Summary
Målrettet protein degradering representerer en viktig reguleringsmekanisme for cellefunksjon. Det skjer via en konservert Ubiquitin-proteasom, som festes polyubiquitin kjedene til målet protein som deretter tjene som molekylære "koder" for 26S proteasomet. Her beskrives en enkel og pålitelig cellefritt assay for proteasomal degradering av proteiner.
Abstract
Den ubiquitin-proteasom svei for proteinnedbrytning har dukket opp som en av de viktige mekanismer for regulering av et vidt spektrum av cellulære funksjoner i praktisk talt alle eukaryote organismer. Nærmere bestemt, i planter, er ubiquitin/26S proteasom system (UPS) regulerer proteinnedbrytning og bidrar vesentlig til utvikling av en rekke prosesser, inkludert immunrespons, utvikling og programmert celledød. Videre antyder at mange plantepatogener, for eksempel Agrobacterium, utnytte verts UPS for effektiv infeksjon, understreker viktigheten av UPS i plante-patogen interaksjoner økende bevis.
Underlaget spesifisitet av UPS oppnås ved E3 ubiquitin ligase som fungerer på konsert med E1 og E2 ligaser å gjenkjenne og merke bestemte proteinmolekyler bestemt for degradering ved å feste dem kjeder av ubiquitin molekyler. En klasse av de E3 ligaser i SCF (Skp1 / CUllin / F-box protein) kompleks, som spesifikt gjenkjenner UPS underlag og mål dem for ubiquitinering via sin F-box protein komponent. For å undersøke en mulig rolle for UPS i en biologisk prosess av interesse, er det viktig at man har en enkel og pålitelig test for UPS-mediert proteinnedbrytning. Her beskriver vi ett slikt assay ved hjelp av en plantecellefritt system. Denne analysen kan tilpasses for studier av rollene som regulerte protein nedbrytning i ulike cellulære prosesser, med et spesielt fokus på F-boks protein-substrat interaksjoner.
Introduction
Den ubiquitin/26S proteasom vei fremstår som en utbredt mekanisme for kontroll av ulike biologiske reaksjoner, inkludert transkripsjonsregulering, celle-syklus progresjon og signaltransduksjon, reseptor nedregulering eller endocytose, blant andre behandler 1-4. I denne veien, blir målproteinet tagget av ubiquitin rester som er først festet via en thiolester bindingen til ubiquitin-aktiverende enzym E1 og deretter translocated til et cystein aminosyrerest av ubiquitin-konjugering enzym E2, og endelig, vekselvirker med ubiquitin ligase E3 E2 , noe som resulterer i polyubiquitination av protein-substrat. Til syvende og sist, er de polyubiquitinated proteiner anerkjent og forringes av 26S proteasomet. I denne mekanismen, angir E3 enzymet substratet og fungerer som en nøkkel reguleringskomponent i ubiquitin/26S proteasom system (UPS). E3 ligaser kan opptre uavhengig av hverandre, slik som RING domain ligaser, eller som del av en multisubunit SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) komplekse, for eksempel F-boks domene ligaser. SCF-medierte proteasomal nedbrytningsmekanismer er involvert i regulering av transkripsjon, cellesyklus, signaltransduksjon 5-10 og mange andre store cellulære funksjoner.
Foruten disse kritiske roller i regulering av cellulære prosesser, tar UPS den sentrale scenen i mange plante-patogen interaksjoner. For eksempel, antyder økende bevis for at flere plante patogener, inkludert Agrobacterium tumefaciens, er avhengige av verts UPS for å lette infeksjonen prosessen 11. Agrobacterium utløser neoplastiske utvekster på planter, som hver representerer dens naturlige verter, og det kan også transformere en rekke andre eukaryoter, fra sopp 1,2 til menneskeceller 12,13. I løpet av sin infeksjon, Agrobacterium eksporterer et DNA-element (T-DNA) og flere virulens (Vir) proteiner i vertscellen 12-13. Et av disse proteiner er VirF, den første F-boks protein funnetå bli kodet av en prokaryotisk 14 genome. Som en del av SCF ubiquitin ligase kompleks, VirF, og dens funksjonelle verts homolog VBF 15, legge til rette for Agrobacterium-infeksjon via UPS-mediert proteinnedbrytning, som antagelig letter avkapsling av den invaderende bakterie-T-DNA fra tilhørende bakterie-og vert proteiner, VirE2 og VIP1, henholdsvis 16,17. Interessant nok mange F-boks proteiner, inkludert VirF, er egentlig ustabile på grunn av deres egen proteolyse, som blir mediert av autoubiquitination aktivitet 18,19 eller på annen E3 ligaser hvor F-boks proteiner kan tjene som substrater 20-23.
