Summary
Riktade nedbrytning protein utgör en viktig reglerande mekanism för cellernas funktion. Det sker via en konserverad ubiquitin-proteasom väg, som fäster polyubiquitin kedjor till målproteinet som sedan fungerar som molekylära "taggar" för 26S proteasom. Här beskriver vi en enkel och tillförlitlig cellfri analys för proteasomal nedbrytning av proteiner.
Abstract
Ubiquitin-proteasom väg för proteinnedbrytning har seglat upp som en av de viktigaste mekanismerna för reglering av ett brett spektrum av cellulära funktioner i praktiskt taget alla eukaryota organismer. Närmare bestämt i växter, det ubiquitin/26S proteasomsystemet (UPS) reglerar proteinnedbrytning och bidrar i hög grad till utvecklingen av ett brett spektrum av processer, inklusive immunsvar, utveckling och programmerad celldöd. Dessutom tyder allt fler bevis för att många växtpatogener, såsom Agrobacterium, utnyttja värd UPS för effektiv infektion, betonar vikten av UPS i växt-patogen interaktioner.
Substratspecificiteten för UPS uppnås genom E3 ubiquitin ligas som agerar i samförstånd med E1 och E2 ligaser att känna igen och markera specifika proteinmolekyler avsedda för nedbrytning genom att binda till dessa kedjor av ubiquitin-molekyler. En klass av E3 ligaser är SCF (Skp1 / CUllin / F-box protein) komplex, som specifikt känner igen UPS substrat och riktar dem för ubiquitinationen via sin F-låda proteinkomponent. För att undersöka en potentiell roll för UPS i en biologisk process av intresse, är det viktigt att utforma en enkel och tillförlitlig analys för UPS-medierad nedbrytning protein. Här beskriver vi en sådan analys med användning av ett växtcellfritt system. Denna analys kan anpassas för studier av roller reglerade proteinnedbrytningen i olika cellulära processer, med särskilt fokus på F-box protein-substrat interaktioner.
Introduction
Den ubiquitin/26S proteasome vägen framstår som en omfattande mekanism för reglering av olika biologiska reaktioner, inklusive transkriptionsreglering, cell-cykelprogression och signaltransduktion, receptor nedreglering eller endocytos, bland andra processer 1-4. I denna väg, är målproteinet taggats av ubiquitin rester som först är anslutna via en tiolester bindning till ubikvitin-aktiverande enzym E1 och sedan förflyttade till en cystein-aminosyrarest av ubikitin-konjugering enzym E2, slutligen, E2 samverkar med ubikvitin-ligas E3 , vilket resulterar i polyubiquitinering av proteinsubstrat. I slutändan är de polyubiquitinerade proteinerna erkända och ned av 26S proteasom. I denna mekanism, specificerar E3-enzymet underlaget och fungerar som den viktigaste reglerande komponenten i ubiquitin/26S proteasomsystemet (UPS). E3-ligaser kan agera självständigt, såsom RING domain ligaser, eller som del av en multisubunit SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) komplex, till exempel F-låda domän ligaser. SCF-medierade proteasomal nedbrytningsvägar är involverade i regleringen av transkription, cellcykeln, signaltransduktion 5-10 och många andra viktiga cellulära funktioner.
Förutom dessa kritiska roller i regleringen av cellulära processer, tar UPS den centrala scenen i många växt-patogen interaktioner. Exempelvis tyder allt fler bevis för att flera växtpatogener, bland Agrobacterium tumefaciens, förlitar sig på värd UPS för att underlätta infektionsprocessen 11. Agrobacterium framkallar neoplastiska utväxter på växter, som representerar sina naturliga värdar, och det kan också omvandla en rad andra eukaryoter, från svampar 1,2 till mänskliga celler 12,13. Under dess infektion, exporterar Agrobacterium ett DNA-element (T-DNA) och flera virulens (Vir) proteiner in i värdcellen 12 till 13. Ett av dessa proteiner är VirF den första F-box-protein som finnssom skall kodas med en prokaryot genomet 14. Som en del av SCF ubiquitin ligas komplex, VirF, och dess funktionella värd homolog VBF 15, lätta Agrobacterium infektion via UPS-medierade proteinnedbrytning, vilket förmodligen underlättar uncoating av invaderande bakterie T-DNA från dess medföljande bakteriella och värdproteiner, VirE2 och VIP1, respektive 16,17. Intressant nog många F-låda proteiner, inklusive VirF, är i sig instabil på grund av sin egen proteolys, som medieras av autoubiquitination aktivitet 18,19 eller genom andra E3-ligaser för vilka F-box-proteiner kan tjäna som substrat 20-23.
