Summary
Диагностический ультразвуковое исследование доказало свою эффективность в диагностике различных заболеваний органов дыхания в людей и животных. Мы демонстрируем комплексный протокол ультразвукового используются лаборатории доктора Цзо проанализировать мембранные кинетики специально на мышах. Это также неинвазивный метод исследования, который может обеспечить количественную информацию о функции дыхательных мышц мыши.
Abstract
Функция анализ грызунов дыхательных скелетных мышц, особенно диафрагма, обычно проводится путем выделения мышечные полоски с помощью инвазивных хирургических процедур. Хотя это является эффективным методом оценки в пробирке деятельность диафрагмы, это включает в себя операции, не выживания. Применение неинвазивной ультразвуковой визуализации в качестве процедуры в естественных выгодно, поскольку он не только уменьшает количество животных, умерщвленных, но также подходит для мониторинга прогрессирования заболевания у живых мышей. Таким образом, наш метод ультразвукового изображения может скорее помочь в разработке новых методов лечения, которые облегчить повреждения мышц, вызванную различными заболеваниями органов дыхания. В частности, в клинических диагнозов обструктивные заболевания легких, ультразвуковое исследование имеет потенциал, который будет использоваться в сочетании с другими стандартными тестами для выявления раннее начало диафрагма мышечной усталости. В текущем протоколе, мы опишем, как точно оценить диафрагмы contractiLITY в мышиной модели с помощью диагностический метод ультразвукового изображения.
Introduction
В последнее время методы диагностики Ультразвуковое исследование были применены к мышиных моделях реноваскулярной гипертонии и поджелудочной 1,2 рака. Однако эти методы не были широко использованы в грызунов дыхательной функции мышц анализа. Таким образом, мы разработали метод диагностики УЗИ изображений в качестве ценного инструмента для в естественных условиях продольных оценок подвижности диафрагмы у мышей.
Есть несколько преимуществ для диагностической визуализации ультразвука. Например, это неинвазивный, безопасный, портативный, и позволяет для измерений в реальном масштабе времени при относительно низкой стоимости 3. В частности, некоторые ультразвуковые устройства низкочастотные смогли обнаружить пузырьков воздуха, клиническое характеристику хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) с легкой до тяжелой ограничения скорости воздушного потока 4. Таким образом, диагностическая визуализация УЗИ может служить легко доступной и воспроизводимый метод скрининга для мониторинга в реальном времени дыхательных расстройств.
Диагностические методики ультразвукового изображения часто применяется для более крупных животных или людях. Тем не менее, было ограниченное количество ультразвуковых изображений исследований по мышиных моделях, которые, вероятно, из-за вызовы выполнения УЗИ на мелких предметов. Текущий протокол описывает процедуру роман для измерения функции диафрагмы у мышей. Кроме того, хотя было несколько исследований на грызунах на функцию диафрагмы, большинство результатов были получены путем изоляции мышц полосы непосредственно из эвтаназии животного 5-7. В противоположность этому, с помощью ультразвуковой диагностический метод в естественных изображений для анализа активности мембраны бы уменьшить количество животных, умерщвленных для экспериментов. Кроме того, долгосрочные процедуры, направленные на повышение диафрагмы сократимость может быть точно оценены через ультразвука в моделях грызунов, не жертвуя животных.
ntent "> В нашей лаборатории мы разработали эффективный метод для визуализации, а также анализа мыши деятельность диафрагмы с использованием ультразвукового аппарата, который помогает понимание функции диафрагмы в естественных условиях, позволяет избежать инвазивных методов к животным, и помогает в разработке терапевтических лечения дыхательной дисфункции.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с предметов животных были одобрены и завершены в соответствии и с соблюдением Государственного Университета Огайо Institutional уходу и использованию животных комитета (IACUC) правил и руководств.
1. Мышь Анестезия
- Настройка чистый стол процедуры с подогревом изотермического площадку, завернутый в хирургической полотенцем. Грелку следует поддерживать в диапазоне от 30 ° С до 34 ° С, чтобы стабилизировать температуру внутри животного при одновременном снижении потенциального стресс для животного.
