Summary
De imágenes de ultrasonido de diagnóstico ha demostrado ser eficaz en el diagnóstico de diversas enfermedades respiratorias en sujetos humanos y animales. Demostramos un protocolo integral de ultrasonido utilizado por el laboratorio del Dr. Zuo para analizar la cinética de diafragma específicamente en modelos de ratón. Esta es también una técnica de investigación no invasiva que puede proporcionar información cuantitativa sobre la función de los músculos respiratorios ratón.
Abstract
Análisis de funciones de los músculos esqueléticos respiratorios de roedores, en particular el diafragma, se realiza comúnmente mediante el aislamiento de tiras de músculo usando los procedimientos quirúrgicos invasivos. Aunque este es un método eficaz de evaluar la actividad in vitro de diafragma, que consiste en una cirugía no supervivencia. La aplicación de imágenes por ultrasonido no invasiva como un procedimiento in vivo es beneficioso, ya que no sólo reduce el número de animales sacrificados, pero también es adecuado para el seguimiento de la progresión de la enfermedad en ratones vivos. Por lo tanto, nuestro método de formación de imágenes de ultrasonido puede probablemente ayudará en el desarrollo de nuevas terapias que alivian lesión muscular inducida por diversas enfermedades respiratorias. En particular, en los diagnósticos clínicos de las enfermedades pulmonares obstructivas, imágenes de ultrasonido tiene el potencial de ser utilizado en conjunción con otras pruebas estándar para detectar la aparición temprana de la fatiga del músculo del diafragma. En el protocolo actual, se describe la forma de evaluar con precisión contracti diafragmadad en un modelo de ratón utilizando una técnica de imágenes de ultrasonido de diagnóstico.
Introduction
Recientemente, las técnicas de imagen de ultrasonido de diagnóstico se han aplicado a modelos de ratón de la hipertensión renovascular y 1,2 del cáncer de páncreas. Sin embargo, estas técnicas no han sido ampliamente utilizados en el ensayo de la función de los músculos respiratorios de roedores. Por lo tanto, hemos desarrollado un método de imagen de ultrasonido de diagnóstico como una herramienta valiosa para las evaluaciones longitudinales en vivo de la movilidad del diafragma en ratones.
Hay varias ventajas de la ecografía diagnóstica. Por ejemplo, no es invasiva, segura, portátil y permite mediciones en tiempo real a un costo relativamente bajo 3. En particular, algunos dispositivos de ultrasonido de baja frecuencia fueron capaces de detectar el atrapamiento de aire, una característica clínica de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) leve a severa limitación del flujo aéreo 4. Por lo tanto, de formación de imágenes de ultrasonidos de diagnóstico puede servir como un método de cribado fácilmente accesible y reproducible para la monitorización en tiempo real de trastornos respiratorios.
Las técnicas de imagen de ultrasonido de diagnóstico se aplican con frecuencia a los animales más grandes o los sujetos humanos. Sin embargo, ha habido un número limitado de estudios de imágenes de ultrasonido en modelos de ratones, lo cual es probable que se deba a los desafíos de la realización de la ecografía en temas de pequeña escala. El protocolo actual describe un procedimiento novedoso para la medición de la función de diafragma en el ratón. Además, aunque se han realizado varios estudios con roedores sobre la función de diafragma, la mayor parte de los resultados se generaron mediante el aislamiento de tiras de músculo directamente desde el animal sacrificado 5-7. En contraste, el uso de un método de formación de imágenes de ultrasonidos de diagnóstico in vivo para analizar la actividad de diafragma disminuiría el número de animales sacrificados para la experimentación. Por otra parte, los tratamientos a largo plazo centradas en ampliar la contractilidad diafragmática pueden evaluar con precisión a través de ultrasonido en modelos de roedores sin sacrificar animales.
ntent "> En nuestro laboratorio, hemos desarrollado un método eficaz para la visualización y análisis de la actividad del diafragma de ratón utilizando una máquina de ultrasonido, que ayuda a la comprensión de la función del diafragma in vivo, evita métodos invasivos a los animales, y ayuda en el desarrollo de la terapéutica tratamientos para la disfunción respiratoria.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fueron aprobados y completados de conformidad y el cumplimiento del Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad Estatal de Ohio (IACUC) los reglamentos y directrices Todos los procedimientos que involucran sujetos animales.