Ved å studere biokjemiske aktiviteter av F-boks proteiner, andre ubiquitin ligaser, og / eller deres underlag, ville det være svært nyttig å benytte en enkel og pålitelig test for proteasomal degradering. Her beskriver vi en slik protokoll for analyse av proteinstabilitet i en celleFritt system. I denne analyse, er stabiliteten til UPS substrat analyseres i nærvær eller fravær av en av de grunnleggende komponenter i proteasomal nedbrytningsveien, slik som en F-box protein, i et cellefritt system. Generelt kan vi uttrykke den testede protein (er) i plantemateriale, forberede cellefrie ekstrakter av disse vev og overvåke de mengder av protein (er) av interesse ved western blotting. UPS-avhengig mekanisme for proteindegradering er demonstrert ved inkludering av spesifikke proteasomal-inhibitorer og / eller ved hjelp av coexpression av dominant-negative form av en SCF-komponent, Cullin. Mens vi illustrere dette assay ved å bruke proteasomal nedbrytning av Arabidopsis VIP1 17 protein av F-protein VBF boksen 15, kan det bli anvendt for å undersøke stabiliteten av eventuelle andre proteasomal substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Protein uttrykk
- Valg av uttrykk system
Velg systemet, dvs. vektorer og vektor leveringsmåte, best egnet for ekspresjon av proteinet av interesse i den spesielle modellorganisme / celle. Legg merke til at vår analyse krever ekspresjon av de testede proteiner i lett detekterbar mengde, noe som best oppnås ved forbigående forandring av et stort antall celler. I planter, for eksempel, er dette best oppnås ved hjelp av binære plasmider som ekspresjonsvektorer og Agrobacterium som leveringssystem. - Bygging av binære ekspresjonsvektorene
Klon den kodende sekvensen (e) av protein (er) av interesse inn i en ekspresjonsvektor, enten alene eller i translasjons-fusjon til en epitop tag. Bruk vektorer egnet for det valgte ekspresjonssystem og standard molekylærbiologi prosedyrer for genkloning. For Agrobacterium-mediert genet levering, ansetter binære vektorer og introdusere dem, også ved hjelp av standard-protokoller, inn i en Agrobacterium påkjenning, slik som EHA105, for etterfølgende inokulering av plantevev. - Valg av plantearter
Velg de plantearter hvor protein (er) av interesse vil bli uttrykt. Legg merke til at mens noen plantearter som er mottakelige for Agrobacterium-mediert genetisk transformasjon kan benyttes, plante-arter av valget er Nicotiana benthamiana, som er lett dyrkes, svært utsatt for Agrobacterium, og har store blader som er lett inokulert. - Plantevekst
Grow ett anlegg for 4 til 6 uker i en pott med Pro-Mix BX i en pott (20 cm x 20 cm x 20 cm) i henhold til miljø kontrollerte forhold (for eksempel vekst kammer) av lang dag (dvs. 16 h av 130 -150 μE m-2-s-1-lys ved 23 ° C og 8 timers mørke ved 20 ° C), og 40-65% relativ fuktighet.
1.5.2 Gjødsle tidvis med kommersielt tilgjengelige produkter per produsentens instruksjoner. Når planten er dyrket, velgkommer ut med en størrelse på 50 mm x 70 mm eller større (disse lengdemålinger inkluderer ikke bladstilken) for Agrobacterium vaksinasjon. - Inokulering med Agrobacterium
Dyrk Agrobacterium belastning husing det binære konstrukt som uttrykker den testede protein (er) fra trinn 1.3 over natten ved 28 ° C i YEP-medium (1% pepton, 1% gjærekstrakt og 0,5% NaCl) supplert med egnede antibiotika (for eksempel 100 mg / L streptomycin og 10 mg / L rifampicin for pPZP-RSC2-baserte vektorer 24-25).