- Место мыши в индукционной камере анестезии со следующими параметрами: скорость потока кислорода установлен в 1,5 л / мин и изофлуран испаритель установлен в 3,5%. Полный седации должно происходить в течение 1-2 мин. Если индукции камера отсутствует, колпак может быть использован с проволочной сеткой, расположенной внизу экрана, чтобы избежать прямого контакта животных с изофлураном.
- Немедленно снять мышь от индукции камеры, как только онполностью под наркозом (достигается, когда мышь теряет добровольное моторную функцию). Нанесите носовой конус для животного для поддержания анестезии. Скорость потока кислорода должна быть снижена до приблизительно 0,5 л / мин и изофлуран испаритель должен быть установлен в пределах от 1,5 до 2,5%.
- Нанесите небольшое количество глазной мази непосредственно к роговицы, чтобы уменьшить сухость глаз 8. Кроме того, во время анестезии, мышь должна поддерживать отсутствие педали отмены рефлекса, слизистых оболочек должна оставаться розовый цвет, и дыхание должны появиться устойчивым.
2. Подготовка к диагностической ультразвуковой процедуры визуализации
- Сдерживать каждую ногу мыши на столе процедуры подогревом со съемным клеем, например, хирургической лентой.
- Использование электрическую бритву, удалить волосы на вентральной поверхности тела между брюшной полости и половина пути грудной полости. Применить удаления крем для волос, чтобы последующего реэкспортапереместить оставшиеся волосы, не разрезать бритвой. Протрите крем влажной марлевой салфеткой после 2-3 мин.
- Удалите лишние волосы с использованием водяной смачивают марлевый тампон и очистить бритой области с 70% спиртом или эквивалент антисептик. Ультразвуковой зонд будет применяться к этой области, чтобы визуализировать функцию диафрагмы. Актуальным анальгетик может быть предоставлена животных, испытывающих незначительное раздражение кожи из-за удаления волос.
3. Диагностическая ультразвуковая томография протокол
- Включите ультразвукового устройства и регулировать выходную мощность (при необходимости) на аппарате в процентах для получения оптимального разрешения.
- Установите машину ультразвука либо B (яркости) режиме, М (движения) режиме, или как до визуализации, что позволяет для правильного визуализации сокращениями диафрагмы мыши.
- Нанесите небольшое количество ультразвукового геля на верхней части живота мыши и массаж гель к грудной полости.
- Наведите ультразвук датчик в этой области и угол ее вверх к сердцу. Отрегулируйте датчик до оптимизированное разрешение изображения не будет достигнута. Примечание: для этого протокола, микро-выпуклый массив или линейный поэтапный антенная решетка является идеальным зонд использовать в связи с малой площадью основания и отличным разрешением осевой 9; частота должна быть скорректирована по полосе частот и для этих экспериментов диапазон 6.5-12 МГц может быть использован.
- Нажмите кнопку замораживания временно сохранять изображения диафрагмы и просматривать выбранные сокращения.
- Сохранить запись как кинопетли, что позволяет более поздних измерениях диафрагмальной экскурсии, а также частоты дыхания. Примечание: кадры из изображений могут быть сохранены в памяти компьютера или на внешнем жестком диске для последующего анализа 9.
- Именно измерить глубину движения диафрагмы от релаксации к сокращению использования электронных суппорты, которые являются частью программного обеспечения ультразвука.
- Преобразованиекино файл контур в файл MPEG и определяют частоту дыхания путем подсчета количества диафрагмальных сокращений в течение периода записи. С другой стороны, количество сокращений в минуту (частота дыхания) может быть отнесен от образа М-режиме.