När man studerar biokemiska aktiviteter F-box proteiner, andra ubiquitin ligas, och / eller deras substrat, skulle det vara mycket användbart att använda en enkel och tillförlitlig analys för proteasomal nedbrytning. Här beskriver vi ett sådant protokoll för analys av proteinstabilitet i en cellFritt system. I denna analys är stabiliteten i UPS-substrat analyseras i närvaro eller frånvaro av en av de viktigaste komponenterna i proteasomal nedbrytningsvägen, till exempel en F-låda protein, i ett cellfritt system. Generellt vi uttrycka den testade protein (er) i växtvävnader, framställa cellfria extrakt från dessa vävnader och övervaka de mängder av protein (er) av intresse genom western blotting. UPS-beroende mekanism av protein nedbrytning kan påvisas genom införande av specifika proteasomal hämmare och / eller med hjälp av samuttryck av dominant-negativ form av en SCF-komponent, Cullin. Medan vi illustrera denna analys med användning av proteasomal nedbrytning av Arabidopsis VIP1 17 protein genom F-box-protein VBF 15 kan det användas för att undersöka stabiliteten hos några andra proteasomal substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Proteinuttryck
- Val av expressionssystem
Välj systemet, det vill säga, vektorer och vektorleveransmetod som är bäst lämpad för uttryck av proteinet av intresse i den specifika modellen organism / cell. Observera att vår analys kräver uttryck av de testade proteinerna i lätt detekterbara mängder, vilket bäst uppnås genom övergående omvandling av ett stort antal celler. I växter, till exempel, är detta bäst uppnås med hjälp av binära plasmider som expressionsvektorer och Agrobacterium som leveranssystem. - Konstruktion av binära expressionsvektorer
Klona den kodande sekvensen (er) av det protein (er) av intresse in i en expressionsvektor, antingen ensamma eller i translationell fusion till en epitopmärkning. Använd vektorer lämplig för det valda uttryckssystemet och molekylärbiologiska standardförfaranden för gen kloning. För Agrobacterium-medierad gen leverans, anställa binära vektorer och införa dem, också med hjälp av standard-protokoll, till en Agrobacterium-stam, såsom EHA105, för efterföljande inokulering av växtvävnader. - Val av växtarter
Välj de växtarter i vilka proteinet (er) av intresse kommer att uttryckas. Observera att även några växtarter som är mottagliga för Agrobacterium-medierad genetisk transformation kan användas, är vår växtarter av val Nicotiana benthamiana, som lätt odlas, mycket mottagliga för Agrobacterium, och har stora blad som lätt ympade. - Växt tillväxt
Odla en anläggning för 4 till 6 veckor i en kruka med Pro-Mix BX i en pott (20 cm x 20 cm x 20 cm) under miljö kontrollerade förhållanden (t.ex. tillväxtkammare) av lång dag (dvs. 16 h på 130 -150 μE m-2 s-1-ljus vid 23 ° C och 8 h mörker vid 20 ° C) och 40 till 65% relativ fuktighet.
