente o animal sacrificado 5-7. Em contraste, utilizando um método in vivo de imagens de ultra-sons de diagnóstico para analisar a actividade do diafragma iria reduzir o número de animais sacrificados para a experimentação. Além disso, os tratamentos de longo prazo com foco em melhorar a contratilidade do diafragma pode ser avaliada com precisão através de ultra-som em modelos de roedores sem sacrificar animais.
ntent "> No nosso laboratório, foi desenvolvido um método eficaz para a visualização, bem como analisando a actividade diafragma rato utilizando uma máquina de ultra-sons, o que ajuda a compreender o funcionamento do diafragma in vivo, evita métodos invasivos para animais, e auxilia no desenvolvimento de terapêuticas tratamentos para a disfunção respiratória.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos que envolvem seres animais foram aprovados e concluídos de acordo eo cumprimento do Institutional Animal Care e Use Committee Ohio State University (IACUC) regulamentos e diretrizes.
1. Rato Anestesia
- Alterar uma tabela de procedimento de limpeza com um bloco isotérmico aquecido envolto em uma toalha cirúrgica. A almofada de aquecimento deve ser mantida entre 30 ° C e 34 ° C, para estabilizar a temperatura do núcleo do animal ao mesmo tempo reduzir o estresse potencial para o animal.
- Posicione o mouse em uma câmara de indução anestésica com os seguintes parâmetros: taxa de fluxo de oxigênio definido para 1,5 L / min e vaporizador isoflurano definido para 3,5%. Sedação completa deve ocorrer dentro de 1-2 min. Se uma câmara de indução não está disponível, uma campânula de vidro pode ser usado com uma rede de arame posicionado na parte inferior para evitar o contacto directo com os animais do isoflurano.
- Remover imediatamente o rato da câmara de indução, uma vez queestá completamente anestesiado (conseguido quando o mouse perde a função motora voluntária). Aplicar um nariz-cone para o animal para a manutenção da anestesia. A taxa de fluxo de oxigénio deve ser reduzida para aproximadamente 0,5 L / min e o vaporizador isoflurano deve ser mantida no intervalo de 1,5 a 2,5%.
- Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica diretamente para as córneas para reduzir a secura dos olhos 8. Além disso, durante a anestesia, o mouse deve manter uma ausência do reflexo interdigital, as mucosas deve permanecer uma cor-de-rosa, ea respiração deve aparecer constante.
2. Preparação para o diagnóstico Ecografia Procedimento
- Contenha cada perna do mouse sobre a tabela de procedimento aquecida com um adesivo removível, como esparadrapo.
- Usando um barbeador elétrico, retire o cabelo na superfície ventral do corpo entre o modo como abdômen e meia até a cavidade torácica. Aplicar creme de depilação para mais remover o restante do cabelo, que não é cortada pela navalha. Limpe o creme com uma gaze úmida após 2-3 min.
- Retire o excesso de pêlos com uma gaze umedecida almofada de água e limpe a região depilada com álcool 70% ou equivalente anti-séptico. A sonda de ultra-sons irá ser aplicada a esta área para visualizar a função de diafragma. Um analgésico tópico pode ser fornecido aos animais experimentam irritação de pele menor, devido à remoção de pêlos.
3. Diagnóstico Ecografia Protocolo
- Ligue o aparelho de ultra-som e ajustar a potência de saída (se necessário) sobre o aparelho por porcentagem para obter uma melhor resolução.
- Configure o aparelho de ultra-som, quer B (brilho)-mode, M (movimento)-mode, ou ambos antes de imagem, que permite a visualização adequada da contração do diafragma do rato.
- Aplique uma pequena quantidade de gel de ultra-som na parte superior do abdómen do rato e massagear o gel para a cavidade torácica.