1.6.2 Sentrifuger cellene, resuspendert til OD 600 = 0,5 i infiltrasjons buffer [10 mM MgCl 2, 10 mM Mes (pH 5,6), 100 uM acetosyringone], og inkuber i 2 timer ved romtemperatur. Infiltrere kultur inn abaxial side av et blad ved hjelp av en en-ml nålløs sprøyte, merk at bladene inokulert in situ, mens er festet til anlegget.
1.6.3 Etter infiltrasjon, vokse anlegget for 72 timer under lyset regime av 16 h 130-150 &# 181; E m-2 s-1 lys ved 23 ° C / 8 h mørkt ved 20 ° C før høsting. - Anvendelse av proteasomal hemmere
For å støtte ideen om at den testede protein (s) er degradert via en proteasomal sti, bruke bestemte proteasomal hemmere MG132 og lactacystin 28-29, noe som bør redusere eller blokkere degradering. Fire timer før høsting (se trinn 2.1), infiltrere Agrobacterium-inokulert blad områder med 10 mikrometer MG132 (EMD Millipore) eller 10 mikrometer lactacystin (Sigma-Aldrich) eller mock-behandle bladet med de respektive løsemidler, dvs. 0,1% DMSO eller destillert vann.
2. Fremstilling av cellefrie ekstrakter
- Leaf høsting
Høste de inokulerte områder av bladet, som regel ca. 200 til 400 mg av fersk vekt, og male dem til fint pulver i flytende nitrogen. Alternativt, perle-beat vev, ved hjelp av noen perle-beater (f.eks Biospec) eller en amalgamator (f.eks TPC Avansert Technologies) direkte i nedbrytning buffer (se trinn 2.2). - Protein utvinning
Forbered total proteinekstrakt ved å plassere den første vevet inn i 500 mL av nedbrytningsbuffer [50 mM Tris-HCL (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 5 mM DTT, 5 mM adenosin-5'-trifosfat, og 1x proteaseinhibitor cocktail (Sigma-Aldrich)]. Merk at protease inhibitor cocktail rammer hovedsakelig serin, cystein, asparagin, og metalloproteaser og forstyrrer ikke den 26S protease. Clarify ekstrakten ved to påfølgende sentrifugeringer på 12.000 x g i 5 min. - Protein degradering reaksjon
Overfør like volum av ekstrakter, vanligvis 20 pl, for å mikrofugerør og inkuber dem ved romtemperatur i økende tidsrom. Vanligvis sample tiden null, og 5, 10, 15, 20, og 30 min tidspunkter. Stopp reaksjoner ved å koke i SDS gel-sample buffer, og analysere dem ved western blotting.
- Gel elektroforese
3.1.1 løse proteinprøver ved hjelp av SDS-polyakrylamidgel-elektroforese og Elektro-de løste proteiner til en nitrocellulosemembran i henhold til standardprotokollen 30..