4. Сообщение Анестезия животных восстановления
- Мышь должна полностью оправиться от наркоза в течение 1 часа. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичный ультразвуковое изображение диафрагмы мыши показано на фиг.1А. Мембрана мышь максимальное вертикальное перемещение было записано. Это расстояние была рассчитывается путем точного измерения глубины движения диафрагмы от релаксации к сокращению использования электронных суппорты, которые являются частью ультразвукового программного обеспечения. Таблица 1 показывает эти измерения расстояния из диафрагмальных сокращений из трех разных мышей. После преобразования файла кинопетли в файл MPEG, частота дыхания была определена путем подсчета количества диафрагмальных сокращений в течение второго периода записи шесть. Этот анализ может быть выполнена с использованием B-режим. Альтернативно, M-режим обеспечивает визуализировать изображение диафрагмы вертикального движения, а также частоту дыхания, как показано на фиг.1В. Эти результаты показывают, что этот метод эффективен при наблюдении точно мыши сокращений диафрагмы. Кроме того, по recordi нг функцию диафрагмы, этот протокол также позволяет для оценки двух важных параметров, включая экскурсии диафрагмы и частоты дыхания. Этот метод визуализации используется для прямого сравнения между здоровой и пораженной мышцы диафрагмы. Тем не менее, 2 демонстрирует потенциальные артефакты визуализации, которые могут возникнуть при выполнении диагностики Ультразвуковое исследование.
Рисунок 1. А. Представитель УЗИ образ мыши диафрагмы мышцы (B-режим). Твердые и пунктирные линии изображают диафрагму во время напрячься и расслабиться государств, соответственно. Б. Представитель ультразвуковое изображение диафрагмы контрактов мыши (М-режим).пг "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Ультразвуковое изображение мыши диафрагмы мышцы с наличием возможной реверберации (А) и кометы хвост (B) артефактов (показано стрелками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| 1-й размер (мм) | 2 Измерение й(Мм) | 3 Измерение й (мм) | Средний (мм) ± SD | |
| Мышь 1 | 0.96 | 0.92 | 1.06 | 0,980 ± 0,072 |
| Мышь 2 | 0.93 | 0.99 | 1.01 | 0.977 ± 0.042 |
| Мышь 3 | 0.91 | 0.93 | 0.89 | 0,910 ± 0,020 |
Таблица 1. Расстояние измерения мыши движения диафрагмы. Усредняяэс были рассчитаны из трех отдельных записанных значений для каждого отдельного мыши. Стандартное отклонение определяется как SD. Обратите внимание, что животное дисперсия не оказывает существенного влияния на оценку сокращений диафрагмы (р = 0,1224).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нынешний экспериментальный протокол развивает диагностические методы ультразвуковой визуализации, относящиеся к деятельности диафрагмы в модели мыши с помощью неинвазивного, в естественных условиях подхода. Настройки аппарата анестезии аппроксимируются значения, которые могут быть немного скорректированы для каждого животного, так как индивидуальный мыши могут по-разному реагировать на анестезию. Для предотвращения неправильного администрирования анестезии, важно регулярно контролировать жизненно важные признаки мыши в том числе сердечных сокращений, частоты дыхания и температуры тела. Кроме того, волосы должны быть удалены перед УЗИ, потому небритый волос может размытия изображения и предотвратить точную визуализацию сокращений диафрагмы.
Мы использовали изображений ультразвука В-типа для обеспечения двумерного (2D) изображения поперечного сечения диафрагмы мыши и используется M-режим, чтобы контролировать кинетику движения диафрагмы. Важно использовать микро-выпуклый массив преобразователь для 2D-изображений, потому что это проVides улучшилось осевой разрешение поверхностно расположенных анатомических структур по сравнению с традиционными преобразователями линейный массив 10. Важно также отметить, что электронный фокусировки изображения ухудшается как фокусное расстояние увеличивается 9. Кроме того, достаточное количество ультразвуковой гель следует наносить на брюшной полости мыши для получения различных изображений. Гель ограничивает возможность воздушных карманов между кожей и датчиком для получения изображения с высоким разрешением 11.
Хотя применение диагностической визуализации ультразвукового является перспективным, есть ограничения на использование этой техники в качестве исследовательского инструмента. Например, очень важно, чтобы конечный пользователь хорошо подготовленных в получении точных и воспроизводимых изображений и способен интерпретировать деятельность диафрагмы последовательно. Кроме того, артефакты зеркальное отображение происходит, когда один анатомическое строение, такие как диафрагма, отображается в два раза на мониторе. Это считаютред артефакт распространение и приводит к отражению быть неправильно расположенной внутри ультразвук операционной системы 12,13. Например, ультразвуковые преобразователи могут производить несколько лучей внеосевых которые могут отражаться от анатомическую структуру, которая не в пути главного луча 12,14. Кроме того, из-за преломления, луч может не всегда по прямой линии от отражателя. Поскольку ультразвук может только обрабатывать сигнал, который возвращается к датчику и не может определить сроки преломления, монитор может скорее продемонстрировать такую же анатомическое строение дважды на разных расстояниях и, таким образом проявляют зеркального отображения артефакт.
