Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التعبير، والعزلة، وتنقية القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان البيروكسيديز البروتينات لتجديد الأنسجة العصبية

Published: January 22, 2014 doi: 10.3791/51295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Akron

Summary

تطوير البروتينات الانصهار biotinylatable لديها العديد من التطبيقات المحتملة في مختلف مجالات البحث العلمي. المؤتلف الهندسة البروتين هو إجراء على التوالي إلى الأمام التي هي فعالة من حيث التكلفة، وتوفير عوائد عالية من البروتينات مصمم خصيصا.

Abstract

وقد استخدمت المؤتلف هندسة البروتينات القولونية (E. كولاي) نظم التعبير عن ما يقرب من 4 عقود، واليوم E. كولاي لا يزال الكائن المضيف الأكثر استخداما على نطاق واسع. مرونة النظام يسمح لإضافة الأنصاف مثل علامة البيوتين (للتفاعل streptavidin) والبروتينات وظيفية أكبر مثل بروتين الفلورية الخضراء أو الكرز الأحمر البروتين. أيضا، وقد مكن دمج الأحماض الأمينية غير طبيعية مثل chelators أيون الفلز، المجموعات الوظيفية على رد الفعل فقط، تحقيقات الطيفية، والجزيئات نقل التعديلات بعد متعدية التلاعب أفضل من خصائص البروتين وظائف. ونتيجة لهذا الأسلوب يخلق البروتينات الانصهار للتخصيص التي تقدم فائدة كبيرة لمختلف مجالات البحث العلمي. وبشكل أكثر تحديدا، قد أدرجت تسلسل البروتين biotinylatable في العديد من البروتينات المستهدفة بسبب تفاعل عالية تقارب بين البيوتين مع أفيدين وstreptavidin. وقد ساعد هذا في تعزيز بالإضافة إلى ذلك كشف وتنقية البروتينات الموسومة فضلا عن فتح المجال لتطبيقات الثانوية مثل الفرز الخلية. وبالتالي، تظهر جزيئات البيوتين المسمى تأثير متزايد وعلى نطاق واسع في مجالات الطب الحيوي وbioindustrial. لغرض بحثنا قمنا هندسة البروتينات الانصهار المؤتلف البيروكسيديز تحتوي على عامل النمو العصبي (NGF) وsemaphorin3A (SEMA3A) مناطق وظيفية. لقد ذكرت سابقا كيف أن هذه البروتينات الانصهار البيروكسيديز، جنبا إلى جنب مع غيرها من تسلسل البروتين النشط، يمكن المربوطة إلى الحيوية لهندسة الأنسجة وأغراض التجدد. يحدد هذا البروتوكول أساسيات الهندسة biotinylatable البروتينات في نطاق مليغرام، وذلك باستخدام T7 لاك محرض النواقل وE. المضيفين التعبير القولونية، بدءا من التحول لتوسيع نطاق المتابعة وتنقيتها.

Introduction

البروتينات تغطي مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية التي هي المسؤولة عن العديد من الوظائف البيولوجية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل الأنسجة السليمة والمنظمة. هذه الجزيئات بدء الآلاف من مسارات الإشارات التي تتحكم يصل التنظيم و / أو أسفل تنظيم الجينات والبروتينات الأخرى، والحفاظ على التوازن داخل الجسم البشري. تعطيل بروتين واحد يؤثر هذا على شبكة الإنترنت بأكملها من الإشارات، التي يمكن أن تؤدي إلى ظهور اضطرابات مدمرة أو الأمراض. هندسة البروتينات الفردية في المختبر يقدم حلا واحدا لمكافحة هذه الآثار الضارة ويوفر بديلا للأدوية جزيء صغير. في عام 1977، وكان الجينات ترميز التسلسل السوماتوستاتين 14 حمض أميني واحد من البروتينية المهندسة الأولى التي تم إنشاؤها باستخدام E. القولونية 1. بعد فترة وجيزة في عام 1979، تم استنساخ الأنسولين في البلازميد pBR322، حولت، أعرب، وتنقيته 2. منذ ذلك الحين، توسعت البروتينات المؤتلف نفوذهم لحقول متعددة من الدقةearch مثل المواد الحيوية، تسليم المخدرات، وهندسة الأنسجة، المستحضرات الصيدلانية البيولوجية، والزراعة، والانزيمات الصناعية والوقود الحيوي وغيرها (للاستعراضات انظر المراجع 3-8). ويرجع إلى حد كبير إلى براعة أن التقنية تقدم عن طريق إضافة الأنصاف تطبيق معين الكيميائية أو تسلسل البروتين لأغراض بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، وتحديد البروتين الهدف وتحقيق الاستقرار وتنقية هذا.

عبر تقنية الحمض النووي المؤتلف، والبروتينات المؤتلف يمكن التعبير عنها في مجموعة متنوعة من أنظمة المضيف حقيقية النواة وبدائية النواة بما فيها الثدييات، النباتات، الحشرات، الخميرة، والفطريات، أو البكتيريا. يقدم كل مضيف مزايا مختلفة وعادة ما يتم تحديد أفضل نظام قائم على وظيفة البروتين، والغلة، والاستقرار، والتكلفة الإجمالية، وتطويره. وغالبا ما تفتقر خلايا البكتيريا آليات التعديل بعد متعدية التي توفر المضيفين حقيقية النواة (أي ارتباط بالغليكوزيل، ثاني كبريتيد سد، ه ح.) 5. ونتيجة لذلك، تؤدي أنظمة الثدييات والحشرات عادة في أفضل التوافق والتعبير عن البروتينات حقيقية النواة، ولكن هذه المضيفين وعادة ما تكون أكثر تكلفة وتستغرق وقتا طويلا 9. لذا، E. القولونية هو المضيف يفضل لنظام التعبير لدينا لأن الخلايا التوسع بسرعة في ظروف النمو غير مكلفة وآليات التعبير الجيني مفهومة جيدا 5،9. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام من السهل أن حجم المتابعة لأغراض الإنتاج والنتائج في البروتينات وظيفية على الرغم من عدم وجود تعديلات ما بعد متعدية 10. وE. يتم اختيار سلالة القولونية K12 في هذا البروتوكول لاستنساخ لأن هذه السلالة يقدم عوائد البلازميد ممتازة على أساس الكفاءة التحول عالية. بالإضافة إلى ذلك، E. ويستخدم سلالة القولونية BL21 للتعبير لأن هذه السلالة المضيف يحتوي على الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 الجين الذي يوفر البروتين التعبير للرقابة والاستقرار 11.