1. Ratón Anestesia
- Establecer una mesa procedimiento de limpieza con una almohadilla isotérmica climatizada envuelta en una toalla quirúrgica. La almohadilla de calefacción debe mantenerse entre 30 ° C y 34 ° C para estabilizar la temperatura del núcleo del animal al tiempo que reduce el estrés potencial para el animal.
- Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia con los siguientes parámetros: tasa de flujo de oxígeno ajustado a 1.5 L / min y vaporizador de isoflurano se establece en el 3,5%. Sedación completa debe tener lugar dentro de 1-2 min. Si una cámara de inducción no está disponible, una campana de vidrio puede ser utilizado con una malla de alambre situada en la parte inferior para evitar el contacto directo con el animal de isoflurano.
- Quitarse de inmediato el ratón desde la cámara de inducción, una vez queestá completamente anestesiado (alcanza cuando el ratón pierde la función motora voluntaria). Aplique una ojiva al animal para el mantenimiento de la anestesia. La tasa de flujo de oxígeno se debe reducir a aproximadamente 0,5 l / min y el vaporizador de isoflurano se debe establecer dentro de la gama de 1,5 a 2,5%.
- Aplique una pequeña cantidad de pomada oftálmica directamente a las córneas para reducir la sequedad del ojo 8. Además, durante la anestesia, el ratón debe mantener una ausencia del reflejo de retirada pedal, las membranas mucosas deben permanecer un color rosa, y la respiración deben aparecer constante.
2. Preparación para Ultrasonido Diagnóstico Procedimiento Imaging
- Sujetar cada pata del ratón en la mesa de procedimientos climatizada con adhesivo removible, tal como cinta quirúrgica.
- Usando una máquina de afeitar eléctrica, quitar el pelo en la superficie ventral del cuerpo entre el abdomen y la forma media hasta la cavidad torácica. Aplicar crema de depilación a una mayor remover el resto del cabello que no se corta por la maquinilla de afeitar. Limpie la crema con una gasa húmeda después de 2-3 min.
- Retire el exceso de vello utilizando una gasa humedecida en agua y limpiar la región de afeitado con alcohol al 70% o equivalente antiséptico. La sonda de ultrasonido se aplicará a esta zona para visualizar la función del diafragma. Un analgésico tópico puede ser proporcionada a los animales que experimentan irritación menor de la piel debido a la eliminación del vello.
3. Diagnostic Ultrasound Imaging Protocol
- Encienda el dispositivo de ultrasonido y ajustar la potencia de salida (si es necesario) en el aparato por el porcentaje para obtener una resolución óptima.
- Ajuste la máquina de ultrasonido a las preguntas B (brillo) de modo, M (de movimiento)-modo, o tanto antes de formación de imágenes, que permite la visualización adecuada de la contracción del diafragma de ratón.
- Aplique una pequeña cantidad de gel de ultrasonido en el abdomen superior del ratón y masajear el gel hacia la cavidad torácica.
- Coloca los ultratransductor de sonido en esta área y el ángulo hacia arriba en dirección al corazón. Ajustar la sonda hasta que se consigue una resolución de optimizada de la imagen. Nota: para este protocolo, una matriz de micro-convexa o transductor lineal de fases es una sonda ideal para su uso debido al tamaño reducido y una excelente resolución axial 9; la frecuencia necesita ser ajustado a través de la anchura de banda y para estos experimentos se puede utilizar una gama de 6,5 a 12 MHz.
- Pulse el botón de congelación para guardar temporalmente las imágenes de diafragma y ver las contracciones seleccionados.
- Guardar la grabación como un bucle de cine, que permite mediciones posteriores de excursión diafragmática, así como la tasa de respiración. Nota: Los cuadros de imágenes se pueden guardar en la memoria del ordenador o en un disco duro externo para el análisis futuro 9.
- Precisamente medir la profundidad del movimiento del diafragma de la relajación a la contracción usando los calibradores electrónicos que son parte del software de ultrasonido.
- Convertir elarchivo de bucle de cine en un archivo MPEG y determinar la tasa de respiración contando el número de contracciones del diafragma durante el período de registro. Por otra parte, el número de contracciones por minuto (frecuencia respiratoria) puede contarse de la imagen en modo M.
