Summary
표적 단백질 분해는 세포 기능의 주요 조절기구를 나타낸다. 그런 다음 26S 프로 테아 좀에 대해 같은 분자 "태그"봉사하는 표적 단백질에 polyubiquitin 체인을 부착 보존 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로를 통해 발생합니다. 여기, 우리는 단백질의 프로 테오 저하에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 세포가없는 분석을 설명합니다.
Abstract
단백질 분해에 대한 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로는 거의 모든 진핵 생물의 세포 기능의 다양한 스펙트럼의 규제를위한 가장 중요한 메커니즘 중 하나로 떠오르고있다. 구체적으로, 식물에서, 프로 테아 좀의 ubiquitin/26S 시스템 (UPS)의 단백질 분해를 조절하고 면역 반응, 개발 및 프로그래밍 된 세포 사멸을 포함한 공정의 넓은 범위의 발전에 크게 기여한다. 또한, 증가하는 증거는 아그로 박테 리움 등 다양한 식물 병원균, 식물 병원균 상호 작용에있는 UPS의 중요성을 강조하고, 효율적인 감염 호스트 UPS를 이용하는 것이 좋습니다.
UPS의 기질 특이성은 E1과 협력 작용 및 E2가 그들에게 유비퀴틴 분자 체인을 부착하여 열화로 향하는 특정 단백질 분자를 인식하고 표시하는 리가 제 E3 유비퀴틴 리가 제에 의해 달성된다. E3의 리가 제의 하나의 클래스가 SCF입니다 (Skp1 / C특히 UPS 기판을 인식하고 자사의 F-박스 단백질 구성 요소를 통해 유비퀴틴을 위해 그 (것)들을 대상으로 율린 / F 상자 단백질) 복잡한. 그 생물학적 과정에서 UPS의 잠재적 인 역할을 조사하기 위해, UPS 매개 단백질 분해에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 분석을 고안하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 식물 세포가없는 시스템을 사용하여 하나의 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 F-박스 단백질 기판의 상호 작용에 특별한 중점을두고, 다양한 세포 과정의 조절 단백질 분해의 역할의 연구에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
ubiquitin/26S의 프로 테아 좀 경로는 다른 사람의 사이에서 전사 조절, 세포주기의 진행과 신호 전달 수용체 하향 조절 또는 엔도 시토 시스, 1-4을 처리하는 등 다양한 생물학적 반응의 제어를위한 광범위한 메커니즘으로 부상하고있다. 이 경로에서, 목적 단백질은 제 유비퀴틴 활성화 효소 E1에 thiolester 결합을 통해 부착하고 유비퀴틴 접합 효소 E2의 시스테인 아미노산 잔기에 옭되는 잔기를 유비퀴틴로 태그되며 마지막으로, E2는 유비퀴틴 리가 제 E3와 상호 작용 , 단백질 기질의 polyubiquitination 결과. 궁극적으로, polyubiquitinated 단백질은 26S 프로 테아 좀에 의해 인식 저하된다. 이 메커니즘에서, E3 효소는 기질을 지정하고 ubiquitin/26S의 프로 테아 좀 시스템 (UPS)의 주요 구성 요소를 규정하는 역할을한다. E3 리가 제의 예 RING 도메인 리가 제로서, 또는 multisubunit의 SCF (S의 일부로서 역할을 할 수 독립적이러한 F-상자 도메인 리가 제와 같은 kp1/Cullin/F-box 단백질) 복잡한. SCF-매개 프로 테오 분해 경로는 전사, 세포주기, 신호 전달 5-10 많은 다른 주요 세포 기능의 조절에 관여하고 있습니다.
세포 과정의 조절에 이러한 중요한 역할 외에, UPS는 많은 식물 병원균 상호 작용에 중앙 무대 걸립니다. 예를 들어, 증거가 증가하고 아그로 박테 리움 튜메 파시 엔스 등 여러 가지 식물 병원균, 감염 과정 (11)를 용이하게하기위한 호스트 UPS에 의존하는 것이 좋습니다. 아그로 박테 리움은 자연의 호스트를 나타내는 식물에 종양 성장을 이끌어, 또한 인간의 세포 (12, 13)에 곰팡이 1,2에서, 다른 진핵 생물의 넓은 범위를 변환 할 수 있습니다. 그 감염시, 아그로 박테 리움은 숙주 세포 12-13으로 DNA 요소 (T-DNA) 및 여러 독성 (비르) 단백질을 보냅니다. 이러한 단백질 중 하나는 VirF, 발견 된 첫 번째 F-박스 단백질원핵 유전체 (14)에 의해 부호화된다. SCF 유비퀴틴 리가 아제 단지, VirF, 그 기능 호스트 상동 VBF (15)의 한 부분으로, 아마도 VirE2, 그 부속 세균 및 호스트 단백질에서 침입하는 세균의 T-DNA의 uncoating을 용이하게 UPS 매개 단백질 분해를 통해 아그로 박테 리움 감염을 촉진 및 VIP1 각각 16, 17. 흥미롭게도, VirF 등 많은 F-박스 단백질은, 때문에 autoubiquitination 활동 18, 19 또는 F-박스 단백질이 기판 20-23 역할을 할 수있는 다른 E3의 리가 제에 의해 매개되는 자신의 단백질 분해, 본질적으로 불안정하다.