3.1.2 Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-metoden (Bio-Rad), og laste 50-80 mikrogram av totalt protein pr kjørefelt. Sørg for at alle prøvene er lastet likt. For lasting kontroller, sammenligne intensiteter av en allestedsnærværende protein arter, for eksempel antatte Rubisco store kjedene som vandrer som et stort band med en relativ elektromobilitet på rundt 50 kDa, de kan bli oppdaget på Coomassie blå-farget gels eller på Ponceau S-eller fluorescerende SYPRO Ruby-farget nitrocellulose membraner. - Blokkering
Blokker membranen med 5% skummet melk i TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) i 1 time ved romtemperatur. Primær antistoff
Fortynn primære anti-epitop-antistoff i 1% skummet melk i TBST til konsentrasjonen anbefalt av produsenten, og inkuberes med det blokkerte membranen i 1 time ved værelsestemperatur eller for over natten ved 4 ° C med forsiktig omrøring. - Skylling
Skyll membranen skylles i 20 ml TBST i 15 min en gang, og to ganger i 5 minutter ved romtemperatur med forsiktig omrøring. - Sekundært antistoff
Fortynn sekundært antistoff (for eksempel anti-kanin IgG) konjugert med pepperrot-peroksydase (HRP) i 1% skummet melk i TBST som anbefalt av produsenten, og inkuberes med membranen i 1 time ved romtemperatur med forsiktig agitering. - Detection
Skyll membranen igjen som beskrevet i trinn 3.4. Etter siste skylling i TBST, visualisere proteiner av interesse med en HRP chemiluminescent underlaget, oftest ved hjelp av en ECL kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1, er tilpasset fra Zaltsman et al. 17. illustrerer representative eksperimenter for påvisning av proteasomal degradering i en celle-fritt system. Nærmere bestemt, vi demonstrere destabilisering av en plante forsvarsrelatert protein VIP1 av VBF F-box protein via SCF VBF veien i N. benthamiana. Arabidopsis VBF og HA-merket VIP1 (HA-VIP1) proteiner ble forbigående coexpressed, og HA-VIP1 innhold protein i ekstrakter av de uttrykker bladene ble analysert av western blotting. Denne analysen viste at VIP1 beløp ble redusert i betydelig grad når coexpressed med VBF, men holdt seg relativt stabil i fravær av VBF coexpression (figur 1A). Legg merke til at en svak reduksjon i VIP1 innhold uten VBF kan være på grunn av det lave nivå av endogen tobakk VBF aktivitet. Den proteasomal degradering mekanisme VIP1 destabilisering av VBF ble avledet fra sin jegnhibition av MG132 (figur 1A). Kvantifisering av resultatene i figur 1A demonstrert nesten komplett (≥ 90 ± 5%) VIP1 av VBF, som ble blokkert av MG132 (Figur 1B). Legg merke til at noe høyere nivåer av VIP1 i nærvær av MG132 mest sannsynlig forklares ved inhibering av den endogene VBF aktivitet 17.
Figur 1. VBF fremmer proteasomal degradering av VIP1. HA-VIP1 ble uttrykt alene eller coexpressed med VBF i N. benthamiana blader. De resulterende proteinekstrakter ble inkubert i de angitte tidsperioder og analysert ved western blotting ved bruk av anti-HA-antistoffer. Den putative Rubisco stor kjede ble anvendt som laste-kontroll (A). Quantified western blot-signalet ble uttrykt som prosent av det signal som oppnås i fravær av VBF ved starten av inkubasjonstiden. Dataene representerer middelverdier fra tre uavhengige eksperimenter med angitte standardavvik (B). Dette tallet ble tilpasset fra Zaltsman et al. 17
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne analysen er avhengig av ekspresjonen av de testede proteiner i plantemateriale, og derfor den potensielle proteasomal nedbrytingsprosessen åpenbart skjer allerede i løpet av de levende vev. Vi analysen protein destabilisering imidlertid bare i ekstraktene, med tiden null-prøven som tjener som det første referansepunkt. Derfor kan vi definere det som et cellefritt assay.
Et viktig aspekt for suksess for denne analyse er det riktige valg av ekspresjonsvektoren for den testede protein (er) blir produsert. Med mindre spesifikke antistoffer mot de testede proteinet, er tilgjengelig, bør det være epitop-merket for påvisning ved western blotting. Den tagget protein bør uttrykkes fra en Agrobacterium binær vektor. Mens mange slike vektorer er tilgjengelig 26, foreslår vi at du bruker vektorer avledet fra våre modulære psat plasmid system 24, noe som gir ett-trinns innsetting av uttrykk kassetter inn i pPZP-RCS2 binære plasmider24-25. En annen fordel med psat system er at det tillater ekspresjon av multiple gener fra den samme vektoren 25, som er spesielt nyttig for eksperimenter for å bestemme flere proteasomal substrater eller for å studere virkningene av interactors av den testede substrat, for eksempel coexpression av Agrobacterium VirD5 protein som samhandler med proteasomal substrat VirF resultater i VirF beskyttelse mot proteasomal degradering 22. Viktigere, inkluderer ekspanderende PSAT serie vektor allerede vektorer for epitope tagging 27. Uavhengig av den valgte kloningsstrategien, bør sekvensen som koder for epitop-merket protein av interesse bli innført i en binær vektor for påfølgende ekspresjon i plantemateriale. Fordi denne analysen benytter transient ekspresjon, betyr den binære vektoren ikke å inneholde seleksjonsmarkører for stabil transformasjon, selv om deres nærvær ikke er skadelig for assay effektivitet.