1.5.2 Fertilize ibland med kommersiellt tillgängliga produkter per tillverkarens instruktioner. När växten odlas, väljerblad med storleken 50 mm x 70 mm eller större (dessa mätningar längd inkluderar inte bladskaft) för Agrobacterium ympning. - Ympning med Agrobacterium
Väx Agrobacterium-stam härbärgerande den binära konstruktion som uttrycker den testade protein (er) från steg 1,3 över natten vid 28 ° C i YEP-medium (1% pepton, 1% jästextrakt och 0,5% NaCl) kompletterat med lämpliga antibiotika (t.ex. 100 mg / L streptomycin och 10 mg / L rifampicin för pPZP-RSC2-baserade vektorer 24-25).
1.6.2 Centrifugera cellerna, återsuspenderades till OD 600 = 0,5 i infiltration buffert [10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 100 | iM acetosyringon], och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur. Infiltrera kulturen in i abaxial sidan av ett blad, med användning av en 1-ml spruta utan nål, notera att bladen ympas in situ, samtidigt är ansluten till anläggningen.
1.6.3 Efter infiltration, odla växten i 72 h under ljuset regimen i 16 timmar 130-150 &# 181, E m-2 s-1 ljus vid 23 ° C / 8 h mörker vid 20 ° C före skörd. - Tillämpning av proteasomal hämmare
Som stöd för uppfattningen att den testade protein (er) bryts ned via en proteasomal väg, använda specifika proteasomal hämmare MG132 och lactacystin 28-29, vilket bör minska eller till och med blockera nedbrytning. Fyra timmar före skörd (se steg 2.1), infiltrera Agrobacterium-inokulerade bladområden med 10 ^ M MG132 (EMD Millipore) eller 10 ^ M lactacystin (Sigma-Aldrich) eller mock-behandla blad med respektive lösningsmedel, dvs 0,1% DMSO eller destillerat vatten.
2. Framställning av cellfria extrakt
- Leaf skörd
Skörda ympade delar av blad, vanligen ca. 200 till 400 mg av färsk vikt, och mala dem till ett fint pulver i flytande kväve. Alternativt, pärla-slå vävnaderna, med vilken pärla-beater (t.ex. Biospec) eller en tand amalgamator (t.ex. TPC Avancerat Technologies) direkt i buffert nedbrytningen (se steg 2.2). - Protein extraktion
Bered totalt proteinextrakt genom att placera botten vävnad i 500 mikroliter av bufferten nedbrytning [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 5 mM adenosin-5'-trifosfat, och 1x proteasinhibitor cocktail (Sigma-Aldrich)]. Observera att proteashämmare cocktail det påverkar främst serin, cystein, asparaginsyra, och metalloproteaser och inte stör den 26S proteas. Klargör extraktet genom två sekventiella centrifuge vid 12.000 xg under 5 minuter. - Reaktionsproteinnedbrytning
Överför lika volymer av extrakt, vanligen 20 | il, till mikrofugrör och inkubera dem vid rumstemperatur under ökande tidsperioder. Typiskt prov tiden noll, och 5, 10, 15, 20 och 30 min tidpunkter. Stoppa reaktioner genom kokning i SDS-gel-provbuffert, och analysera dem genom western blotting.
- Gelelektrofores
3.1.1 Lös de proteinproverna genom SDS-polyakrylamidgelelektrofores och elektroöverföring av lösta proteiner till ett nitrocellulosamembran enligt standardprotokollet 30.