F-박스 단백질, 다른 유비퀴틴 리가 제, 및 / 또는 기판의 생화학 활동을 연구 할 때, 프로 테오 저하위한 간단하고 신뢰성있는 분석을 사용하는 것이 매우 유용 할 것이다. 여기에서 우리는 세포의 단백질 안정성 분석을위한 하나의 프로토콜을 설명없는 시스템입니다. 이 분석에서, UPS 기판의 안정성은 무 세포계에서 이러한 F-박스 단백질로서 프로 테오 열화 통로의 필수 성분 중 하나의 존재 또는 부재 하에서 분석된다. 일반적으로, 우리는 이러한 조직에서 무 세포 추출물을 준비하고 웨스턴 블로 팅에 의해 관심의 단백질 (들)의 양을 모니터링, 식물 조직에서 테스트 된 단백질 (들)을 표현한다. 단백질 분해의 UPS 의존 메커니즘은 특정 프로 테오 좀 억제제 및 / 또는 SCF 성분 Cullin의 우성 음성 형태의 동시 발현을 사용의 포함에 의해 증명된다. 우리 VBF 15 F-박스 단백질에 의해 아라비돕시스 VIP1 17 단백질의 프로 테오 저하하여이 분석을 예시하는 반면, 그것은 임의의 다른 프로 테오 기판의 안정성을 조사하기 위하여 사용될 수있다.
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Protocol
1. 단백질 발현
- 발현 시스템의 선택
시스템, 즉, 벡터 및 특정 모델 생물 / 세포에 대한 관심의 단백질의 발현에 가장 적합한 벡터 전달 방법을 선택합니다. 우리의 분석에 가장 세포의 많은 수의 일시적 변화에 의해 달성된다 쉽게 검출 가능한 양의 시험 단백질의 발현을 필요로합니다. 식물에서, 예를 들어, 이는 유용한 전달 시스템과 같은 발현 벡터 및 아그로 이진 플라스미드를 사용하여 달성된다. - 바이너리 발현 벡터의 구축
에피토프 태그에 단독으로 또는 번역 융합 하나를 발현 벡터에 관심의 단백질 (들)의 코딩 서열 (들)을 복제합니다. 사용은 선택 발현 시스템 및 유전자 복제에 대한 표준 분자 생물학 절차에 적합한 벡터. 아그로 박테 리움 매개 유전자 전달을 위해, standa를 사용하여도, 이진 벡터를 고용하고 그들을 소개식물 조직의 후속 접종 등 EHA105으로 아그로 박테 리움 균주로 RD 프로토콜. - 식물 종의 선택
관심의 단백질 (들)로 표현 될 수있는 식물 종을 선택합니다. 아그로 박테 리움 매개 유전자 변형의 영향을 모든 식물 종은 사용할 수 있지만, 그주의, 선택의 우리의 식물 종은 쉽게 아그로 박테 리움에 매우 취약, 성장 된 담배 benthamiana이며, 쉽게 접종 큰 잎을 가지고 있습니다. - 식물 성장
긴 하루의 환경 통제 된 조건 (예를 들면, 성장 챔버) (130) (즉, 16 시간에서 냄비 (20cm가 X 20cm X 20cm)의 프로 믹스 BX와 함께 냄비에 4 주에서 6 주 동안 수행되는 하나의 식물을 성장 23 ° C에서 -150 μE m-2 S-1 등, 20 ° C에서 8 시간의 어두운)와 40-65% 상대 습도.
때때로 제조업체의 지침에 따라 상용 제품과 1.5.2 비료. 식물이 성장하면, 선택아그로 박테 리움 접종 50 X 70mm mm 또는 더 큰 크기 (이 길이 측정은 잎자루를 포함하지 않는다)를 남긴다. - 아그로 박테 리움 접종
/ 적절한 항생제 (예를 들어, 100 mg의 보충 YEP 배지에서 28 ° C (1 % 펩톤 1 % 효모 추출물, 0.5 %의 NaCl)에서 하룻밤 단계 1.3에서 테스트 단백질 (들)을 표현하는 이진 구조를 숨겨 아그로 박테 리움 균주를 성장 L 스트렙토 마이신과 pPZP-RSC2 기반 벡터 24 ~ 25) 10 ㎎ / L의 리팜피신.