- Colocar os ultrasoar transdutor nesta área e ângulo-a para cima em direção ao coração. Ajustar a sonda até uma resolução optimizada da imagem é obtida. Nota: para este protocolo, uma matriz de micro-convexa ou transdutor linear em fases é uma sonda ideal para usar devido ao tamanho reduzido e excelente resolução axial 9; a frequência precisa de ser ajustada através da largura de banda e para estas experiências pode ser utilizada uma gama de 6,5-12 MHz.
- Pressione o botão de congelação para guardar temporariamente as imagens do diafragma e visualizar as contrações selecionados.
- Salve a gravação como um cine loop, o que permite medições posteriores de excursão diafragmática, bem como a taxa de respiração. Nota: quadros de imagens podem ser salvas na memória do computador ou em um disco rígido externo para análise futura 9.
- Precisamente medir a profundidade do movimento do diafragma de relaxamento para contração usando as pinças de eletrônicos que fazem parte do software de ultra-som.
- Converter aarquivo cine loop para um ficheiro MPEG e determinar a taxa de respiração através da contagem do número de contracções do diafragma durante o período de gravação. Alternativamente, o número de contracções por minuto (taxa de respiração) podem ser contadas a partir da imagem do modo-M.
4. Pós-anestésica de recuperação de animais
- O mouse deve se recuperar completamente da anestesia dentro de 1 hora. Não deixe o animal sozinho até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
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Representative Results
Uma imagem típica de uma membrana de ultra-sons do rato é mostrada na Figura 1A. O diafragma do rato deslocamento vertical máxima foi registrada. Esta distância foi calculada medindo com precisão a profundidade do movimento do diafragma de relaxamento para contração usando as pinças de eletrônicos que fazem parte do software de ultra-som. Tabela 1 apresenta essas medidas de distância de contrações do diafragma de três ratos diferentes. Depois de converter o ficheiro de cine loop para um ficheiro MPEG, a taxa de respiração foi determinada por contagem do número de contracções do diafragma durante um segundo período de seis gravação. Esta análise pode ser realizada utilizando-modo-B. Alternativamente, modo-M fornece uma imagem visualizada do diafragma movimento vertical, bem como a taxa de respiração, como mostrado na Figura 1B. Estes resultados demonstram que este método é eficaz em observar com precisão contrações do diafragma de rato. Além disso, por recordi ng função diafragma, este protocolo também permite avaliar dois parâmetros importantes, incluindo a excursão do músculo diafragma e taxa de respiração. Este método de imagem é útil para a comparação direta entre o músculo diafragma saudável e doente. No entanto, a Figura 2 demonstra os artefatos de imagem potenciais que podem ocorrer durante a execução de imagens de ultra-som diagnóstico.
Figura 1. A. A imagem representativa de ultra-som de um músculo diafragma de rato (modo-B). As linhas contínuas e tracejadas representam o diafragma durante estados contraídos e relaxados, respectivamente. B. Uma imagem de ultra-som representante de um diafragma contratação do mouse (M-mode).pg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Uma imagem de ultra-som de rato músculo diafragma com a presença de possível reverberação (A) e cometa-tail (B) artefatos (indicadas pelas setas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 1 ª medição (mm) | ª medição 2(Mm) | 3 ª medição (mm) | Média (mm) ± SD | |
| Rato 1 | 0,96 | 0,92 | 1.06 | 0,980 ± 0,072 |
| Mouse 2 | 0,93 | 0.99 | 1.01 | 0,977 ± 0,042 |
| Rato 3 | 0.91 | 0,93 | 0,89 | 0,910 ± 0,020 |
Medições Tabela 1. Distância de movimento do mouse diafragma. Averages foram calculados a partir de valores registados três separadas para cada ratinho individual. O desvio padrão é definido como SD. Note-se, variância animal não tem efeito significativo sobre a medição de contrações do diafragma (P = 0,1224).