خيمة "> بعد اختيار المضيف، يجب اتخاذ مزيد من الحذر في اختيار ناقلات التعبير المثالي لتسهيل اختيارها والتحكم التعبير البروتين. توليف البروتينات المؤتلف يبدأ مع تسلسل الحمض النووي المستهدف أن يتم استنساخ بتوجيه من البكتيريا T7 النسخ وإشارات الترجمة، و هو فعل التعبير في الخلايا المضيفة التي تحتوي على نسخ الكروموسومات من الجين T7 الحمض النووي الريبي بوليميراز 12. هذه النواقل، والمستمدة من pBR322 ناقلات البلازميد (للمراجعة أنظر المرجع 13)، وتخضع لرقابة مشددة من قبل المروج T7 وضعت في البداية من قبل الدارس وزملاؤه 14 وتوفير إضافية التحكم من خلال إدراج المشغل أمريكا اللاتينية والكاريبي وأمريكا اللاتينية والكاريبي كاظمة (lac1) 15،16. للالمؤتلف هندسة البروتينات، وهذا النظام التعبير يوفر القدرة على تصميم تسلسل الأحماض الأمينية معينة من البروتين المطلوب عن طريق إدخال مختلفة تسلسل الحمض النووي المستهدف أو لإنشاء البروتينات الانصهار تتكون من المجال جنبا إلى جنبق من البروتينات واحدة. بالإضافة إلى ذلك، بعض النواقل سلسلة تشمل الببتيد علامة تعديلات على وضعها على N C أو محطة. لأغراض التصميم لدينا، تمت إضافة الحامض الاميني (صاحب) علامة لتسلسل الحمض النووي المستهدف لتنقية وأدرج تسلسل biotinylatable 15 الأحماض الأمينية لbiotinylation 17،18. في هذا البروتوكول البلازميد التي تحتوي على الجينات المقاومة الأمبيسلين، تم اختياره لتحمل لنا الانصهار biotinylatable تسلسل البروتين. يتم التحكم في هذا التعبير ناقلات عبر T7 المروج أمريكا اللاتينية والكاريبي والتي يسببها بسهولة مع الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).

وتستخدم تعبيرات اختبار (الثقافات على نطاق صغير) لتحديد وجود والذوبان من البروتين المستهدفة، والتي يمكن التعبير عنها في أي شكل قابل للذوبان أو غير قابلة للذوبان في صياغة إجراءات التنقية. وهناك البروتين للذوبان أعرب داخل الخلية البكتيريا الخضوع للطي التلقائي للحفاظ على الهيكل الأصلي لها 19. عادة الأمبنية مواتية الديناميكا الحرارية. في كثير من الحالات النشاط الأيضي للمضيف لا يفضي إلى البروتين الهدف، ووضع الضغط على النظام الذي يؤدي إلى إنتاج بروتين غير قابلة للذوبان وتشكيل الهيئات إدراج تتألف من المجاميع البروتين غير قابلة للذوبان. وبالتالي فإن البروتين الهدف يبدل طبيعة، جعلها غير نشطة بيولوجيا عموما 20. يتم تحجيم المتابعة كلا التعبيرين الاختبار، ويتم تحديد إجراءات العزل عن طريق ذوبان البروتين الهدف. مطلوب استعادة الطبيعة إضافية أو طوي ثانية خطوة للبروتينات قابلة للذوبان. البروتينات المؤتلف الناتجة يمكن تنقيته باستخدام مزيد من حجم الاستبعاد اللوني.

في البيت يوفر إنتاج البروتين المؤتلف مزايا التكلفة على المنتجات التجارية منذ ملليغرام من البروتين الهدف يمكن أن تكون معزولة للتر الواحد من الثقافة الرئيسية. معظم المعدات المطلوبة متاحة في مختبر البيولوجية أو الكيميائية التقليدية. الهندسة البروتين يسمح لخلقالبروتينات الانصهار مخصصة مع وظائف المضافة التي ليست دائما متاحة تجاريا. الشكل 1 يصور الإجراءات الرئيسية التي تشارك في البروتينات المؤتلف الهندسة. مع هذا النظام التعبير أنشأنا العديد من البروتينات biotinylatable، مثل انترفيرون غاما، عامل النمو المشتق من الصفيحات، وعظم تخلقية البروتين 21-23، ولكن سوف نركز على اثنين من البروتينات التي قمنا بتصميم لتوجيهات محوار، NGF (29 كيلو دالتون ) وSEMA3A (91 كيلو دالتون) 10 (للمراجعة أنظر المرجع 24). Biotinylation هو أسلوب شائع لتحديد الهوية، وتجميد وعزل البروتينات المسماة باستخدام المعروفة البيوتين streptavidin التفاعل 25-27. تحقيقات الفيزيائية الحيوية 28،29، 30 أجهزة الاستشعار، ونقاط الكم 31 بعض الأمثلة من النظم التي تستخدم تقارب عالية من البيوتين streptavidin اقتران مع د K بناء على أمر من 10 -15 M 27. وE. الحيوي القولونيةيغاز القصدير، البيرة، يساعد في المرفق التساهمية من البيوتين إلى جانب سلسلة يسين وجدت داخل البيوتين الموسومة تسلسل 18،32. وقد أنتجت الربط البيوتين على المواد والجزيئات الحيوية تسليم مستمرة من عوامل النمو إلى الخلية لعدة تطبيقات هندسة الأنسجة 21،33-35. وبالتالي، هندسة هذه البروتينات مصمم خصيصا biotinylatable هو أداة قوية يمكن أن تتجاوز الاهتمامات البحثية متعددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم البروتين المستهدف

  1. باستخدام المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية موقع (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) الحصول على تسلسل الأمينية للبروتين الهدف مع الأخذ في الاعتبار نوع من الفائدة والمتغيرات أي لصق. تحديد تسلسل الأحماض الأمينية الذي يتوافق مع المنطقة النشطة من الفائدة من البروتين.
    ملاحظة: للحصول على SEMA3A، وقد تم اختيار الأحماض الأمينية 21-747. تم تصميم البروتين الانصهار مع NGF حيث تسلسل barstar، الأحماض الأمينية 1-90، وأضيف إلى الأحماض الأمينية NGF 122-241.
  2. إلى N-محطة إضافة تسلسل التالي: علامة 6X-صاحب لتنقية (HHHHHH)، التبغ إحفر الفيروسات (TEV) البروتيني خفض الموقع لإزالة علامة صاحب (ENLYFQG)، البيوتين الموسومة تسلسل لbiotinylation من البروتين في K (GLNDIFEAQKIEWHE) والمفصلي مرنة مع وجود ثغرات من شأنها أن تسمح للغرفة المناسبة البروتين طوي ثانية (EFPKPSTPPGSSGGAP).
    ملاحظة: يمكن لهذه متواليات تختلف اعتمادا على الانصهار البروتوكول الاضافي المطلوبعين.
  3. إرسال كاملة تسلسل الأحماض الأمينية لشركة لجين تصميم / الأمثل للأنواع المضيفة المطلوب والتوليف. Subclone في ناقلات من خيار استخدام الموقع BamHI-NOTI استخدام عدة أو من خلال الاستفادة من الخدمات التجارية.