[10 mM의 MgCl2를 2, 10 MM의 메스 (산도 5.6), 100 μM 아세토 시린 곤] 침투 버퍼 = 0.5 (600) OD, 실온에서 2 시간 동안 배양 재현 탁 1.6.2 원심 분리기 세포. 1 ML의 바늘없는 주사기를 사용하여 잎의 배축면에 문화를 침투, 공장에 연결되어있는 동안 잎이, 현장에서 접종 있습니다.
1.6.3 침투 한 후, 16 시간 130-150 &의 빛 정권 하에서 72 시간 동안 식물을 성장# 181;에서 E m-2 S-1 등 23 ° 수확하기 전에 20 ° C에서 C / 8 시간의 어둠. - 프로 테오 좀 억제제의 적용
테스트 단백질 (들)은 프로 테오 경로를 통해 분해되는 개념을 지원하기 위해, 감소 또는 저하를 차단해야하는 특정 프로 테오 좀 억제제 MG132을 사용하여 28 ~ 29을 lactacystin. 네 시간 (2.1 단계 참조) 수확하기 전에, 10 μM MG132 (EMD 밀리 포어) 또는 10 μM의 lactacystin (시그마 - 알드리치) 또는과 아그로 박테 리움 접종 잎의 영역을 침투 각각의 용매, 즉, 0.1 % DMSO와 잎을 모의 치료 또는 증류수.
2. 무 세포 추출물의 제조
- 잎 수확
잎의 접종 장소, 일반적으로 CA를 수확. 200-400 신선한 무게 ㎎, 액체 질소의 미세 분말로 그들을 갈기. 또한, 모든 비드 비터 (예를 들어, Biospec) 또는 치과 된 amalgamator (예를 들어, TPC 고급을 사용하여 조직을 비드 이길 직접 분해 버퍼 기술) () 2.2 단계를 참조하십시오. - 단백질 추출
분해 버퍼 500 μL에 지상 조직을 배치하여 총 단백질 추출물을 준비 [50mM의 트리스 - HCL (산도 7.5), 100 mM의 NaCl을, 10 mM의 MgCl2를 2, 5 mM의 DTT, 5 MM의 아데노신 5'-인산, 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 - 알드리치)]. 프로테아제 억제제 칵테일은 주로 세린, 시스테인, 아스파라긴산, 그리고 메탈로 영향을 미치는 26S 프로 테아을 방해하지 않습니다. 5 분 12,000 XG에서 두 개의 연속 centrifugations하여 추출물을 명확히. - 단백질 분해 반응
튜브의 미세 시간의 증가 된 기간 동안 실온에서이를 배양, 추출, 보통 20 μL 같은 부피를 전송합니다. 일반적으로, 샘플 시간 제로 및 5, 10, 15, 20, 그리고 30 분 시간 지점. SDS 젤 샘플 버퍼에 끓여 반응을 중지하고 서부 블롯을 분석 할 수 있습니다.
- 겔 전기 영동
3.1.1 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동하여 단백질 시료를 해결하고 표준 프로토콜 30에 따라 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 해결 electrotransfer.
3.1.2 브래드 포드 방법 (바이오 래드)를 사용하여 단백질 농도를 결정하고, 레인 당 총 단백질의 50 ~ 80 μg을로드합니다. 모든 샘플이 동일하게로드되어 있는지 확인합니다. 컨트롤을로드를 들어, 약 50 kDa의 상대 전기 이동성과 주요 밴드로 마이그레이션 추정 RuBisCo 대형 체인 등 유비쿼터스 단백질 종의 농도를 비교, 그들은 쿠마시 블루 염색 젤 또는 개양귀비 빛의 S-또는 감지 할 수 있습니다 형광 SYPRO 니트로 셀룰로오스 막 루비 스테인드. - 블로킹
실온에서 1 시간 동안 TBST에서 5 % 탈지 우유 (10 mM 트리스 - 염산, 140 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH 7.4의)으로 멤브레인을 차단. 차 항체
제조업체에서 권장하는 농도로 TBST 1 % 탈지 우유에 기본 안티 - 항원 항체를 희석하고 교반과 함께 4 º C에서 실온에서 1 시간 동안이나 밤새 차단 막과 부화. - 세정
막 한 번 15 분 동안 20 ㎖의 TBST에 린스 린스, 두 번 부드러운 교반과 함께 실온에서 5 분. - 이차 항체
제조업체에서 권장하는 TBST 1 % 탈지 우유에 말 무 퍼 옥시 데이즈 (HRP)가 결합 이차 항체 (예를 들어, 안티 - 토끼 IgG의)를 희석하고 부드러운 교반과 함께 실온에서 1 시간 동안 막에 품어. - 검출
단계 3.4에 설명 된대로 다시 멤브레인을 씻어. TBST에서 최종 헹굼 후, 가장 일반적으로 ECL 키트를 사용하여, HRP를 화학 발광 기질과 관심 단백질을 가시화.