4. Publicar Anestesia Recuperación de Animales
- El ratón debe recuperarse completamente de la anestesia en 1 hora. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Una imagen de ultrasonidos típico de un diafragma de ratón se muestra en la Figura 1A. El desplazamiento vertical máxima de diafragma de ratón fue grabado. Esta distancia se calcula con precisión la medición de la profundidad de movimiento del diafragma de la relajación a la contracción usando los calibradores electrónicos que son parte del software de ultrasonido. Tabla 1 muestra estas mediciones de distancia de las contracciones del diafragma de tres ratones diferentes. Después de convertir el archivo de bucle de cine en un archivo MPEG, la tasa de respiración se determinó contando el número de contracciones diafragmáticas durante un segundo período de registro de seis. Este análisis se puede realizar usando en modo B. Alternativamente, en modo M proporciona una imagen visualizada de diafragma movimiento vertical así como la tasa de respiración, como se muestra en la Figura 1B. Estos resultados demuestran que este método es efectivo en la observación con precisión las contracciones del diafragma de ratón. Además, por recordi ng función del diafragma, este protocolo también permite evaluar dos parámetros importantes, como la excursión del diafragma y la velocidad de la respiración. Este método de imagen es útil para la comparación directa entre el músculo diafragma sano y enfermo. Sin embargo, la Figura 2 muestra los posibles artefactos de imágenes que se pueden producir cuando se realiza la ecografía de diagnóstico.
Figura 1. A. Una imagen de ultrasonidos representativa de un músculo del diafragma de ratón (modo B). Las líneas continuas y discontinuas representan el diafragma durante los estados contraído y relajado, respectivamente. B. Una imagen de ultrasonido representante de un diafragma de ratón contratante (modo M).pg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Una imagen de ultrasonido del ratón músculo del diafragma con la presencia de posibles reverberación (A) y el cometa-cola artefactos (B) (indicadas por las flechas) Figura 2.. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 1 ª medición (mm) | 2 ª medición(Mm) | 3 ª medición (mm) | Promedio (mm) ± SD | |
| Ratón 1 | 0.96 | 0.92 | 1.06 | 0,980 ± 0,072 |
| Mouse 2 | 0.93 | 0.99 | 1.01 | 0,977 ± 0,042 |
| Ratón 3 | 0.91 | 0.93 | 0.89 | 0,910 ± 0,020 |
Mediciones de la Tabla 1. Distancia de ratón movimiento del diafragma. AveragES se calcularon a partir de tres valores registrados separadas para cada ratón individual. La desviación estándar se define como SD. Nota, la varianza animal no tiene efecto significativo en la medición de las contracciones del diafragma (P = 0,1224).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El protocolo experimental actual desarrolla técnicas de imagen de ultrasonido de diagnóstico específicos para la actividad del diafragma en un modelo de ratón a través de una, en el enfoque no invasivo vivo. Los ajustes del equipo de anestesia son valores aproximados, que podrán ajustarse ligeramente para cada animal ya que los ratones individuo puede responder de manera diferente a la anestesia. Para evitar que la administración de la anestesia inadecuada, es importante controlar regularmente los signos vitales del ratón, incluyendo la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y la temperatura corporal. Por otra parte, el pelo debe ser removido antes de la ecografía porque el pelo sin afeitar puede empañar la imagen y evitar la visualización precisa de las contracciones del diafragma.
Se utilizó la ecografía en modo B para proporcionar una de dos dimensiones (2D) Imagen de la sección transversal del diafragma del ratón y lo usamos en modo M para controlar la cinética de movimiento del diafragma. Es importante utilizar un transductor de matriz de micro-convexa para imágenes 2D porque Proproporciona una mejor resolución axial de las estructuras anatómicas superficialmente ubicados en comparación con tradicionales transductores de matriz lineal 10. También es importante señalar que enfoque electrónico de la imagen se degrada como la longitud focal se extiende 9. Además, una cantidad adecuada de gel de ultrasonido se debe aplicar al abdomen del ratón para la adquisición de imágenes distintas. El gel limita la posibilidad de bolsas de aire entre la piel y el transductor para producir una imagen de alta resolución 11.
Aunque la aplicación de imágenes de ultrasonido de diagnóstico es prometedor, existen limitaciones para el uso de esta técnica como herramienta de investigación. Por ejemplo, es muy importante que el usuario final está bien entrenado en la obtención de imágenes precisas y reproducibles y es capaz de interpretar la actividad del diafragma consistente. Además, los artefactos de imagen espejo se producen cuando una estructura anatómica, tal como el diafragma, se muestra dos veces en el monitor. Este es considerared un artefacto de propagación y los resultados en la reflexión está incorrectamente situado dentro de la 12,13 sistema operativo de ultrasonido. Por ejemplo, los transductores de ultrasonido pueden producir varios haces fuera del eje que puede reflejarse en una estructura anatómica que no está en la ruta del 12,14 haz principal. Por otra parte, debido a la refracción, el haz puede no siempre viajar en línea recta desde el reflector. Dado que el ultrasonido sólo puede procesar la señal que se devuelve al transductor y no puede determinar el momento de la refracción, el monitor puede mostrar probable la misma estructura anatómica dos veces a diferentes distancias y por lo tanto presentan un artefacto de imagen de espejo.