2. صنع لوحات أجار

ملاحظة: من المهم جدا أن جميع المخزونات من المضادات الحيوية، لوحات، ومخازن، الخ يتم تخزينها بشكل صحيح (درجة الحرارة والمدة) وتظل خالية من البروتياز (تعقيمها).

  1. تزن من أجار بنحو 1.5٪ بالوزن ومرق استذابة (LB) في 20 جرام / لتر ووضعه في زجاجة وسائل الإعلام الزجاج. زجاجة مل 500 يجعل حوالي 15 لوحات.
  2. Volumetrically إضافة الماء عالى النقاء، وتخلط جيدا، والأوتوكلاف.
  3. دعونا زجاجة بارد لمسة وإضافة المضادات الحيوية المناسبة. تجنب التصلب المبكرة للأجار، ولكن إذا زجاجة يبرد كثيرا والحل يبدأ تحجر، يسخن في الميكروويف.
    ملاحظة: لدينا البلازميد يحتوي على المقاومة الأمبيسلين جنراله. لذلك، يجب أن يحتوي على جميع الخطوات الأمبيسلين في 100 ميكروغرام / مل. وE. كولاي سلالة الاستنساخ K12 يتطلب التتراسيكلين (12.5 ميكروغرام / مل) للمضادات الحيوية. BL21 خلايا البكتيريا لا تحتاج إلى أي مضاد حيوي إضافية.
  4. صب 25-30 مل من محلول إلى 90 ملم أطباق بتري وإتاحة الوقت لتجف.
  5. طبق التسمية مع المضادات الحيوية المناسبة وتخزين رأسا على عقب في 4 درجات مئوية، مع parafilm أو في كيس الأغلاق.
    ملاحظة: لوحات جيدة لمدة شهر واحد.

3. الاستنساخ من البيوتين معلم البلازميد

ملاحظة: تتم أحكام جو معقم و مطهر.

  1. تدور باستمرار ناقلات البلازميد في 6،000 x ج لمدة 3 دقائق لبيليه، وإضافة 10 ميكرولتر من تعقيم الماء عالى النقاء.
  2. إزالة 50 ميكرولتر من E. المختصة كيميائيا الخلايا عالية الكفاءة التحول القولونية من -80 درجة مئوية، وعلى الفور وضع على الجليد لمدة 5-10 دقيقة.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من الحل في ناقلات 0.5-1 ng/50خلايا لتر إلى 50 ميكرولتر هاء؛ 56 القولونية الخلايا ووضع البلازميد المتبقية في -80 درجة مئوية.
  4. وضع خلايا البكتيريا التي تحتوي على ناقلات على الجليد لمدة 5 دقائق.
  5. الصدمة الحرارية الخلية وخليط ناقلات لل30-45 ثانية في 42 ° C حمام الماء ومكان الخلايا مرة أخرى على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  6. إضافة 250 ميكرولتر من مرق السوبر الأمثل مع القمع مقيضة (SOC) المتوسطة (2٪ ث / ت bacto-تريبتون، 0.5٪ ث / ت استخراج bacto-الخميرة، 8.56 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 20 ملي MgSO 4 و 20 ملي الجلوكوز والماء عالى النقاء؛ درجة الحموضة = 7.0) ويهز في 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: SOC لا ينبغي تعقيمها ولكن يتم تصفية تعقيمها من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
  7. لوحات الجافة 10-15 دقيقة قبل خلايا الطلاء.
  8. ماصة 25، 50، و 100 ميكرولتر من محلول الخلية على لوحات أجار منفصلة تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والتتراسيكلين (12.5 ميكروغرام / مل) المضادات الحيوية. استخدام الخرز الزجاجي لتوزيع حل بالتساوي على لوحات أجار.
    9. <لى> احتضان لوحات رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية لمدة 15-18 ساعة.
  9. التحقق من وجود البكتيريا الفردية مستعمرات صغيرة على لوحات وتخزين رأسا على عقب في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى (الشكل 2A).
    1. إذا لم يكن هناك مستعمرات موجودة:
      1. تحقق نضارة والعقم من مخازن واللوازم.
      2. زيادة كمية البلازميد يضاف إلى E. القولونية K12 السلالة.
    2. إذا مستعمرات كبيرة موجودة أو أن هناك فرط نمو المستعمرات (الشكل 2B و 2C)، restreak لوحة آغار جديدة باستخدام حلقة التلقيح المعقمة أو خلايا لوحة في انخفاض حجم.
  10. تطعيم 5 مل تحتوي على LB الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والتتراسيكلين (12.5 ميكروغرام / مل) مع المضادات الحيوية مستعمرة واحدة تحولت من E. الخلايا القولونية. تنمو الخلايا المتابعة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 250-300 دورة في الدقيقة.
  11. في اليوم التالي، استخدم عدة البلازميد العزلة من أجل عزل ناقلات الهدف من غرو بين عشية وضحاهاث اب ومخزن تنقية البلازميد في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    1. اختياري: التحقق نقاء وتركيز البلازميد باستخدام القراءة الامتصاصية التي تم الحصول عليها في 260 و 280 نانومتر.

4. التحول من البلازميد في التعبير المضيف

ملاحظة: تتم أحكام جو معقم و مطهر.