3.1.2 Bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av Bradford-metoden (Bio-Rad) och belastningen 50 till 80 | j, g av totalt protein per bana. Se till att alla prover laddas lika. För lastkontroller, jämföra intensiteten hos en allestädes närvarande protein arter, såsom förmodad Rubisco stora kedjor som migrerar som ett stort band med en relativ elektroforetisk mobilitet på cirka 50 kDa, de kan upptäckas på Coomassie blåfärgade geler eller på Ponceau S-eller fluorescerande SYPRO Ruby-färgade nitrocellulosamembran. - Blockering
Blockera membranet med 5% skummjölk i TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) under 1 h vid rumstemperatur. Primär antikropp
Späd primära anti-epitop-antikropp i 1% skummjölk i TBST till koncentrationen som rekommenderas av tillverkaren och inkubera med den blockerade membranet under 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C med försiktig omrörning. - Sköljning
Skölj membranet sköljs i 20 ml TBST under 15 min en gång och två gånger under 5 min vid rumstemperatur med försiktig omrörning. - Sekundär antikropp
Späd sekundär antikropp (t.ex. anti-kanin-IgG) konjugerad med pepparrotsperoxidas (HRP) i 1% skummjölk i TBST som rekommenderas av tillverkaren och inkubera med membranet under 1 h vid rumstemperatur med försiktig omrörning. - Detektion
Skölj membranet igen såsom beskrivits i steg 3,4. Efter den sista sköljningen i TBST, visualisera proteinerna av intresse med ett HRP kemiluminiscent substrat, oftast med användning av ett ECL-kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1, anpassade från Zaltsman et al. 17 illustrerar representativa experiment för detektion av proteasomal nedbrytning i ett cellfritt system. Specifikt visar vi destabilisering av en växtförsvarsrelaterad protein VIP1 av VBF F-box protein via SCF VBF vägen i N. benthamiana. Arabidopsis VBF och HA-märkta VIP1 (HA-VIP1) proteiner transient samuttryckt, och HA-VIP1 proteinhalt i extrakt av de som uttrycker blad analyserades med western blotting. Denna analys visade att VIP1 belopp har reducerats till en betydande grad när samuttrycks med VBF, men förblev relativt stabil i frånvaro av VBF samuttryck (Figur 1A). Observera att en liten minskning i VIP1 innehåll utan VBF kan bero på den låga nivån på den endogena tobak VBF aktivitet. Mekanism Den proteasomal nedbrytning av VIP1 destabilisering av VBF var slutsatsen från dess jagnhibition av MG132 (Figur 1A). Kvantifiering av resultaten i figur 1A visade nästan fullständigt (≥ 90 ± 5%) VIP1 av VBF, som blockerades av MG132 (Figur 1B). Observera att något högre halter av VIP1 i närvaro av MG132 troligen förklaras genom hämning av den endogena VBF aktivitet 17.
Figur 1. VBF främjar proteasomal nedbrytning av VIP1. HA-VIP1 uttrycktes ensamt eller samuttrycktes med VBF i N. benthamiana lämnar. De resulterande proteinextrakt inkuberades under de angivna tidsperioderna och analyserades genom western blotting med användning av anti-HA-antikroppar. Den förmodade RuBisCo stor kedja användes som laststyrning (A). Quantified. Western blöt signal uttrycktes som procent av den signal som erhålls i frånvaro av VBF vid början av inkubationsperioden. Data representerar medelvärdena för tre oberoende experiment med angivna standardavvikelser (B). Denna siffra var anpassad från Zaltsman et al. 17
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna analys är beroende av uttrycket av de testade proteinerna i växtvävnader, och därför förekommer det potentiella processen proteasomal nedbrytning naturligtvis redan inom de levande vävnaderna. Vi analys protein destabilisering, dock endast i extrakten, med tiden noll prov fungerar som den ursprungliga referenspunkten. Därför definierar vi den som en cellfri analys.
En viktig aspekt för framgång för denna analys är det korrekta valet av expressionsvektor från vilken den testade protein (er) kommer att produceras. Såvida specifika antikroppar mot det testade proteinet är tillgängliga, bör det vara epitopmärkt för detektion genom western blotting. Den taggade protein bör uttryckas från en Agrobacterium binär vektor. Många sådana vektorer är tillgängliga 26, föreslår vi att du använder vektorer som härrör från vår modul PSAT plasmid systemet 24, vilket gör att ett steg insättning av expressionskassetter i pPZP-RCS2 binära plasmider24-25. En annan fördel med PSAT systemet är att det tillåter uttryck av multipla gener från samma vektor 25, vilket är särskilt användbart för experiment för att analysera flera proteasomal substrat eller för att studera effekterna av interagerande av det testade substratet; exempelvis samuttryck av Agrobacterium VirD5 protein som interagerar med proteasomal substrat VirF resultat i VirF skydd från proteasomal nedbrytning 22. Viktigt inkluderar expanderande PSAT serie vektor redan vektorer för epitop tagga 27. Oavsett den valda klonings-strategin bör den sekvens som kodar för epitop-taggade protein av intresse att introduceras i en binär vektor för efterföljande expression i växtvävnader. Eftersom denna analys använder sig av övergående uttryck, betyder den binära vektorn inte innehålla selektionsmarkörer för stabil transformation, även om deras närvaro inte är till förfång för analysens effektivitet.