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Discussion
O protocolo experimental atual desenvolve técnicas de imagem de ultra-som de diagnóstico específicos para a atividade do diafragma em um modelo do rato através de uma abordagem in vivo não-invasivo,. As configurações de aparelhos de anestesia são valores aproximados, que podem ser ajustadas ligeiramente para cada animal, desde ratos indivíduo pode responder de forma diferente a anestesia. Para evitar a administração de anestesia inadequada, é importante monitorar regularmente os sinais vitais do rato, incluindo a frequência cardíaca, frequência respiratória e temperatura corporal. Além disso, o cabelo deve ser removido antes da ultra-sonografia porque o cabelo barba por fazer pode borrar a imagem e impedir a visualização precisa das contrações do diafragma.
Foi utilizado ultra-som modo-B para proporcionar um bidimensional (2D) de imagem em corte transversal do diafragma do rato e utilizado em modo-M para controlar a cinética do movimento do diafragma. É importante o uso de um transdutor micro-convexo para imagens 2D porque provides melhor resolução axial de estruturas anatômicas localizadas superficialmente comparação com tradicionais transdutores de matriz linear 10. É também importante notar que a electrónica de focagem da imagem diminui à medida que a distância focal é alargada 9. Além disso, uma quantidade suficiente de gel de ultra-som deve ser aplicado para o abdómen do rato para a aquisição de imagens distintas. O gel limita a possibilidade de bolhas de ar entre a pele e o transdutor para produzir uma imagem de alta resolução 11.
Embora a aplicação de ultra-som diagnóstico é promissor, existem limitações para o uso desta técnica como ferramenta de pesquisa. Por exemplo, é fundamental que o usuário final é bem treinado na obtenção de imagens precisas e reprodutíveis e é capaz de interpretar a atividade do diafragma de forma consistente. Além disso, os artefactos de imagem no espelho quando ocorrer uma estrutura anatómica, tal como o diafragma, é exibida duas vezes no monitor. Este é considerared um artefacto de propagação e os resultados na reflexão sendo impropriamente localizada dentro do sistema operativo de ultra-sons 12,13. Por exemplo, transdutores de ultra-som pode produzir vários feixes de fora do eixo, que pode refletir fora de uma estrutura anatômica que não está no caminho do feixe principal 12,14. Além disso, devido à refração, o raio não pode sempre viajar em uma linha reta desde o refletor. Uma vez que o ultra-som só pode processar o sinal que é devolvido para o transdutor, e não pode determinar a temporização da refracção, o monitor pode provavelmente apresentar a mesma estrutura anatómica duas vezes a distâncias diferentes e, assim, apresentam um artefacto de imagem de espelho.
Um artefato adicional propagação que é encontrado é reverberação. Este artefato exibe uniformemente espaçados linhas paralelas que são geralmente posicionados perpendicularmente ao feixe de ultra-sons (Figura 2A) 15. Este tipo de artefato pode perturbar um verdadeiro campo deestruturas anatômicas específicas de visão e máscara de interesse. Assim, o cuidado deve ser tomado quando se analisa os dados. Um subconjunto de reverberação artefato é o cometa-tail ou linhas-B. Estes são um tipo de reverberação artefacto que forma uma trajectória vertical de ecos densos, que se estende a partir da membrana da borda da tela de ultra-som 16 (como ilustrado na Figura 2B). Estes artefactos são produzidos por várias reflexões, que ocorrem entre ou dentro de uma estrutura e o transdutor 13, o qual pode ser minimizado pela angulação do transdutor para evitar um contacto perpendicular com a especular objectos 17. Apesar destas limitações, a ultra-sonografia diagnóstica permite uma análise segura, sensível e rápida da função do diafragma em um modelo de rato, o que pode potencialmente avaliar roedor disfunção do diafragma e ajudar a desenvolver terapias pré-clínicos inovadores para doenças respiratórias.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por subsídios da UO Fundo Geral G110 e Fund Research Excellence de Pesquisas Biomédicas e OSU-HRS Fundo 013.000. Os autores gostariam de agradecer a Lauren Chen por sua ajuda na preparação deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
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