  1. كرر الخطوات 3،2-3،10 للE. الخلايا القولونية BL21 مع التغييرات التالية:
    ملاحظة: خلايا BL21 لا تتطلب أي إضافية المضادات الحيوية، وبالتالي الأمبيسلين فقط يضاف إلى لوحات أجار للتحول.
    1. إضافة 2-5 ميكرولتر من البلازميد المعزولة في 0.5-2 ng/50 الخلايا ميكرولتر من الخطوة 3،12 حتي 50 ميكرولتر E. الخلايا المضيفة التعبير القولونية.
    2. خلايا الصدمة الحرارية ل60-90 ثانية.
    3. يهز محلول يحتوي على SOC المتوسطة في 250 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة بدلا من 30 دقيقة.
  2. نتف مستعمرة واحدة من خلايا البكتيريا تحولت من طبق بيتري مع ستيرإيل قضيب عصا وضعها في أنبوب اختبار يحتوي على 5 مل مرق LB مع التركيز المناسب من الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل).
  3. وضع أنابيب الاختبار في شاكر بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 250 دورة في الدقيقة.
  4. في صباح اليوم التالي، واتخاذ 200 ميكرولتر من ليلة وضحاها تنمو المتابعة وإضافته إلى 5 مل تحتوي على LB الأمبيسلين في 100 ميكروغرام / مل.
  5. تجميد أسفل الخلايا المتبقية مع 250 ميكرولتر 50٪ الجلسرين (العقيمة) إلى 750 ميكرولتر الثقافة والحفاظ في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن يتم التعبير اختبار جديد وإجراءات التصعيد باستخدام قضيب عصا العقيمة للحصول على تجريف الخلايا المجمدة وبتلقيح LB مع المضادات الحيوية المناسبة.
  6. وضع أنبوب اختبار في شاكر في 250-300 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية حتى يتم قياس الكثافة الضوئية (OD) بين 0.7-0.8 في لالامتصاصية 600 نانومتر.
  7. لحث الخلايا مع IPTG في تركيز النهائي من 1 ملم.
  8. يهز ل4 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في 300 دورة في الدقيقة. بدلا من ذلك يمكن خلايا أيضاتتزعزع بين عشية وضحاها في 18 درجة مئوية في 250-300 دورة في الدقيقة. هذا يمكن أن يؤدي إلى عائدات أعلى من البلازميد اعتمادا على البروتين الهدف.
  9. الصوديوم كبريتات دوديسيل بولي أكريلاميد جل الكهربائي (SDS-PAGE) تحليل اختبار التعبير
    1. تأخذ 500 ميكرولتر من الثقافة والمكان في أنبوب 1.5 مل. تدور باستمرار في 13-15 x ج لمدة 5 دقائق. صب قبالة السائل طاف وتسمية "القابلة للذوبان". بيليه resuspend مع vortexing لفي 200 ميكرولتر من صبغ التحميل (50 ميكرولتر 2 المركابتويثانول، 950 ميكرولتر عينة Laemmli عازلة).
      ملاحظة: سيتم استخدام البكتيريا القابلة للذوبان الكريات لتحديد ما إذا كان البروتين المؤتلف في المناطق هيولي من خلايا البكتيريا. ويمكن تخزين الكريات في -80 درجة مئوية دون تحميل صبغ لحين الحاجة إليها. ثقافة البكتيريا التحكم التي لم يتم تحويلها أو التي يسببها يمكن أن تعامل على أنها قابلة للذوبان وكذلك للمقارنة.
    2. تأخذ 1،000 ميكرولتر من الثقافة والمكان في أنبوب 1.5 مل. تدور باستمرار في 13-15 x ج لمدة 5 دقائق.صب قبالة السائل طاف وتسمية "غير القابلة للذوبان".
      ملاحظة: سوف تخضع لإجراءات غير القابلة للذوبان الكريات تمسخ أدناه من أجل الإفراج عن البروتينات الموجودة في الهيئات إدراج خلايا البكتيريا. ويمكن تخزين الكريات في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. ثقافة البكتيريا التحكم التي لم يتم تحويلها أو التي يسببها يمكن أن تعامل على أنها غير قابلة للذوبان وكذلك للمقارنة.
      1. resuspend الكرية غير قابلة للذوبان في 200 ميكرولتر Bugbuster وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      2. تدور باستمرار العينة مرة أخرى في 13-15 x ج لمدة 5 دقائق وتأخذ 50 ميكرولتر من طاف وإضافته إلى الجديد "غير قابل للذوبان" 1.5 مل أنبوب.
      3. ثم إضافة 50 ميكرولتر من صبغ التحميل لهذه العينة الجديدة.
    3. تغلي عينات للذوبان وغير القابلة للذوبان على حد سواء لمدة 5 دقائق لتفسد البروتينات لتحليل SDS-PAGE.
    4. تحميل كل عينة إلى هلام الكهربائي مع سلم القياسية.
    5. من أجل تصور استخدام عينات البروتين staininز كاشف واتبع بروتوكول الشركة.
    6. تحديد ما إذا كان البروتين يعبر في الكسور للذوبان و / أو غير قابلة للذوبان عن طريق مقارنة هذه الممرات اثنين وكذلك المقارنة بين الممرات لمراقبة الممرات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان (انظر الملاحظة 4.9.1 و4.9.2) على هلام SDS-PAGE (الشكل 2). يجب أن تظهر الفرقة الداكنة حول الوزن الجزيئي للبروتين في الممرات للذوبان أو غير قابلة للذوبان. هذا وسوف يحدد الإجراء الذي عزل لاستخدامها في البروتوكول 6.
      ملاحظة: إذا كان هناك عصابة في كل من هذه المناطق من العزلة إما المستخدمة في بروتوكول 6 أدناه يمكن أن يؤديها، أو البروتين يمكن أن تكون معزولة في كلا الاتجاهين من أجل تحديد الطريقة التي تنتج العزلة عائدات أعلى من البروتين المؤتلف (الشكل 3) .
    7. إذا تم إجراء 4 ساعة وبين عشية وضحاها الاستقراء، وتحديد الطريقة التي التعريفي لديها أعلى إنتاج البروتين لنطاق المتابعة العملية (الشكل 2).
    10. 5. نطاق المتابعة الإجرائية والثقافة الرئيسية

    1. إعداد وسائط النمو مع 85.7 غرام من رائع مرق و 28.8 مل من الجلسرين 50٪ في 1.8 L من الماء عالى النقاء والتعقيم في دورة السائل لمدة 1 ساعة.
    2. بدء الثقافة بين عشية وضحاها من الأسهم المجمدة الخلية التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.5.
      ملاحظة: تتم أحكام جو معقم و مطهر.
      1. خلط 20 مل من LB ومع تركيز النهائي من الأمبيسلين في 100 ميكروغرام / مل في العقيمة 125 مل دورق مخروطي سعة.
      2. باستخدام قضيب عصا معقمة اتخاذ الغاء تحولت E. القولونية الخلايا وانخفاض قضيب في قارورة. إزالة عصا قضيب والمكونات سدادة قارورة مع رغوة أو القطن، وتغطي مع رقائق الألومنيوم للحفاظ على العقم.
      3. بين عشية وضحاها يهز في 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. الثقافة الرئيسية
      ملاحظة: تتم أحكام جو معقم و مطهر.
      1. صب الثقافة بين عشية وضحاها إلى 1.8 لتر من وسائط النمو العقيمة وإضافة الأمبيسلين في 100 ميكروغرام / مل و 6-8 قطرات من مضاد الرغوة العقيمة 204 باستخدام ماصة باستور.
      2. الثقافات المكان في 37 ° C حمام الماء مع 0.2 ملم تصفيتها ضغط الهواء محتدما في الثقافات من خلال الحجارة التهوية.
      3. مرة واحدة تصل إلى 0.7-0.8 ل 600Nm OD، لحث مع IPTG (1 ملم) والسماح لتحريض تحدث إما 4 ساعة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 18 درجة مئوية تبعا للذوبان / النتائج غير قابلة للذوبان من SDS-PAGE في الخطوة 4.9.
    4. جمع E. خلايا القولونية
      1. تدور باستمرار ثقافة خلية في 1 زجاجات L الطرد المركزي (2 زجاجات / ثقافة) لمدة 15 دقيقة في 14،000 XG في 4 درجات مئوية.
      2. تخلصي من طاف وباستخدام ملعقة رقيقة، مغرفة البكتيريا بيليه في 50 مل أنابيب اثنين. الخلايا يمكن مكعبات بواسطة الطرد المركزي مرة أخرى لبضع دقائق.
        ملاحظة: كل ثقافة 1.8 لتر ينتج في اثنين من البكتيريا والكريات، واحد في كل 50 مل أنبوب الطرد المركزي.
      3. مخزن الكريات في -80 مئوية حتى البروتين العزلة.
      </ لى>