Selv coexpression av flere proteiner av interesse er best oppnås ved å bruke multigene ekspresjonsvektorer, kan den også utføres ved å kombinere ekvivalente mengder av flytende kulturer av to eller tre Agrobacterium-stammer, som hver bærer en separat binær konstruere.
Et annet viktig punkt er at det i mange tilfeller innebærer proteasomal nedbrytning assay uttrykk ikke bare av proteasomal underlaget, men også av en komponent av SCF pathway. For eksempel kan den eksperimentelle målet være å teste om en F-box protein gjenkjenner og mål for nedbrytning et bestemt substrat. I dette tilfelle bør denne epitop-merket substrat bli coexpressed med umerket F-boks protein.
For mer detaljert analyse av data, kan omfanget av protein degradering være lett kvantifiseres ved å måle den relative intensiteten av de vestlige signaler usynge den nyeste ImageJ programvare (NIH) 31. Når du utfører en slik kvantifisering, er det viktig å ikke over utvikle de vestlige blotter å unngå signal metning. Data for kvantifisering krever også at alle prøvene er lastet på SDS-polyakrylamidgel like med hensyn til deres proteininnhold som proteindegradering i denne analysen blir detektert ved reduksjon av intensiteten av den aktuelle proteinbånd. Dette oppnås ved måling av proteininnholdet i hver celleekstrakt, og ved etterfølgende verifisering av lik belastning på hvert kjørefelt (se trinn 3.1). Videre, i en hvilken som helst gitt tids-retters eksperiment, alle prøver bør være avledet fra det samme parti av ekstrakt bidrar til å sikre lik belastning.
Den cellefrie analysen for proteasomal degradering er beskrevet her anvender planter som et eksperimentelt system. Imidlertid kan de samme eksperimentelle design kan brukes for hvilken som helst annen organisme. Analysen kan også utvides ved Furtheh fokus på SCF veien. For eksempel kan den SCF-avhengig mekanisme for proteindegradering påvises ved anvendelse av et dominant-negative form av SCF-komponenten CULLIN1 (CUL1 DN). Nærmere bestemt har en mutant av Arabidopsis CUL1 med slettede aminosyreresiduer mellom posisjonene 1 og 420 vist seg å samhandle med Skp1/ASK1 komponent av SCF komplekse, men ikke med RBX1, som representerer den katalytiske kjernen av SCF 22. Hemming eller reduksjon av underlaget degradering følgende coexpression av CUL1 DN indikerer involvering av SCF veien.
Vår analyse benytter proteiner av interesse er uttrykt i plantemateriale, i sitt naturlige miljø. Et alternativ til denne tilnærmingen er å rense rekombinante proteiner, legge dem til å plante ekstrakter, og følge deres nedbrytning av vestlige analyse 32. Vi anbefaler ikke denne taktikken som metodikk for valg fordi rekombinante proteiner ikke always trofast reflektere native biologiske egenskaper, men hvis ekspresjon i planta ikke er mulig, representerer bruken av rekombinante proteiner absolutt et verdifullt alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Arbeidet fører til denne publikasjonen har fått støtte fra Marie Curie COFUND programmet "U-Mobility", cofinanced ved Universitetet i Malaga og EU 7. rammeprogram (FP7/2007-2013) i henhold GA nr. 246550. Arbeidet i vårt laboratorium er støttet med tilskudd fra NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, og BSF til VC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Current Protocols in Molecular Biology. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: imagej.nih.gov/ij (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