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Representative Results
Zaltsman 등. 17에서 적응 그림 1은 세포가없는 시스템에서 프로 테오 저하의 검출을위한 대표적인 실험을 보여줍니다. 특히, 우리는 N.의 SCF VBF 경로를 통해 VBF F-박스 단백질에 의한 식물 방어 관련 단백질 VIP1의 불안정을 보여 benthamiana. 애기 VBF 및 HA-태그 VIP1 (HA-VIP1) 단백질을 일시적으로 동시 발현하고, 표현 잎의 추출물 내의 HA-VIP1 콘텐츠 단백질은 서양 블로 팅에 의해 분석 하였다. 이 분석은 VBF과 동시 발현 때 VIP1의 양이 상당한 수준으로 감소되었다는 것을 보여 주었다, 그러나 VBF의 동시 발현 (그림 1A)의 부재에 상대적으로 안정적으로 유지. VBF없이 VIP1 내용에 약간의 감소가 내생 담배 VBF 활동의 낮은 수준으로 인해이 발생할 수 있습니다. VBF로 VIP1의 불안정의 프로 테오 저하 메커니즘의 난에서 유추 된MG132 (그림 1A)에 의해 nhibition. 그림 1A의 결과를 정량화 MG132 (그림 1B)에 의해 차단 된 VBF에 의해 거의 완료 (≥ 90 ± 5 %) VIP1을 보여 주었다. MG132의 존재 VIP1의 약간 높은 수준을 참고는 대부분 내인성 VBF 활동 (17)의 억제에 의해 설명된다.
그림 1. VBF이 VIP1의 프로 테오의 분해를 촉진한다. HA-VIP1 단독으로 표현 또는 N.에 VBF과 동시 발현되었다 benthamiana 잎. 얻어진 단백질 추출물을 지시 된 시간 기간 동안 인큐베이션 및 항-HA 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석 하였다. 추정 RuBisCo 대형 체인은 로딩 컨트롤 (A)로서 사용 하였다. QuantifieD 웨스턴 블롯 신호는 배양 기간의 개시시 VBF의 부재하에 수득 된 신호의 백분율로 표시 하였다. 데이터는 지정된 표준 편차 (B) 세 독립적 인 실험의 평균 값을 나타냅니다. 이 수치는 Zaltsman 등. 17에서 적응했다
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Discussion
이 분석은 식물 조직에서 시험 단백질의 발현에 의존하고, 따라서, 잠재적 인 프로 테오 분해 과정은 분명히 생체 조직 내에서 이미 발생한다. 우리는 제로 샘플은 초기 기준점으로서의 시간만을 추출한 그러나 단백질 불안정화를 분석 실험. 따라서, 우리는 세포가없는 분석으로 정의합니다.
이 분석의 성공에 대한 한 가지 중요한 측면은 시험 단백질 (들)이 생성 될 것이다에서 발현 벡터의 올바른 선택이다. 테스트 단백질에 대한 특이 항체를 사용할 수 있습니다하지 않는 한, 그것은 에피토프 태그 웨스턴 블로 팅에 의해 검출해야한다. 태그 단백질은 아그로 박테 리움 이진 벡터에서 표현되어야한다. 이러한 많은 벡터가 26 사용할 수있는 반면, 우리는 pPZP-RCS2 이진 플라스미드로 발현 카세트의 1 단계를 삽입 할 수 있습니다 모듈 식 PSAT 플라스미드 시스템 (24)에서 파생 된 벡터를 사용하는 것이 좋습니다24 ~ 25. PSAT 시스템의 또 다른 장점은 수 있다는 것입니다 몇 프로 테오의 기판을 검정 또는 시험 기판의 인터랙 터들의 효과를 연구하기 위해 실험에 특히 유용하다 같은 벡터 25에서 여러 유전자의 발현, 아그로 박테 리움 VirD5의 예 동시 발현에 대한 프로 테오 저하 22 VirF 보호의 프로 테오 기판 VirF 결과와 상호 작용하는 단백질. 중요한 것은, 벡터의 확장 PSAT 시리즈는 이미 에피토프 27 태그에 대한 벡터를 포함한다. 에 관계없이 선택된 복제 전략, 관심의 에피토프 태그 단백질을 코딩하는 순서는 식물 조직의 후속 표현을위한 이진 벡터에 도입해야한다. 이 분석은 일시적인 표현을 사용하기 때문에 그들의 존재는 분석 효율에 해로운 것은 아니지만, 이진 벡터, 안정된 변환을위한 선택 마커를 포함 할 필요가 없습니다.
또한 여러 가지 단백질의 동시 발현이 가장 Multigene 사 발현 벡터를 사용하여 달성되지만, 별도의 이진 구조체를 운반 각각 두 개 또는 세 아그로 균주의 액체 배양의 동등한 양을 조합하여 또한 행해질 수있다.
또 다른 중요한 점은 많은 경우에, 프로 테오 저하 분석뿐만 아니라 프로 테오 기판뿐만 아니라, SCF 경로의 구성 요소의 발현을 수반한다는 것이다. 예를 들어, 실험의 목표는 F-박스 단백질이 인식하고 분해의 대상 특정 기판 있는지 여부를 테스트 할 수 있습니다. 이 경우,이 에피토프 태그 된 기판은 태그가 F-박스 단백질과 함께 공동 발현되어야한다.
데이터의 더 상세한 분석을 위해, 단백질 분해의 정도는 쉽게 웨스턴 신호의 상대 강도를 측정함으로써 정량화 될 수있는 U최신 ImageJ에 소프트웨어 (NIH) 31 노래. 이러한 정량화를 수행 할 때의 신호의 포화를 피하기 위해 웨스턴 말을 오버 개발하지 않는 것이 중요하다. 데이터 정량화는 모든 샘플이 적절한 단백질 밴드의 강도의 감소에 의해 검출되는 이번 분석에서 단백질 분해로서의 단백질 함량에 대하여 똑같이 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 상에 로딩되는 것을 요구한다. 이는 각 세포 추출액의 단백질 함량의 측정에 의해 각 차선의 동일한 로딩 (단계 3.1 참조)의 후속 검증함으로써 달성된다. 또한, 주어진 시간 코스 실험에서, 모든 샘플이 추출의 동일한 배치에서 파생되어야한다 동일한 하중을 보장하는 데 도움이됩니다.
여기에 설명 된 프로 테오 저하에 대한 세포가없는 분석은 실험적인 시스템으로 식물을 사용합니다. 그러나, 동일 실험 설계는 다른 생명체에 대해 사용될 수있다. 분석은 또한 푸르트에 의해 확장 될 수있다어 SCF 경로에 초점을 맞추고. 예를 들어, 단백질 분해의 SCF에 의존하는 메커니즘은 SCF 구성 요소 CULLIN1 (CUL1 DN)의 지배적 인 음성 양식을 사용하여 설명 할 수있다. 특히, 위치 1과 420 사이에 삭제 된 아미노산 잔기를 가진 애기 장대 CUL1의 돌연변이가 아니라 SCF (22)의 촉매 코어를 나타냅니다 RBX1와, SCF 복합체의 Skp1/ASK1 구성 요소와 상호 작용하는 것으로 나타났다. CUL1 DN의 동시 발현 다음 억제 또는 기판 저하의 감소는 SCF 경로의 참여를 나타냅니다.
우리의 분석은 그들의 자연 환경에서 식물 조직에서 발현 관심의 단백질을 사용합니다. 이 방법에 대한 하나의 대안은, 재조합 단백질을 정제 추출물 식물에 추가하고, 서양의 분석 (32)에 의해 자신의 저하를 수행하는 것입니다. 재조합 단백질이 항상 곁에 있지 않기 때문에 우리는 선택의 방법으로이 전술을 사용하지 않는 것이 좋습니다충실히 네이티브 생물학적 특성을 반영들; 란타의 발현이 가능하지 않을 경우, 재조합 단백질의 사용을 확실히 유용한 대안을 나타낸다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 책에 이르는 작품은 GA 번호 246550에서 말라가 대학과 유럽 연합 (EU) 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에 의해 cofinanced 마리 퀴리 COFUND 프로그램 "U-모바일"에서 자금 지원을 받았다. 실험실에서의 작업은 VC에 NIH, USDA / NIFA, NSF, 시인, 및 BSF에서 교부금에 의해 지원됩니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
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