    6. العزلة وتنقية البروتين المؤتلف

    ملاحظة: إذا كان موجودا في البروتين في المنطقة القابلة للذوبان التي تستند إلى تحليل SDS-PAGE من الخطوة 4.9 ثم سيتم استخدام "عزل الأم"، ولكن للبروتينات قابلة للذوبان إجراءات "العزل غير مواطن" سوف يتم تنفيذها.

    1. تحلل الخلية
      1. غير مواطن
        1. إزالة حولت E. القولونية بيليه من الفريزر -80 درجة مئوية، وإضافة 20 مل تحلل / غسل العازلة (الجدول 1) إلى كل أنبوب الطرد المركزي.
        2. دوامة ويهز بيليه المجمدة حتى يذوب وsolubilizes في حل العازلة دون أي قطع كبيرة. احتضان على nutator بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، يجب أن يكون بيليه الآن الطين اللزج ويرجع ذلك إلى تغيير طبيعة البروتين من المخزن المؤقت.
        3. أجهزة الطرد المركزي في الطين 20،500 XG في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نقل طاف لأنبوب جديد لعزل وتجاهل بيليه.
      2. الحصول تحولت E. بيليه القولونية من الفريزر -80 درجة مئوية.
      3. إضافة الاحتياطي تحلل (الجدول 1) إلى أنبوب الطرد المركزي للوصول إلى الحجم النهائي من 30 مل، وطرد بيليه المجمدة من قبل vortexing وتهتز بصرامة. وضع بيليه على الجليد.
      4. غسل sonicator التحقيق مع 70٪ من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1-2 دقيقة السعة. ثم كرر مع الماء عالى النقاء.
      5. البكتيريا يصوتن بيليه في حين على الجليد لمدة 5 دقائق (مجموع الوقت المنقضي من 10 دقيقة).
        1. تعيين sonicator في 30٪ السعة مع نبض 30 ثانية on/30 ثانية قبالة.
        2. بوب أنبوب الطرد المركزي صعودا وهبوطا خلال الفترة الفاصلة صوتنة من أجل كسر تماما حتى بيليه الخلية. في نهاية مجموع الوقت المنقضي ينبغي ألا يكون هناك البكتيريا مرئية بيليه ترك مفتول العضلات، الطين اللزج.
        3. تنظيف التحقيق sonicator بين العزلة البروتين المختلفة وكذلك لتخزين باستخدام الايثانول 70٪ والماء عالى النقاء كما هو موضح في الخطوة 6.1.2.3.
        أجهزة الطرد المركزي في الطين 20،500 XG في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. نقل طاف لأنبوب جديد لعزل وتجاهل بيليه.
  10. ني NTA الانجذاب اللوني
    1. غير مواطن
      1. إضافة 1 مل ني 2 +-NTA الراتنج حل لكل أنبوب الطرد المركزي (2 مل مجموع الراتنج للثقافة 1.8 L)، واحتضان على RT لمدة 1 ساعة على الأقل على nutator.
      2. صب الطين في عمود النسب، والسماح حل لبالتنقيط من خلال صمام محبس تماما في دورق النفايات.
      3. تنفيذ 10 يغسل مع 10 مل من تحلل / غسل العازلة للكل غسل.
        1. ليغسل الأولين، إضافة إلى 10 مل أنبوب الطرد المركزي لإزالة الراتنج إضافية ثم تصب في العمود. يمكن إضافة يغسل إضافية مباشرة إلى العمود.
        2. بعد كل غسل، وإثارة الراتنج مع قضيب الزجاج التحريك. ، يمكن إضافة 10 مل القادم مرة واحدة تقطر غسل في دورق النفايات.
      4. بعد غسل تماما دكتورالمتكامله من خلال صمام محبس وثيق، وإزالة النفايات الكأس واستبدالها مع 50 مل أنبوب الطرد المركزي لجمع البروتين.
      5. إضافة 15 مل من شطف العازلة (الجدول 1) ويحرك المتابعة الراتنج، مما يتيح حل للجلوس لمدة 5 دقائق. فتح صمام محبس وشطف جمع. أكرر مرة أخرى مع 15 مل إضافية.
    2. محلي
      1. اتبع غير مواطن تقارب اللوني أعلاه (خطوات 6.2.1.1-6.2.1.4) باستثناء ضبط المعلمات التالية:
        1. احتضان ني 2 +-NTA الراتنج الحل في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل على nutator.
        2. استخدام الاحتياطي اغسل المناسبة (الجدول 1).
      2. إضافة 5 مل من شطف العازلة (الجدول 1)، واحتضان مع الراتنج لمدة 5 دقائق.
        1. وقد مقطر مفتوحة صمام محبس وجمع شطف حتى أكثر من الحل من خلال.
        2. إضافة 90 ميكرولتر / جيد برادفورد كاشف لمسح وحة 96 جيدا. بعد كل شطف سماح 10 ميكرولتر من ذلكlution أن يتقطر من العمود إلى جيدا تحتوي على 90 ميكرولتر كاشف برادفورد.
        3. متابعة إضافة 5 مل شطف العازلة في كل مرة إلى برادفورد مقايسة لم يعد بالكشف عن البروتين (اللون الأزرق الداكن غني عن لضوء أزرق لمسح). هذا عادة ما يستغرق 4-5 كميات شطف.
  11. غسيل الكلى / الإعادة الى الوضع السابق
    1. جعل غير الأصليين (استعادة الطبيعة) ومخازن غسيل الكلى الأصلي (الجدول 1) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يتم تحديد الرقم الهيدروجيني للمخازن غسيل الكلى من البروتين الهدف نقطة تساوي الكهربية (PI). كما يجب مخزنة قاعدة الإبهام من البروتينات واحدة على الأقل نقطة كاملة أعلاه أو أدناه القيم متزمت بهم.
    2. نقل elutions الأصلي وغير الأصليين لغسيل الكلى أنابيب مع قطع مناسبة الوزن الجزيئي (25،000 MWCO لNGF و50،000 MWCO لSEMA3A). وضع كل عينة البروتين في غسيل الكلى العازلة منها 1 لمدة 4 ساعة في 4 درجات مئوية ومن ثم استبدال العازلة منها أكثر من 2ليلة في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يحتاج بروتين أن مدال في كل العازلة لمدة 4 ساعة على الأقل لطوي ثانية السليم وتبادل العازلة لتأخذ مكان.
    3. تركيز البروتين مدال elutions إلى أقل من 5 مل باستخدام مركزات تدور أجهزة الطرد المركزي.
      ملاحظة: يمكن أن تزيد من البروتينات يمكن تنقيته باستخدام سريع البروتين السائل اللوني (FPLC) وتتركز مرة أخرى.
  12. تحديد تركيز البروتين (ملغ / مل) من خلال تجميد تجفيف عينة 10-50 مل في أنبوب microcentrifuge preweighed.
    1. اختياري: تحديد معامل الانقراض، ε، لذلك يمكن تحديد أن تركيز البروتين في العزلة المستقبل عن طريق قياس الامتصاصية لعينة في 280 نانومتر باستخدام قانون بير لامبرت في: C = A 280nm / εl، حيث l هو طول المسار.