Дополнительным артефакт распространения, что встречается это реверберации. Этот артефакт отображает равномерно параллельные линии, которые обычно расположены перпендикулярно к ультразвуковому лучу (рис. 2а) 15. Этот тип артефакта может нарушить истинное полевидение и маски конкретные анатомические структуры интересов. Таким образом, следует проявлять осторожность при анализе данных. Подмножество реверберации артефакта комета хвост или B-линии. Это тип реверберации артефакт, который формирует вертикальную траекторию плотных эхо, простирающийся от диафрагмы к краю экрана ультразвукового 16 (как показано на фиг.2В). Эти артефакты получают путем многократных отражений, которые происходят между или внутри структуры и преобразователем 13, который может быть минимизировано ужение преобразователь, чтобы избежать контакта с перпендикулярную зеркальных объектов 17. Несмотря на эти ограничения, диагностики, получения изображений УЗИ позволяет на безопасной, конфиденциальной и быстрый анализ функции диафрагмы в мышиной модели, которые потенциально могут оценить грызунов дисфункции диафрагмы и помочь разработать новые доклинические терапии для респираторных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке грантами НУ Общий фонд G110 и научно-исследовательского мастерства фонда биомедицинских исследований и ОГУ-HRS фонда 013 000. Авторы хотели бы поблагодарить Лорен Чен за ее помощь в подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Franchi, F., et al. Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension. Hypertension Research: Official Journal of the Japanese Society of Hypertension. , (2013).
- Coatney, R. W. Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research. ILAR Journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 42, 233-247 (2001).
- Morenz, K., et al. Detection of air trapping in chronic obstructive pulmonary disease by low frequency ultrasound. BMC Pulmonary Medicine. 12, 8 (2012).
- Gilliam, L. A., Moylan, J. S., Ann Callahan, L., Sumandea, M. P., Reid, M. B. Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy. Muscle & Nerve. 43, 94-102 (2011).
- Ferreira, L. F., Campbell, K. S., Reid, M. B. Effectiveness of sulfur-containing antioxidants in delaying skeletal muscle fatigue. Medicine and Science in Sports and Exercise. 43, 1025-1031 (2011).
- Zuo, L., Clanton, T. L. Reactive oxygen species formation in the transition to hypoxia in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 289, 207-216 (2005).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J. Vis. Exp. , (2010).
- Hedrick, W. R., Hykes, D. L., Starchman, D. E. Ultrasound Physics and Instrumentation. , 4th edn, Elsevier Mosby. 445 (2005).
- von Sarnowski, B., Khaw, A. V., Kessler, C., Schminke, U. Evaluation of a microconvex array transducer for the ultrasonographic examination of the intrathoracic segments of the supraaortic arteries. Journal of Neuroimaging: Official Journal of the American Society of Neuroimaging. 20, 246-250 (2010).
- Stocksley, M. Abdominal Ultrasound. , Cambridge University Press. 7-8 (2001).
- Kremkau, F. W., Taylor, K. J. Artifacts in ultrasound imaging. Journal of Ultrasound in Medicine: Official Journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 5, 227-237 (1986).
- Kremkau, F. W. Diagnostic Ultrasound: Principles and Instruments. Saunders Elsevier. , 7th edn, 521 (2006).
- Laing, F. C., Kurtz, A. B. The importance of ultrasonic side-lobe artifacts. Radiology. 145, 763-768 (1982).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. Journal of Emergencies, Trauma, and Shock. 4, 501-503 (2011).
- Gargani, L. Lung ultrasound: a new tool for the cardiologist. Cardiovascular Ultrasound. 9, 6 (2011).
- Sanders, R. C., Winter, T. Clinical Sonography A Practical Guide. , 4th edn, Lippincott Williams & Wilkins. 632 (2007).