Un artefacto de propagación adicional que se encuentra es la reverberación. Este artefacto muestra uniformemente espaciados líneas paralelas que generalmente se colocan perpendicularmente al haz de ultrasonidos (Figura 2A) 15. Este tipo de artefacto puede interrumpir un verdadero campo de lavisión y la máscara de estructuras anatómicas específicas de interés. Por lo tanto, se debe tener cuidado al analizar los datos. Un subconjunto de artefactos de reverberación es el cometa-cola o B-líneas. Estos son un tipo de artefacto de reverberación que se forma una trayectoria vertical de ecos densos, que se extiende desde el diafragma hasta el borde de la pantalla del ultrasonido 16 (como se ilustra en la Figura 2B). Estos artefactos se producen por múltiples reflexiones que se producen entre o dentro de una estructura y el transductor 13, que puede ser minimizado inclinando el transductor para evitar un contacto perpendicular con el especular objetos 17. A pesar de estas limitaciones, la ecografía de diagnóstico permite un análisis seguro, sensible y rápida de la función diafragmática en un modelo de ratón, lo que potencialmente puede evaluar roedor disfunción del diafragma y ayudar a desarrollar nuevas terapias pre-clínicos para trastornos respiratorios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por becas de Fondo General y el Fondo de OU G110 Investigación de Excelencia de la Investigación Biomédica y OSU-HRS Fondo 013.000. Los autores desean agradecer a Lauren Chen por su ayuda en la preparación de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Franchi, F., et al. Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension. Hypertension Research: Official Journal of the Japanese Society of Hypertension. , (2013).
- Coatney, R. W. Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research. ILAR Journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 42, 233-247 (2001).
- Morenz, K., et al. Detection of air trapping in chronic obstructive pulmonary disease by low frequency ultrasound. BMC Pulmonary Medicine. 12, 8 (2012).
- Gilliam, L. A., Moylan, J. S., Ann Callahan, L., Sumandea, M. P., Reid, M. B. Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy. Muscle & Nerve. 43, 94-102 (2011).
- Ferreira, L. F., Campbell, K. S., Reid, M. B. Effectiveness of sulfur-containing antioxidants in delaying skeletal muscle fatigue. Medicine and Science in Sports and Exercise. 43, 1025-1031 (2011).
- Zuo, L., Clanton, T. L. Reactive oxygen species formation in the transition to hypoxia in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 289, 207-216 (2005).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J. Vis. Exp. , (2010).
- Hedrick, W. R., Hykes, D. L., Starchman, D. E. Ultrasound Physics and Instrumentation. , 4th edn, Elsevier Mosby. 445 (2005).
- von Sarnowski, B., Khaw, A. V., Kessler, C., Schminke, U. Evaluation of a microconvex array transducer for the ultrasonographic examination of the intrathoracic segments of the supraaortic arteries. Journal of Neuroimaging: Official Journal of the American Society of Neuroimaging. 20, 246-250 (2010).
- Stocksley, M. Abdominal Ultrasound. , Cambridge University Press. 7-8 (2001).
- Kremkau, F. W., Taylor, K. J. Artifacts in ultrasound imaging. Journal of Ultrasound in Medicine: Official Journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 5, 227-237 (1986).
- Kremkau, F. W. Diagnostic Ultrasound: Principles and Instruments. Saunders Elsevier. , 7th edn, 521 (2006).
- Laing, F. C., Kurtz, A. B. The importance of ultrasonic side-lobe artifacts. Radiology. 145, 763-768 (1982).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. Journal of Emergencies, Trauma, and Shock. 4, 501-503 (2011).
- Gargani, L. Lung ultrasound: a new tool for the cardiologist. Cardiovascular Ultrasound. 9, 6 (2011).
- Sanders, R. C., Winter, T. Clinical Sonography A Practical Guide. , 4th edn, Lippincott Williams & Wilkins. 632 (2007).