7. Biotinylation من البروتين النقي

  1. Dialyze البروتينات في 10،000 MWCO أشرطة غسيل الكلى AGainst 10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني = 8.0)، وتغيير المخزن المؤقت كل ساعة 4 مع ما مجموعه 6 تغييرات.
  2. نقل البروتينات المؤتلف (الآن في 10 ملي تريس العازلة) إلى 2 مل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة لbiotinylation.
  3. البروتينات Biotinylate باستخدام يغاز عدة البروتين البيوتين.
  4. Dialyze البروتينات ضد برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.4) باستخدام 10،000 MWCO أشرطة غسيل الكلى مع 3 العازلة يتغير يوميا لمدة 2 ايام.
  5. تحديد biotinylation في المئة من البروتينات باستخدام عدة الكميات.
  6. تحديد تركيز مرة أخرى كما هو موضح في 6.4 وتخزينها في 4 درجة مئوية أو قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الاستنساخ واختبار التعبير

عندما يتم تنفيذ الطلاء بشكل صحيح، يجب مستعمرات معزولة واحد تشكيل لزيادة فرص نتف البكتيريا الخلايا تحولت نسيلي (الشكل 2A). ومع ذلك، إذا ومطلي عدد كبير جدا من الخلايا، يتم تحضين لوحات طويلة جدا عند 37 درجة مئوية أو التحول هو مشكوك فيه، المستعمرات قد تغطي لوحة أجار أو تشكيل مجاميع أكبر من الخلايا (أرقام 2B و 2C). أثناء اختبار التعبير، وقد حثت NGF وSEMA3A الأولى لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية وتحليل SDS-PAGE تحديد وتقع كل من البروتينات في جزء القابلة للذوبان (الشكل 2D). بدا التعبير البروتين عادلة، وبالتالي تم فحص آخر تعبير اختبار مع الحث بين عشية وضحاها في 18 درجة مئوية. أدى NGF في التعبير أفضل في جزء القابلة للذوبان، بينما لم يكن هناك فرق ملحوظ مع SEMA3A (الشكل 2E).

"> عزل وتنقية وBiotinylation

تم عزل كل من NGF وSEMA3A باستخدام تقنيات العزل الأصلي كما هو موضح في البروتوكول أعلاه وتعمل من خلال العمود FPLC لتنقية. بالإضافة إلى ذلك تم عزل هذه البروتينات المؤتلف وتنقيته nonnatively. على الرغم من NGF كان في جزء القابلة للذوبان خلال اختبار التعبير، أنتجت إجراءات العزل الأصلي العائد المنخفض من نيسان الخليج بعد كل من 37 درجة مئوية (4.57 ملغ / ثقافة الرئيسي من 2 L) و 18 درجة مئوية (6.11 ملغ / ثقافة الرئيسي من 2 L؛ الرقم 3A، وخطوط الصلبة) الحث. ومع ذلك، تم الحصول على عائدات أعلى من NGF من خلال العزلة غير مواطن مع استعادة الطبيعة (10.72 ± 1.8 ملغ / ثقافة الرئيسي من 2 L؛ الشكل 3A، خط متقطع) بعد 18 درجة مئوية، وتحريض بين عشية وضحاها. من ناحية أخرى، أدت العزلة غير مواطن في أي إنتاج SEMA3A (الشكل 3B، خط متقطع) مع 8.61 ± 3.1 ملغ / ثقافة الرئيسي من 2 L لعزل الأم (الشكل 3 B، خط الصلبة). ونتيجة لذلك، تم عزل NGF في ظل ظروف غير مواطن بعد الاستقراء بين عشية وضحاها في 18 درجة مئوية، في حين خضع SEMA3A العزلة الأم بعد 4 ساعات من الحث على 37 درجة مئوية. جمعت قمم FPLC، وجرى تحليل عينات NGF وSEMA3A مع SDS-PAGE (الشكل 3). جمعت قمم البروتين إضافية تم العثور عليها في إخراج FPLC لSEMA3A (الشكل 3B) وتحليلها مع SDS-PAGE، ولم يقع في المنطقة SEMA3A الوزن الجزيئي. هذه الكسور هي منتجات تدهور على الأرجح لأنهم لم يتصرفوا وظيفيا في المقايسات خلية مقرها كما فعلت الذروة SEMA3A مبين في الشكل 3B. تم المعقدة البيروكسيديز البروتينات باستخدام انزيم البيرة ومدال لإزالة أي نوع من الأنواع غير المتفاعل. وأكد Biotinylation مع مجموعة البيوتين الكمي والفلورسنت قارئ صفيحة ميكروسكوبية.

ftp_upload/51295/51295fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51295/51295fig1.jpg "/>
الشكل 1. هندسة البروتين والاستفادة E. نظام التعبير القولونية. العملية الأساسية من البروتين المؤتلف الهندسة ينطوي على تصميم البلازميد لالاستنساخ والتعبير في E. القولونية. ويتم اختيار المستعمرات تحولت مع استخدام المضادات الحيوية. وتستخدم تعبيرات اختبار صغير لتحسين وتحديد الإنتاج والذوبان من البروتين الهدف. يتم تحجيم متابعة هذا الإجراء لالزراعات دفعة كبيرة (حجم لتر). وتستخدم أساليب اللوني لعزل وتنقية البروتين المهندسة المطلوب. التعديلات مثل biotinylation يمكن أن تحدث أثناء أو بعد الزراعات دفعة تنقية.