Även om samuttryck av flera proteiner av intresse uppnås bäst med användning av Multigene expressionsvektorer, kan det också göras genom att man kombinerar ekvivalenta volymer av flytande kulturer av två eller tre Agrobacterium-stammar, av vilka var och uppbär en separat binär konstruktion.
En annan kritisk punkt är att det i många fall handlar om analys av proteasomal nedbrytnings uttryck inte bara för proteasomal underlaget, men också av en del av SCF vägen. Till exempel kan den experimentella målet vara att testa om en F-box protein känner igen och mål för degradering ett specifikt substrat. I detta fall bör detta epitopmärkt substrat samuttryckt med den omärkta F-box protein.
För mer detaljerad analys av data, kan omfattningen av proteinnedbrytning lätt kvantifieras genom att mäta den relativa intensiteten av de västerländska signalerna usjunger den senaste ImageJ programvara (NIH) 31. När du utför en sådan kvantifiering, är det viktigt att inte över utveckla de västra blotting för att undvika signal mättnad. Data kvantifieringen kräver också att alla prover laddas på SDS-polyakrylamidgel-lika med avseende på sitt proteininnehåll som proteinnedbrytning i denna analys detekteras genom reduktion av intensiteten av den lämpliga proteinband. Detta uppnås genom bestämning av innehållet i varje cellextrakt protein och genom kontroll i efterhand av lika belastning av varje bana (se steg 3.1). Dessutom, i varje given tid-kurs experiment, alla prover bör komma från samma parti extrakt hjälper till att säkerställa lika belastning.
Det cellfria analys för proteasomal nedbrytning beskrivs här använder växter som ett experimentellt system. Däremot kan samma experimentell design användas för någon annan organism. Analysen kan också förlängas med further med fokus på SCF vägen. Exempelvis kan SCF-beroende mekanismen av proteinnedbrytning påvisas med användning av en dominant-negativ form av SCF komponent CULLIN1 (CUL1 DN). Närmare bestämt har en mutant av Arabidopsis CUL1 med raderade aminosyrarester mellan positionerna 1 och 420 visats interagera med Skp1/ASK1 komponenten i SCF-komplex, men inte med RBX1, som representerar den katalytiska kärnan av SCF 22. Hämning eller minskning av substrat nedbrytning efter samuttryck av CUL1 DN indikerar inblandning av SCF vägen.
Vår analys utnyttjar proteiner av intresse som uttrycks i växtvävnader, i sin naturliga miljö. Ett alternativ till detta tillvägagångssätt är att rena rekombinanta proteiner, lägga till dem i växtextrakt, och följ deras nedbrytning av western-analys 32. Vi rekommenderar inte denna taktik som metod för val eftersom rekombinanta proteiner inte always troget återspeglar de infödda biologiska egenskaper, men om uttryck i planta är inte genomförbart, representerar användningen av rekombinanta proteiner förvisso ett värdefullt alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Det arbete som lett fram till denna publikation har erhållit finansiering från Marie Curie COFUND programmet "U-Mobility", som medfinansieras av universitetet i Malaga och Europeiska unionens 7: e ramprogram (FP7/2007-2013) under GA nr 246550. Arbetet i vårt laboratorium stöds av anslag från NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, och BSF till VC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Current Protocols in Molecular Biology. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: imagej.nih.gov/ij (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