الرقم 2
الشكل 2. O ptimizing اختبار التعبير عن NGF وSEMA3A. (A) تصفيح 25 ميكرولتر من تحول E. أدى الخلايا القولونية K12 في مستعمرات صغيرة معزولة. وينبغي اختيار مستعمرة الفردية لاختبار التعبير. لخلايا BL21 ينبغي أن يحدث تحول توزيع مستعمرة مماثلة. (BC) تصفيح 50 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من الخلايا K12، على التوالي، أدت الزيادة السكانية في المستعمرات البكتيرية. يمكن أن نتف من هذه اللوحات يؤدي إلى انخفاض احتمال اختيار مستعمرة المستمدة من خلية واحدة تتحول. وقد حثت (D) التعبيرات اختبار الخلايا تحولت لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية مع IPTG، ويظهر SDS-PAGE أن البروتين الانصهار NGF (29 كيلو دالتون) وSEMA3A انصهار بروتين (91 كيلو دالتون) يتم التعبير عنها في جزء القابلة للذوبان. (E) الاستقراء بين عشية وضحاها في 18 درجة مئوية يظهر NGF التعبير لا يزال في جزء القابلة للذوبان، ولكن، لا يتم التعبير عن تعزيز SEMA3A.

في صفحة = "دائما"> الرقم 3
الشكل 3. تنقية NGF وSEMA3A باستخدام FPLC. (A) العزلة غير مواطن بعد 18 ° C الاستقراء بين عشية وضحاها (خط متقطع) أسفرت عن عائدات NGF أفضل بالمقارنة مع العزلة الأم في كل 4 ساعات، 37 درجة مئوية، وبين عشية وضحاها، الحث 18 ° C (خطوط الصلبة). (B) للSEMA3A، والحث على 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات وحالة العزلة الأم تنتج عوائد أفضل بالمقارنة مع العزلة غير الأصليين في نفس المعلمات زراعة. يظهر SDS-PAGE مجموعات الذروة FPLC (السهام) لكل من (A) NGF و (ب) SEMA3A. تم تشغيل معيار الترشيح هلام بروتين لتأكيد توزيع الوزن الجزيئي للقمم ويشار في الخلفية من المؤامرات FPLC في كيلو دالتون.

العزلة العازلة مكونات
غير مواطن تحلل / غسيل 6 M GuHCl، 100 ملي H 2 نابو 4 و 10 ملي تريس قاعدة، 10 ملي إيميدازول؛ درجة الحموضة = 8.0
شطف 6 M GuHCl، 200 ملي حمض الخليك الجليدية (17.4 M)
غسيل الكلى (الإعادة الى الوضع السابق) الفوسفات عازلة المالحة (PBS):
21.7 ملم ناه 2 ص 4، 15.3 ملي نا 2 هبو 4، 149 ملي مول كلوريد الصوديوم
1 العازلة: PBS، 0.2 M GuHCl، 1.99 ملي dithiothreitol (DTT) في 4 لتر ​​ماء عالى النقاء؛ درجة الحموضة = 7.4
العازلة 2: برنامج تلفزيوني في 4 لتر ​​ماء عالى النقاء؛ درجة الحموضة = 7.4
محلي تحلل 50 ملي ناه 2 ص 4، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي إيميدازول؛ درجة الحموضة = 8.0
غسل 50 مليناه 2 ص 4، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي إيميدازول؛ درجة الحموضة = 8.0
شطف 50 ملي ناه 2 ص 4، 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 250 ملي إيميدازول؛ درجة الحموضة = 8.0
غسيل الكلى الفوسفات عازلة المالحة (PBS):
21.7 ملم ناه 2 ص 4، 15.3 ملي نا 2 هبو 4، 149 ملي مول كلوريد الصوديوم
1 العازلة: PBS، 1.99 ملي DTT في 4 لتر ​​ماء عالى النقاء؛ درجة الحموضة = 7.4
العازلة 2: برنامج تلفزيوني في 4 لتر ​​ماء عالى النقاء؛ درجة الحموضة = 7.4

الجدول 1. المؤتلف المخازن عزل بروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المؤتلف هندسة البروتينات هي تقنية قوية جدا التي تمتد العديد من التخصصات. أنها فعالة من حيث التكلفة، والانضباطي إجراء بسيط نسبيا، مما يسمح إنتاج غلة عالية من البروتينات مصمم خصيصا. من المهم أن نلاحظ أن تصميم والتعبير عن البروتينات المستهدفة ليست دائما واضحة. التعبير القاعدية والاستقرار البروتين المؤتلف تعتمد على الخيارات المحددة للناقلات، E. سلالات القولونية الخلية، الببتيد علامة الاضافات والمعلمات زراعة. يستخدم لدينا معايير التصميم المحددة E. راسخة القولونية سلالات للهندسة البروتين. بالإضافة إلى ذلك، ناقلات البلازميد يحتوي على T7 المروج أمريكا اللاتينية والكاريبي والأمبيسلين الجينات المقاومة لمستقر المؤتلف التعبير البروتين.

بعد الحصول على البلازميد subcloned العالية النقاء، وهو أول إجراء رئيسي هو تحويل بنجاح البروتين المستهدف في الخلية المضيفة وتحديد ذوبانالبروتين. عبارات الاختبار هي أفضل وقت لتحسين توليف البروتين الهدف. من المهم أن نتف، مستعمرات صغيرة معزولة (الشكل 2A) لضمان أفضل اختيار للخلايا البكتيريا التي تحتوي على البلازميد. استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها مثل restreaking لإعادة توزيع المستعمرات أو احتضان لوحات أجار لفترات زمنية أقصر يمكن أن تساعد في التكوينات مستعمرة أفضل. فإنه ليس من المستغرب أن إنتاج البروتين المؤتلف يدفع الضغط على سلالة المضيف 36. خلال هذه المرحلة إذا التعبير والفقراء، وعوامل مثل المضادات الحيوية والتركيز IPTG وكذلك الحث الوقت ودرجة الحرارة يمكن تعديلها لتحقيق الهدف الأمثل البروتين (للاستعراضات رؤية 37-38). واعتبر هذا لNGF حيث أدى أفضل تعبير من تحريض بين عشية وضحاها في 18 ˚ C (الشكل 2E).

أدى SEMA3A في إنتاج البروتين للظروف المحلية ولكن nonnativأظهر البريد العزلة أي إنتاج البروتين (الشكل 3B). وقد حثت الثقافات الرئيسي لنيسان الخليج لمدة 4 ساعة عند 37 ˚ C وكذلك بين عشية وضحاها في 18 ˚ C ومعزولة في ظل ظروف الأصلي. أنتجت تنقية FPLC عائد أقل من NGF مقارنة مع الثقافات الرئيسية التي تم عزلها nonnatively بعد الاستقراء بين عشية وضحاها في 18 ˚ C (الشكل 3A). ويعتقد أن تشكيل البروتينات في الهيئات إدراج عموما أن يكون غير مرغوب فيه منذ استعادة الطبيعة في بعض الأحيان صعبة وغير ناجحة دائما. وقد أدى ذلك إلى تطوير تقنيات لتعزيز البروتين الذوبان بما في ذلك إضافة تسلسل البروتين للذوبان 39-41. ومع ذلك، فقد ثبت البروتينات لامتلاك أشكال الدول متعلق بتكوين بينما معزولة في الهيئات إدراج، والمعلمات مثل انخفاض درجات الحرارة الاستقراء تساعد على الحفاظ على هذه الهياكل النشطة 42-46. عندما البروتين لا يمكن التعبير عنها في شكل غير قابل للذوبان من الممكن عادة لإعادةطبيعة البروتين بعد العزل باستخدام تقنيات بسيطة مع فقدان العائد القليل جدا ونحن قد ذكرت سابقا 21.

أظهرنا كيفية مهندس بنجاح وإنتاج البروتينات biotinylatable باستخدام E. القولونية الاستنساخ ونظام التعبير بوصفها البلد المضيف ذات العوائد حوالي 8-10 ملغ / ثقافة الرئيسي من 2 L. ومن المهم أن نلاحظ أن تسلسل الأحداث الكلي لا يزال هو نفسه عند إنتاج البروتينات المؤتلف جديدة (الشكل 1)، ولكن كل حسب الطلب ينبغي أن يعامل البروتين المحرز في كل حالة على حدة لتحديد كيفية إنتاج تحديدا أعلى عائد من المنتجات النقية. أظهرنا كيف NGF وSEMA3A تتصرف بشكل مختلف في نظام زراعة نفس وكيفية تحسين إنتاجها. بالإضافة إلى ذلك، ونحن في الوقت الحاضر استخدام E. أخرى كولاي سلالة B المضيفة التي يمكن biotinylate في الجسم الحي 47 لغيرها من البروتينات المستهدفة، مما يدل على أهمية stayinز مطلعة على التطورات والتعديلات الجارية بشأن المؤتلف الهندسة البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أنوه جامعة أكرون لتمويل التي دعمت هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% Chem-Impex International 127 100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol Chem-Impex International 642 250 ml
Acetic acid, glacial EMD AX0073-9 2.5 L
Agar Bioshop AGR001.500 500 g
Ampicillin sodium salt  Sigma-Aldrich A9518 25 g
Antifoam 204 Sigma-Aldrich A6426 500 g
Barstar-NGF pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 1 ml; Expression Host
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916 500 ml
BugBuster Novagen 70922-3 100 ml
Gel filtration standard Bio-Rad 151-1901 6 vials
Glycerol Bioshop GLY001.1 1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride Chem-Impex International 152 1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88222 100 ml
Hydrochloric acid EMD HX0603-3 2.5 L
Imidazole  Chem-Impex International 418 250 g
IPTG Chem-Impex International 194 100 g
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface Chem-Impex International 270 500 g
LB Broth   Sigma-Aldrich L3022 1 kg
NovaBlue Competent Cells Novagen 69825 1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK 10 pack
Potassium Chloride Chem-Impex International 01247 1 kg
Sema3A-pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 1 L
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG 1 kg
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 500 g
Sodium phosphate diabasic Sigma-Aldrich S5136-500G 500 g
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 500 g
Terrific Broth Bioshop TER409.5 5 kg
Tetracycline hydrochloride Chem-Impex International 667 25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x Bio-Rad 1610732 1 L
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503 1 kg
Tryptone, pancreatic EMD 1.07213.1000 1 kg
Yeast extract, granulated EMD 1.03753.0500 500 g
 ÄKTApurifier10 GE Healthcare 28-4062-64 Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000 MAXQ 4000
BirA500 Avidity BirA500 Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette Thermo Scientific 66380 Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories 132127, 132129 MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923 GE Healthcare 11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit Invitrogen 1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C GE Healthcare 18-6083-13
Fraction Collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00 Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator  VWR 13271-102 Model 1156D
Heating Oven FD Series Binder Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg GE Healthcare 17-1069-01 Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge Beckman Coulter 393126
JA 25.50 Rotor Beckman Coulter 363055
JLA 8.1 Rotor Beckman Coulter 969329 Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor Beckman Coulter 368690
Laminar Flow Hood Themo Scientific 1849 Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader TECAN infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8004 4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels Bio-Rad 456-9036 Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column Bio-Rad 737-2512 49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit Omega Bio-Tek D6943-01
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 164-5052 250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes VWR 3119-0050 50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators Corning 431488, 431483  20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service GenScript USA Inc. Protein Services
Ultrasonic Processor  Cole-Parmer 18910445A Model CV18
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236 Model G560

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
  2. Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).
  3. Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).
  4. Sengupta, D., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).
  5. Kamionka, M. Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli. Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).
  6. Rao, A. G. The outlook for protein engineering in crop improvement. Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).
  7. Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).
  8. Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes. Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).
  9. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), (2011).
  10. McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).
  11. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli. B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).
  12. Novagen pET System Manual. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).
  13. Balbas, P., Bolivar, F. Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli. Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).
  14. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).
  15. Dubendorff, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  16. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
  17. Tucker, J., Grisshammer, R. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).
  18. Schatz, P. J. Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli). Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
  19. Anfinsen, C. B. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181 (4096), 223-230 (1973).
  20. Villaverde, A., Carrio, M. M. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).
  21. Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).
  22. Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate. J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).
  23. Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. 3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds. PLoS One. 7 (11), (2012).
  24. McCormick, A. M., Leipzig, N. D. Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).
  25. Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. High-throughput biotinylation of proteins. Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).
  26. Bayer, E. A., Wilchek, M. Protein biotinylation. Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).
  27. Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science. 243 (4887), 85-88 (1989).
  28. Chen, I., Ting, A. Y. Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).
  29. Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).
  30. Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies. Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).
  31. Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane. J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).
  32. Cull, M. G., Schatz, P. J. Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags. Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).
  33. Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds. Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).
  34. Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials. Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).
  35. Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions. Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).
  36. Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli. Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).
  37. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).
  38. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  39. Marston, F. A. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).
  40. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).
  41. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  42. de Groot, N. S., Ventura, S. Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies. FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).
  43. Ventura, S., Villaverde, A. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).
  44. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).
  45. Peternel, S., Komel, R. Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells. Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).
  46. Garcia-Fruitos, E. Inclusion bodies: a new concept. Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).
  47. Li, Y., Sousa, R. Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation. Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 83، والهندسة البروتين، وإنتاج البروتين المؤتلف، AviTag، البيرة، biotinylation، نظام PET ناقلات،
التعبير، والعزلة، وتنقية القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان البيروكسيديز البروتينات لتجديد الأنسجة العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCormick, A. M., Jarmusik, N. A.,… More

McCormick, A. M., Jarmusik, N. A., Endrizzi, E. J., Leipzig, N. D. Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (83), e51295, doi:10.3791/51295 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter