Summary
Développer des protéines de fusion biotinylatable a de nombreuses applications potentielles dans différents domaines de recherche. Recombinant ingénierie des protéines est une procédure avant droite qui est rentable, offrant des rendements élevés de protéines sur mesure.
Abstract
Recombinant ingénierie des protéines a utilisé Escherichia coli (E. coli) systèmes d'expression pour près de 4 décennies, et aujourd'hui E. coli est toujours l'organisme d'accueil le plus largement utilisé. La flexibilité du système permet l'ajout de groupements tels que une étiquette de biotine (pour les interactions de streptavidine) et des protéines fonctionnelles plus grands comme protéine fluorescente verte ou cerise protéine rouge. De plus, l'intégration des acides aminés non naturels tels que des chélateurs d'ions métalliques, les groupes fonctionnels réactifs de manière unique, des sondes spectroscopiques, et des molécules conférant des modifications post-traductionnelles a permis une meilleure manipulation des propriétés de protéines et de fonctionnalités. En conséquence, cette technique crée des protéines de fusion personnalisables qui offrent une grande utilité pour les différents domaines de recherche. Plus spécifiquement, la séquence de la protéine biotinylatable a été incorporé dans de nombreuses protéines cibles en raison de l'interaction de haute affinité entre la biotine avec l'avidine et la streptavidine. Cet ajout a aidé à améliorer la détection et la purification de protéines marquées ainsi que l'ouverture de la voie à des applications secondaires telles que le tri de cellules. Ainsi, les molécules de biotine montrent une influence croissante et généralisée dans les domaines bio-industrielles et biomédicales. Aux fins de notre recherche, nous avons conçu des protéines de fusion recombinantes biotinylé contenant le facteur de croissance des nerfs (NGF) et semaphorin3A (Sema3A) régions fonctionnelles. Nous avons indiqué précédemment comment ces protéines de fusion biotinylée, avec d'autres séquences de protéines actives, peuvent être attachés à des biomatériaux pour l'ingénierie des tissus et à des fins de régénération. Ce protocole définit les principes de base de protéines de biotinylatable d'ingénierie à l'échelle du milligramme, en utilisant un lac vecteur inductible T7 et E. hôtes d'expression coli, à partir de la transformation à l'échelle et la purification.
Introduction
Protéines couvrent une large gamme de biomolécules qui sont responsables de nombreuses fonctions biologiques, conduisant finalement à la formation de tissu propre et de l'organisation. Ces molécules lancer des milliers de voies qui contrôlent la régulation et / ou la régulation de gènes et d'autres protéines de signalisation, maintien de l'équilibre dans le corps humain. Perturbation d'une seule protéine affecte l'ensemble de ce réseau de signaux, ce qui peut conduire à l'apparition de troubles ou de maladies dévastatrices. Ingénierie des protéines individuelles dans le laboratoire propose une solution pour lutter contre ces effets indésirables et offre une alternative aux médicaments à petites molécules. En 1977, un gène codant pour la séquence de la somatostatine 14 d'acides aminés a été l'un des premiers polypeptides modifiés créés à l'aide de E. coli 1. Peu de temps après, en 1979, l'insuline a été cloné dans le plasmide pBR322, transformé, a exprimé, et purifié 2. Depuis lors, des protéines recombinantes ont étendu leur influence à de multiples domaines de resecherche tels que les biomatériaux, l'administration de médicaments, l'ingénierie tissulaire, les produits biopharmaceutiques, de l'agriculture, des enzymes industrielles, les biocarburants, etc (pour avis voir les références 3-8). Ceci est largement dû à la souplesse que la technique propose via l'addition de l'application des fragments chimiques spécifiques ou des séquences de protéines à des fins, y compris, mais sans s'y limiter, l'identification de la protéine cible, de stabilisation et de purification.
Via la technologie de l'ADN recombinant, des protéines recombinantes peuvent être exprimées dans une variété de systèmes hôtes eucaryotes et procaryotes, notamment de mammifères, de plantes, d'insectes, de levures, de champignons ou de bactéries. Chaque hôte offre des avantages différents et généralement le meilleur système est déterminée sur la base de la fonction des protéines, le rendement, la stabilité, le coût global, et l'évolutivité. Des cellules de bactéries manquent souvent des mécanismes de modifications post-traductionnelles qui fournissent des hôtes eucaryotes (par exemple glycosylation, le disulfure de pontage, e tc.) 5. En conséquence, les systèmes de mammifères et d'insectes aboutissent généralement à une meilleure compatibilité et l'expression de protéines eucaryotes, mais ces hôtes sont généralement plus coûteux et prend du temps 9. Par conséquent, E. coli est l'hôte privilégié pour notre système d'expression parce que les cellules se développent rapidement dans des conditions de croissance peu coûteux et les mécanismes d'expression génétique sont bien comprises de 5,9. En outre, ce système est facile à l'échelle supérieure à des fins de production et les résultats dans les protéines fonctionnelles en dépit de l'absence de modifications post-traductionnelles 10. Le E. souche de E. coli K12 est choisi dans ce protocole pour le clonage, car cette souche offre d'excellents rendements en plasmide basé sur l'efficacité de transformation élevées. En outre, un E. souche de E. coli BL21 est utilisé pour l'expression, car cette souche hôte contient le gène d'ARN polymerase de T7, qui fournit l'expression des protéines et la stabilité contrôlée 11.
tente "> Après la sélection de l'hôte, en outre il faut prendre soin dans le choix du vecteur d'expression idéal pour faciliter l'expression de la protéine choisie et contrôlée. synthèse de protéines recombinantes commence par une séquence d'ADN cible qui est clonée sous la direction du bactériophage transcription de T7 et de signaux de traduction, et l'expression est induite dans des cellules hôtes contenant des copies chromosomiques du gène de l'ARN polymerase T7 12. Ces vecteurs, dérivés de pBR322 du vecteur plasmidique (pour une revue, voir la référence 13), sont étroitement contrôlée par le promoteur T7 initialement développée par Studier et al 14 et de fournir plus d' contrôle grâce à l'inclusion de l'opérateur lac et le répresseur lac (LAC1) 15,16. Pour l'ingénierie des protéines recombinantes, ce système d'expression offre la possibilité d'adapter une séquence d'acides aminés spécifique d'une protéine souhaitée par l'insertion des séquences d'ADN cibles ou pour créer des protéines de fusion composée de domaine combinéss de protéines simples. En outre, certaines séries de vecteurs comprennent des modifications de points de peptides à être mis sur le N ou C-terminale. Pour nos besoins de conception, une histidine (His) tag a été ajouté à la séquence cible d'ADN pour une purification et une séquence biotinylatable 15 d'acides aminés a été inclus pour la biotinylation 17,18. Dans ce protocole, un plasmide contenant un gène de résistance à l'ampicilline, a été choisi pour réaliser nos séquences de protéine de fusion biotinylatable. L'expression est contrôlée dans ce vecteur par l'intermédiaire du promoteur lac de T7 et est facilement induite par isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).expressions de test (cultures à petite échelle) sont utilisés pour déterminer la présence et la solubilité de la protéine cible, qui peut être exprimée soit sous forme soluble ou insoluble à formuler des procédures de purification. Une protéine soluble exprimé dans la cellule de bactérie subira pliage spontané de maintenir sa structure native 19. Typiquement, le natifla structure est thermodynamiquement favorable. Dans de nombreux cas, l'activité métabolique de l'hôte n'est pas propice à la protéine cible, en mettant l'accent sur le système qui conduit à la production de la protéine insoluble et la formation de corps d'inclusion constitués d'agrégats de protéines insolubles. Ainsi, la protéine cible dénature, ce qui les rend généralement biologiquement inactif 20. Les deux expressions de test sont mis à l'échelle en place, les procédures d'isolement et sont déterminées par la solubilité de la protéine cible. Une renaturation ou étape de repliement supplémentaire est nécessaire pour les protéines insolubles. Les protéines recombinantes résultantes peuvent en outre être purifiés en utilisant une Chromatographie d'exclusion de taille.
Dans la maison de production de protéines recombinantes offre des avantages de coûts par rapport aux produits commerciaux depuis milligrammes de protéine cible peut être isolé par litre de culture principale. La plupart de l'équipement nécessaire est disponible dans un laboratoire biologique ou chimique typique. L'ingénierie des protéines permet la créationde protéines de fusion personnalisé avec des fonctionnalités supplémentaires qui ne sont pas toujours disponibles dans le commerce. Figure 1 illustre les principales procédures liées à des protéines recombinantes de l'ingénierie. Avec ce système d'expression, nous avons créé de nombreuses protéines biotinylatable, telles que l'interféron-gamma, le facteur de croissance dérivé des plaquettes, et d'os protéine morphogénétique 21-23, mais nous allons nous concentrer sur deux protéines que nous avons conçu pour le guidage axonal, NGF (29 kDa ) et Sema3A (91 kDa) 10 (pour revue voir référence 24). La biotinylation est une technique courante pour l'identification, l'immobilisation et l'isolement des protéines marquées en utilisant la biotine-streptavidine bien connu interaction 25-27. Sondes biophysiques 28,29, biocapteurs 30, et 31 points quantiques sont des exemples de systèmes qui utilisent la haute affinité de la conjugaison de biotine-streptavidine avec un Kd de l'ordre de 10 -15 M 27. Le E. bio coliétain ligase, BirA, aide à la fixation covalente de la biotine à la chaîne latérale de la lysine trouvé à l'intérieur de la séquence étiquetée biotine 18,32. Tethering biotine à des matériaux et des biomolécules a produit une distribution soutenue des facteurs de croissance à la cellule pour de multiples applications de génie tissulaire 21,33-35. Par conséquent, l'ingénierie des protéines biotinylatable conçu sur mesure est un outil puissant qui peut transcender les intérêts de recherche multiples.
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Protocol
Une. Conception de la protéine cible
- Utilisation du Centre national pour le site Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) obtenir une séquence d'acides aminés de la protéine cible en tenant compte des espèces d'intérêt et des variants d'épissage. Sélectionner la séquence d'acides aminés qui correspond à la région active d'intérêt de la protéine.
Remarque: Pour Sema3A, acides aminés 21-747 ont été choisis. Une protéine de fusion a été conçu avec NGF, où la séquence de barstar, l'acide aminé 1 à 90, a été ajouté à du NGF acides aminés 122 à 241. - Pour les N-terminale ajouter les séquences de suivi: 6X-His tag pour la purification (HHHHHH), le tabac Etch Virus (TEV) protéase du site de coupure pour l'enlèvement de son étiquette (ENLYFQG), biotine marqué séquence de biotinylation de protéines à K (GLNDIFEAQKIEWHE) et charnière flexible avec des écarts qui permettront de place pour le repliement correct de la protéine (EFPKPSTPPGSSGGAP).
Note: Ces séquences peuvent varier en fonction de la prot de fusion désiréeein. - Envoyer la séquence d'acides aminés complète d'une entreprise de gène conception / optimisation pour les espèces hôtes souhaitées et de la synthèse. Sous-cloner dans un vecteur de choix en utilisant le site BamHI-Notl en utilisant un kit ou en utilisant les services commerciaux.
2. Faire des plaques de gélose
Remarque: Il est très important que tous les stocks d'antibiotiques, des plaques, des tampons, etc sont stockés correctement (température et durée) et restent libres de protéases (stérilisé).
- Peser agar à 1,5% en poids et le bouillon de lysogénie (LB) à 20 g / L et le placer dans une bouteille de médias de verre. Une bouteille de 500 ml permet environ 15 plaques.
- Volumétrique ajouter de l'eau ultra-pure, bien mélanger, et autoclave.
- Laissez bouteille froide au toucher et ajouter les antibiotiques appropriés. Éviter la solidification prématurée de gélose, mais si la bouteille se refroidit trop et solution commence à se figer, réchauffez au micro-ondes.
Note: Notre plasmide contient une résistance à l'ampicilline gene. Par conséquent, toutes les mesures doivent contenir de l'ampicilline à 100 ug / ml. Le E. coli souche K12 de clonage nécessite tetracycline (12,5 pg / ml) aux antibiotiques. Cellules bactériennes BL21 ne nécessitent aucun antibiotique supplémentaire. - Verser 25-30 ml de solution en 90 mm des boîtes de Pétri et laisser le temps de sécher.
- plat d'étiquettes avec des antibiotiques appropriés et magasin à l'envers dans 4 ° C, avec du Parafilm ou dans un sac refermable.
Remarque: Les plaques sont bons pour environ un mois.
3. Clonage de la biotine Tagged plasmide
Remarque: des conditions sont réalisées de manière aseptique.
- Isoler vecteur plasmidique à 6000 g pendant 3 min afin de sédimenter, et ajouter 10 ul d'eau ultra-pure stérilisée.
- Retirer 50 pi de E. chimiquement compétente coli cellules à haute efficacité de transformation de -80 ° C et placer immédiatement sur la glace pendant 5-10 min.
- Ajouter 1 pl de solution de vecteur à 0,5-1 ng/5056; l cellules à 50 pi E. coli cellules et placer le plasmide restant dans -80 ° C.
- Placer les cellules des bactéries contenant le vecteur de la glace pendant 5 min.
- Le choc thermique de la cellule et le mélange de vecteur pour 30-45 sec dans 42 cellules ° C de bain de l'eau et remettez sur la glace pendant 2 min.
- Ajouter 250 ul de super bouillon optimal avec la répression des catabolites (SOC) de support (2% p / v de bactotryptone, 0,5% p / v d'extrait de bacto-levure, NaCl 8,56 mM, KCl 2,5 mM, MgSO 4, 20, 20 mM de glucose , de l'eau ultra-pure; pH = 7.0) et agiter à 250 rpm à 37 ° C pendant 30 min.
Remarque: SOC ne doit pas être stérilisé à l'autoclave mais être stérilisé par filtration à travers un filtre de 0,22 um. - Plaques sèches 10-15 min avant étalement des cellules.
- Introduire à la pipette 25, 50, et 100 pl de solution de cellules sur des plaques de gélose séparées contenant l'ampicilline (100 ug / ml) et de tetracycline (12,5 pg / ml) des antibiotiques. Utilisation des billes de verre pour distribuer la solution uniformément sur des plaques de gélose. <li> incuber les plaques à l'envers à 37 ° C pendant 15-18 h.
- Voir les bactéries individuelles pour les petites colonies sur les plaques et de les stocker à l'envers à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure (Figure 2A).
- Si aucun colonies sont présentes:
- Vérifiez la fraîcheur et la stérilité des tampons et des fournitures.
- Augmenter la quantité de plasmide ajouté à E. souche de E. coli K12.
- Si de grandes colonies sont présents ou il ya une prolifération de colonies (figure 2B et 2C), restreak une nouvelle plaque de gélose en utilisant une boucle d'inoculation stérile ou cellules de la plaque à bas volume.
- Si aucun colonies sont présentes:
- Inoculer 5 ml de LB contenant de l'ampicilline (100 ug / ml) et de tetracycline (12,5 pg / ml) des antibiotiques avec une seule colonie de E. transformé cellules de E. coli. Cellules de grossissement jusqu'à la nuit à 37 ° C à 250-300 rpm.
- Le jour suivant, en utilisant un kit d'isolement de plasmide afin d'isoler le vecteur cible à partir du jour au lendemain grow-up et stocker plasmide purifié à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Facultatif: Vérifiez la pureté et la concentration de plasmide en utilisant l'absorbance lecture obtenue à 260 et 280 nm.
4. Transformation du plasmide d'expression dans l'hôte
Remarque: des conditions sont réalisées de manière aseptique.
- Répétez les étapes 03.02 à 03.10 pour E. coli BL21 cellules avec les modifications suivantes:
Remarque: Les cellules BL21 ne nécessitent pas d'autres antibiotiques, par conséquent, uniquement de l'ampicilline est ajoutée à des plaques de gélose pour la transformation.- Ajouter 2-5 ul de plasmide isolé à 0,5-2 ng/50 cellules pi de l'étape de 3,12 à 50 pi E. coli cellules hôtes d'expression.
- des cellules de choc thermique de 60 à 90 sec.
- Agiter solution contenant du milieu SOC à 250 tours par minute pendant 60 minutes au lieu de 30 min.
- Pincez une seule colonie de cellules bactériennes transformées à partir de la boîte de Pétri avec un monstreile bâton applicateur et placer dans un tube à essai contenant 5 ml de bouillon LB avec la concentration appropriée de l'ampicilline (100 pg / ml).
- Placer les tubes à essai dans un agitateur pendant une nuit à 37 ° C à 250 tpm.
- Le lendemain matin, prendre 200 pi de la nuit de grossissement et l'ajouter à 5 ml de LB contenant de l'ampicilline à 100 ug / ml.
- Congeler bas les cellules restantes avec 250 ul 50% de glycérol (stérile) à 750 pi culture et garder à -80 ° C.
Remarque: expression de test et New procédures d'intensification peut être fait en utilisant un bâton applicateur stérile pour obtenir un grattage de cellules congelées et en inoculant LB avec les antibiotiques appropriés. - Placer le tube à essai dans un agitateur à 250-300 tours par minute à 37 ° C jusqu'à ce que la densité optique (DO) est mesurée entre de 0,7 à 0,8 à une absorbance de 600 nm.
- Induire les cellules avec de l'IPTG à une concentration finale de 1 mM.
- Secouez pour un 4 heures supplémentaires à 37 ° C à 300 tpm. Sinon cellules peuvent égalementêtre secoué pendant une nuit à 18 ° C à 250-300 rpm. Ceci peut produire un rendement plus élevé du plasmide selon la protéine cible.
- Dodécyl sulfate de sodium sur gel de polyacrylamide L'électrophorèse (SDS-PAGE) d'analyse d'expression de test
- Prenez 500 pi de la culture et le placer dans un tube de 1,5 ml. Isoler à 13-15 g pendant 5 min. Décanter le liquide surnageant et étiqueter "soluble". Resuspendre le culot avec un vortex dans 200 ul de colorant de charge (50 pi de 2-mercaptoéthanol, un tampon d'échantillon de Laemmli 950 ul).
Remarque: Les bactéries granulés solubles seront utilisées afin de déterminer si la protéine recombinante est dans les régions cytoplasmiques des cellules bactériennes. Pellets peuvent être stockés dans -80 ° C sans charger colorant jusqu'à ce que nécessaire. Une culture des bactéries témoin qui n'a pas été transformée ou induite peut être considéré comme soluble aussi bien pour la comparaison. - Prenez 1000 pi de la culture et le placer dans un tube de 1,5 ml. Isoler à 13-15 g pendant 5 min.Décanter le liquide surnageant et étiqueter "insoluble".
Remarque: Les granulés insolubles seront soumis à des procédures de dénaturation ci-dessous afin de libérer des protéines présentes dans les corps d'inclusion de cellules bactériennes. Les pellets peuvent être stockés dans -80 ° C jusqu'à utilisation. Une culture des bactéries témoin qui n'a pas été transformée ou induite peut être considéré comme insoluble aussi bien pour la comparaison.- Reprendre le culot insoluble dans 200 pi BugBuster et le laisser à température ambiante pendant 30 min.
- Isoler échantillon de nouveau à 13-15 g pendant 5 min et prendre 50 pi de surnageant et ajouter à nouveau "insoluble" 1.5 ml tube.
- Ensuite, ajouter 50 ul de colorant de charge de ce nouvel échantillon.
- Faire bouillir les échantillons solubles et insolubles pendant 5 min pour dénaturer les protéines pour l'analyse SDS-PAGE.
- Chargez chaque échantillon en gel d'électrophorèse avec une échelle.
- Afin de visualiser les échantillons de protéines utilisent un staining réactif et suivre le protocole de l'entreprise.
- Déterminer si la protéine s'exprime dans les fractions solubles et / ou insolubles en comparant ces deux voies ainsi que la comparaison des voies à des voies de contrôle solubles et insolubles (voir Note 4.9.1 et 4.9.2) sur le gel SDS-PAGE (figure 2). Une bande foncée doit apparaître autour de la masse moléculaire de la protéine dans les voies solubles ou insolubles. Cela permettra de déterminer qui isolement procédure à utiliser dans le protocole 6.
Remarque: Si il ya une bande dans ces deux régions que soit l'isolement utilisé dans le protocole 6 ci-dessous peut être réalisée, ou la protéine peut être isolé dans les deux sens afin de déterminer la méthode d'isolement produit un rendement plus élevé de protéine recombinante (figure 3) . - Si une heure et nuit induction 4 a été effectuée, de déterminer la méthode d'induction a la production la plus élevée de protéines pour la mise à l'échelle processus (Figure 2).
5. Mise à l'échelle procédure et principal Culture - Prenez 500 pi de la culture et le placer dans un tube de 1,5 ml. Isoler à 13-15 g pendant 5 min. Décanter le liquide surnageant et étiqueter "soluble". Resuspendre le culot avec un vortex dans 200 ul de colorant de charge (50 pi de 2-mercaptoéthanol, un tampon d'échantillon de Laemmli 950 ul).
- Préparer des milieux de croissance avec 85,7 g de Terrific Broth et 28,8 ml de glycérol à 50% dans 1,8 L d'eau ultra pure et autoclave sur le cycle liquide pendant 1 heure.
- Lancer une culture de nuit stock de cellules congelées créé à l'étape 4.5.
Remarque: des conditions sont réalisées de manière aseptique.- Mélanger 20 ml de LB et avec une concentration finale d'ampicilline à 100 ug / ml dans une fiole d'Erlenmeyer de 125 ml stérile.
- L'utilisation d'un bâton applicateur stérile prendre une démolition de transformer E. coli et les cellules applicateur de goutte dans le ballon. Retirez l'applicateur bâton et bouchon flacon avec bouchon de mousse ou de coton et couvrir de papier d'aluminium pour maintenir la stérilité.
- Agiter pendant une nuit à 250 tours par minute à 37 ° C.
- Culture principal
Remarque: des conditions sont réalisées de manière aseptique.- Verser culture d'une nuit dans 1,8 L de milieu de croissance stérile et ajouter de l'ampicilline à 100 pg / ml et 6 à 8 gouttes d'antimousse stérile 204 en utilisant une pipette Pasteur.
- Placer les cultures dans un bain d'eau à 37 ° de 0,2 mm avec filtrés bullage d'air comprimé dans les cultures par des pierres d'aération.
- Une fois la DO 600nm atteint 0,7-0,8, induire l'IPTG (1 mM) et permet l'induction de se produire soit pour 4 heures à 37 ° C ou une nuit à 18 ° C, en fonction des résultats solubles / insolubles de SDS-PAGE à l'étape 4.9.
- Collecte E. Les cellules E. coli
- Centrifuger la culture de cellules dans une bouteille de centrifugeuse (L 2 bouteilles / culture) pendant 15 min à 14 000 xg à 4 ° C.
- Verser le surnageant et aide d'une spatule mince, ramassent les bactéries granulés en deux tubes de 50 ml. Les cellules peuvent être à nouveau rassemblées en un culot par centrifugation pendant quelques minutes.
Remarque: chaque culture 1,8 L se traduira par deux pastilles de bactéries, une dans chaque tube à centrifugation de 50 ml. - Rangez les granules en -80 ° C jusqu'à ce que l'isolement de la protéine.
- Lyse cellulaire
- Non indigènes
- Retirer transformé E. coli culot de -80 ° C freezer, et ajouter 20 ml de lyse / tampon de lavage (tableau 1) pour chaque tube de la centrifugeuse.
- Vortex et agiter le culot congelé jusqu'à ce qu'il dégèle et solubilise dans la solution tampon sans les gros morceaux. Incuber sur nutator nuit. Le matin suivant, le culot doit maintenant être une bouillie visqueuse due à la dénaturation de la protéine à partir de la mémoire tampon.
- Centrifuger la suspension à 20 500 x g à température ambiante pendant 30 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube pour isoler et éliminer le culot.
- Obtenir transformé E. coli culot de -80 ° C au congélateur.
- Ajouter tampon de lyse (Tableau 1) pour tube à centrifuger pour atteindre un volume final de 30 ml, et déloger culot congelé par vortex et en agitant de façon rigoureuse. Placez pastille sur la glace.
- Laver sonicator sonde avec 70% d'éthanol à 100% d'amplitude pendant 1-2 min. Ensuite, répétez avec de l'eau ultra-pure.
- Bactéries soniquer granulés alors que sur la glace pendant 5 minutes (temps total écoulé de 10 min).
- Réglez appareil à ultrasons à 30% d'amplitude par impulsions de 30 secondes on/30 sec éteint.
- Bob tube de centrifugeuse de haut en bas pendant l'intervalle de traitement aux ultrasons afin de rompre complètement le culot cellulaire. A la fin de la durée totale écoulée il devrait y avoir aucune bactérie granulés laissant visibles, une suspension visqueuse filandreux.
- Nettoyez la sonde de sonication entre les différents isolats de protéines ainsi que pour le stockage en utilisant 70% d'éthanol et de l'eau ultra-pure, comme décrit à l'étape 6.1.2.3.
- Non indigènes
6. Isolement et purification de protéine recombinante
Remarque: Si la protéine est situé dans la région soluble à base de SDS-PAGE Analyse de l'étape 4.9, puis "Isolation maternelle" sera utilisé, mais pour les protéines insolubles procédures "d'isolement non indigènes" sera exécutée.
- Non indigènes
- Ajouter 1 ml de Ni2 +-NTA de solution de résine dans chaque tube de centrifugeuse (2 ml au total de résine pour une culture de 1,8 L) et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h à nutator.
- Verser suspension dans la colonne d'affinité et laisser la solution coule par le robinet d'arrêt complètement dans les déchets bécher.
- Effectuer 10 lavages avec 10 ml de Lysis / tampon de lavage pour chaque lavage.
- Pour les deux premiers lavages, ajouter les 10 ml au tube de centrifugeuse pour éliminer la résine supplémentaire, puis versez dans la colonne. Les lavages supplémentaires peuvent être ajoutés directement à la colonne.
- Après chaque lavage, mélanger la résine avec un agitateur de verre. Une fois le lavage s'écoule dans le récipient de déchets, les 10 ml suivants peuvent être ajoutés.
- Après laver complètement drips travers, fermer le robinet du robinet, enlever les déchets bécher et le remplacer par 50 ml tube de centrifugeuse pour la collecte de la protéine.
- Ajouter 15 ml de tampon d'élution (Tableau 1) et remuez-up résine, permettant à la solution reposer pendant 5 min. Ouvrir le robinet d'arrêt et élution de collecte. Répétez avec un supplément de 15 ml.
- Indigène
- Suivez la non indigènes Chromatographie d'affinité ci-dessus (étapes), sauf 6.2.1.1-6.2.1.4 ajuster les paramètres suivants:
- Incuber Ni2 solution de résine +-NTA à 4 ° C pendant au moins 1 h à nutator.
- Utilisez le tampon de lavage approprié (tableau 1).
- Ajouter 5 ml de tampon d'élution (tableau 1) avec de la résine et laisser incuber pendant 5 min.
- Ouvrir le robinet d'arrêt et de recueillir élution jusqu'à ce que plus de la solution a coulé à travers.
- Ajouter 90 pl / puits de réactif de Bradford pour effacer plaque de 96 puits. Après chaque élution permet 10 pi de sortetion goutte à goutte de la colonne dans le puits contenant 90 ul réactif de Bradford.
- Continuez à ajouter 5 ml de tampon d'élution à la fois jusqu'à dosage de Bradford ne détecte plus de protéine (la couleur va du bleu foncé au bleu clair pour effacer). Cela prend habituellement 4-5 volumes d'élution.
- Suivez la non indigènes Chromatographie d'affinité ci-dessus (étapes), sauf 6.2.1.1-6.2.1.4 ajuster les paramètres suivants:
- Faire non indigènes (renaturation) et des tampons de dialyse autochtones (tableau 1) et de stocker dans 4 ° C.
Note: Le pH des tampons de dialyse sont déterminées par le point isoélectrique de la protéine cible (pI). En règle des protéines de pouce doit être tamponnée au moins un point complet ci-dessus ou en dessous de leurs valeurs de pi. - Transfert élutions indigènes et non indigènes tube de dialyse à coupure de poids moléculaire approprié (25.000 MWCO pour NGF et 50.000 MWCO pour Sema3A). Placer chaque échantillon de protéine dans du tampon de dialyse une respective pendant 4 heures à 4 ° C, puis la remplacer par la mémoire tampon respective sur deuxnuit à 4 ° C.
Remarque: la protéine doit être dialysée dans chaque tampon pendant au moins 4 heures pour le repliement correct et l'échange de tampon d'avoir lieu. - Concentrer les élutions de protéines dialysées à moins de 5 ml en utilisant des concentrateurs de spin centrifugeuses.
Remarque: Les protéines peuvent en outre être purifiés en utilisant une Chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC) et concentrées à nouveau.
- Facultatif: déterminer le coefficient d'extinction, ε, de sorte que la concentration de protéine peut être déterminée dans des isolations à venir en mesurant l'absorbance d'un échantillon à 280 nm, en utilisant la loi de Beer-Lambert: C = A 280nm / εl, où l est la longueur du trajet.
7. Biotinylation de la protéine purifiée
- Dialyser protéines dans 10.000 MWCO cassettes de dialyse against Tris 10 mM (pH = 8,0), en changeant le tampon toutes les 4 heures avec un total de 6 changements.
- Transférer les protéines recombinantes (maintenant dans un tampon Tris 10 mM) à 2 ml tubes micro-centrifugeuse pour biotinylation.
- Biotinyler des protéines à l'aide d'un kit de protéine ligase biotine.
- Dialyser protéines contre PBS (pH = 7,4) en utilisant 10 000 MWCO cassettes de dialyse avec 3 tampon change un jour pendant 2 jours.
- Déterminer la biotinylation pour cent de protéines en utilisant un kit de quantification.
- Déterminer à nouveau la concentration comme décrit dans 6.4 et conserver à 4 ° C ou aliquote et conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme.
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Representative Results
Clonage et expression de test
Lorsque le placage est effectué correctement, simples colonies isolées devraient former pour augmenter les chances de plumer clonale transformées cellules bactériennes (figure 2A). Cependant, si trop de cellules sont étalées, les plaques sont incubées trop longtemps à 37 ° C ou transformation est discutable, les colonies peuvent couvrir la plaque de gélose ou former de plus grands agrégats de cellules (figures 2B et 2C). Au cours de l'expression de test, le NGF et ont d'abord été induites Sema3A pendant 4 heures à 37 ° C et l'analyse SDS-PAGE, les protéines ont été déterminées les deux situés dans la fraction soluble (figure 2D). L'expression des protéines semblait juste et donc une autre expression de test avec l'induction nuit à 18 ° C a été examiné. NGF a permis de mieux expression dans la fraction soluble, alors qu'il n'y avait pas de différence notable avec Sema3A (figure 2E).
"> Isolation, purification et BiotinylationLes deux NGF et Sema3A ont été isolés en utilisant des techniques d'isolement indigènes comme décrit dans le protocole ci-dessus et parcourir la colonne FPLC pour la purification. En outre, ces protéines recombinantes ont été isolées et purifiées nonnatively. Bien que le NGF était dans la fraction soluble lors de l'expression d'essai, les procédures d'isolement natifs ont produit un faible rendement de NGF après que les deux 37 ° C (4,57 mg / culture principale de 2 L) et 18 ° C (6,11 mg / culture principale de 2 L; Figure 3A, lignes continues) inductions. Cependant, un rendement plus élevé de NGF a été obtenue par isolement non native avec renaturation (10,72 ± 1,8 mg / culture principale de 2 L, Figure 3A, ligne en pointillés) après 18 ° C, induction pendant une nuit. D'autre part, l'isolement non native a donné lieu à aucune production de Sema3A (figure 3B, ligne en pointillés) avec 8,61 ± 3,1 mg / culture principale de 2 L pour l'isolement natif (Figure 3 B, ligne continue). En conséquence, le NGF a été isolé dans des conditions non indigènes après l'induction nuit à 18 ° C, alors que, Sema3A subi l'isolement natale après 4 heures d'induction à 37 ° C. FPLC pics ont été recueillies et des échantillons de NGF et Sema3A ont été analysés avec SDS-PAGE (figure 3). Pics de protéines supplémentaires qui se trouve dans la sortie pour Sema3A FPLC (Figure 3B) ont été recueillies et analysées par SDS-PAGE avec et ne sont pas situés dans la région des poids moléculaires Sema3A. Ces fractions sont des produits de dégradation les plus probables parce qu'ils ne se comportent pas fonctionnellement dans des essais cellulaires comme l'a fait le pic Sema3A indiqué dans la figure 3B. Les protéines ont été biotinylé en utilisant une enzyme BirA et dialysées pour éliminer toutes les espèces n'ayant pas réagi. Biotinylation a été confirmé avec un kit de quantification de la biotine et lecteur de microplaques fluorescent.
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Figure 1. L'ingénierie des protéines en utilisant un E. Système d'expression coli. Le procédé de base de l'ingénierie des protéines recombinantes implique la conception d'un plasmide pour le clonage et l'expression dans E. coli. Les colonies transformées sont sélectionnées par l'utilisation d'antibiotiques. Les petites expressions de test sont utilisées pour optimiser et définir la production et de la solubilité de la protéine cible. Cette procédure est mise à l'échelle-up aux grandes cultures de lots (échelle de litres). méthodes chromatographiques sont utilisées pour isoler et purifier la protéine par génie souhaitée. Des modifications telles que la biotinylation peuvent se produire au cours de cultures en batch ou après purification.
Figure 2. Optimizing expression de test de NGF et Sema3A. (A) Placage 25 pi de transformer E. coli K12 cellules ont donné lieu à de petites colonies isolées. Une colonie individuelle doit être sélectionné pour l'expression de test. Pour les cellules BL21 transformé la distribution de la colonie similaire devrait se produire. (BC) 50 Plaquage pi et 100 pi de cellules K12, respectivement, ont donné lieu à la surpopulation des colonies bactériennes. Plumaison de ces plaques pourrait se traduire par une plus faible probabilité de sélection d'une colonie provenant d'une seule cellule transformée. (D) d'expressions de test de cellules transformées ont été induites pendant 4 heures à 37 ° C avec de l'IPTG, et la SDS-PAGE montre que la protéine NGF de fusion (29 kDa) et Sema3A protéine de fusion (91 kDa) sont exprimés dans la fraction soluble. (E) l'induction de nuit à 18 ° C montre l'expression de NGF encore dans la fraction soluble, mais l'expression de Sema3A n'est pas améliorée.
Figure 3. Purification du NGF et Sema3A utilisant FPLC. (A) d'isolement non indigènes après 18 ° C induction nuit (pointillés) a donné lieu à de meilleurs rendements NGF par rapport à l'isolement natif à la fois 4 heures, 37 ° C et une nuit, inductions 18 ° C (traits pleins). (B) Pour Sema3A, induction à 37 ° C pendant 4 heures et l'état d'isolement natif produit de meilleurs rendements par rapport à l'isolement non indigènes dans les mêmes paramètres de culture. SDS-PAGE montre collections de pointe FPLC (flèches) pour les deux (A) et NGF (B) Sema3A. Un étalon de protéine par filtration sur gel a été effectuée pour confirmer la distribution de poids moléculaire et des pics est indiquée dans le fond des emplacements FPLC en kDa.
| Isolement | Tampon | Composants |
| Non indigènes | Lysis / Wash | 6 M GuHCl, 100 mM H 2 NaPO 4, 10 mM Tris base, 10 mM imidazole, pH = 8,0 |
| Élution | 6 M GuHCl mM acide acétique glacial 200 (17,4 M) | |
| Dialyse (renaturation) | Une solution saline de tampon phosphate (PBS): 21,7 mM NaH 2 PO 4, 15,3 mM Na 2 HPO 4, NaCl 149 | |
| Une mémoire tampon: PBS, 0,2 M GuHCl, 1,99 mM de dithiothréitol (DTT) dans 4 L d'eau ultra-pure; pH = 7,4 | ||
| Tampon 2: PBS dans 4 L d'eau ultra-pure, pH = 7,4 | ||
| Indigène | Lyse | 50 mM de NaH 2 PO 4, NaCl 300 mM, 10 mM d'imidazole; pH = 8,0 |
| Laver | 50 mMNaH 2 PO 4, 300 mM de NaCl, 20 mM imidazole, pH = 8,0 | |
| Élution | 50 mM de NaH 2 PO 4, NaCl 300 mM, 250 mM imidazole; pH = 8,0 | |
| Dialyse | Une solution saline de tampon phosphate (PBS): 21,7 mM NaH 2 PO 4, 15,3 mM Na 2 HPO 4, NaCl 149 | |
| Tampon 1: PBS, 1,99 mM de DTT dans 4 L d'eau ultra-pure, pH = 7,4 | ||
| Tampon 2: PBS dans 4 L d'eau ultra-pure, pH = 7,4 |
Tableau 1. La protéine recombinante tampons d'isolation.
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Discussion
Recombinant ingénierie des protéines est une technique très puissante qui s'étend sur plusieurs disciplines. Il est rentable, accordable et une procédure relativement simple, ce qui permet la production de rendements élevés de protéines sur mesure. Il est important de noter que la conception et l'expression de protéines cibles n'est pas toujours évident. Expression basale et la stabilité de la protéine recombinante dépendent des choix spécifiques de vecteur, E. coli souches cellulaires, peptide tag ajouts et les paramètres de culture. Notre critère de conception spécifique utilise bien établie E. coli souches pour l'ingénierie des protéines. De plus, le vecteur plasmidique contenant un promoteur lac de T7 et le gène de résistance à l'ampicilline pour l'expression de la protéine recombinante stable.
Après l'obtention de sous-cloné plasmide hautement purifié, la première procédure principale consiste à transformer avec succès la protéine cible dans la cellule hôte et à déterminer la solubilité de l'la protéine. Les expressions de test sont le meilleur moment pour optimiser la synthèse de la protéine cible. Il est important de pincer petites colonies isolées (Figure 2A) pour assurer une meilleure sélection des cellules bactériennes contenant le plasmide. stratégies de résolution des problèmes tels que restreaking de redistribuer les colonies ou l'incubation des plaques d'agar pour des périodes plus courtes pourraient aider à mieux les formations de la colonie. Il n'est pas surprenant que la production de protéine recombinante induit un stress sur la souche hôte 36. Au cours de cette étape si l'expression est faible, les facteurs tels que des antibiotiques et de la concentration d'IPTG ainsi que le temps d'induction et la température peuvent être ajustées pour obtenir la protéine cible optimale (pour avis voir 37-38). Cela a été vu pour NGF où la meilleure expression résulte d'induction pendant une nuit à 18 ˚ C (figure 2E).
Sema3A abouti à la production de protéines dans des conditions natives mais nonnative isolement n'a pas montré la production de protéines (Figure 3B). Les principales cultures de NGF ont été induites pendant 4 heures à 37 ˚ C ainsi que toute une nuit à 18 ˚ C et isolés dans des conditions natives. Purification par FPLC a produit un rendement plus faible de NGF par rapport aux principales cultures qui ont été isolés nonnatively après induction pendant une nuit à 18 ˚ C (figure 3A). La formation de protéines dans des corps d'inclusion est généralement considérée comme indésirable, car renaturation est parfois difficile et pas toujours couronnée de succès. Cela a conduit à l'élaboration de techniques pour améliorer la solubilité des protéines, y compris l'addition de séquences de protéines solubles 39 à 41. Toutefois, les protéines ont été démontré qu'ils possèdent les formes de états conformationnels tout isolé dans des corps d'inclusion, et des paramètres tels que la température de l'induction inférieurs aider à maintenir ces structures actives 42-46. Lorsque seulement une protéine peut être exprimée sous la forme insoluble, il est généralement possible de renature de la protéine après isolement en utilisant des techniques simples avec très peu de perte de rendement comme nous l'avons indiqué précédemment 21.
Nous avons montré comment l'ingénieur avec succès et produire des protéines biotinylatable utilisant un E. coli clonage et système d'expression comme l'hôte produisant environ 8-10 mg / culture principale de 2 L. Il est important de noter que la séquence globale des événements reste le même lors de la production de nouvelles protéines recombinantes (figure 1), mais, chaque coutume- protéine fabriquée doit être traitée au cas par cas afin de déterminer comment produire spécifiquement le rendement le plus élevé de produit purifié. Nous avons montré que le NGF et Sema3A se comportent différemment dans le même système de culture et de la façon d'optimiser leur production. En outre, nous utilisons actuellement un autre E. coli B souche hôte qui peut biotinyler in vivo 47 pour d'autres protéines cibles, ce qui démontre l'importance de staying bien informé sur les avancées et les modifications en cours sur l'ingénierie de protéines recombinantes.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier l'université d'Akron pour le financement en faveur de ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
| 2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
| Acetic acid, glacial | EMD | AX0073-9 | 2.5 L |
| Agar | Bioshop | AGR001.500 | 500 g |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | 25 g |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich | A6426 | 500 g |
| Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | 1 ml; Expression Host |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
| Gel filtration standard | Bio-Rad | 151-1901 | 6 vials |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
| Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
| His-Pur Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-3 | 2.5 L |
| Imidazole | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
| Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | 1 kg |
| NovaBlue Competent Cells | Novagen | 69825 | 1 ml; Cloning Host |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Potassium Chloride | Chem-Impex International | 01247 | 1 kg |
| Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1 kg |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| Sodium phosphate diabasic | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500 g |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | 500 g |
| Terrific Broth | Bioshop | TER409.5 | 5 kg |
| Tetracycline hydrochloride | Chem-Impex International | 667 | 25 g |
| Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x | Bio-Rad | 1610732 | 1 L |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Tryptone, pancreatic | EMD | 1.07213.1000 | 1 kg |
| Yeast extract, granulated | EMD | 1.03753.0500 | 500 g |
| ÄKTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | Includes kits and accessories |
| Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution |
| Dialysis Casette | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (Extra Strength) |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories | 132127, 132129 | MWCO: 25,000 and 50,000 |
| Flow Diversion Valve FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit | Invitrogen | 1094598 | |
| Frac-950 Tube Racks, Rack C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| Fraction Collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | Includes kits and accessories |
| Heated/Refrigerated Circulator | VWR | 13271-102 | Model 1156D |
| Heating Oven FD Series | Binder | Model FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | 393126 | |
| JA 25.50 Rotor | Beckman Coulter | 363055 | |
| JLA 8.1 Rotor | Beckman Coulter | 969329 | Includes 1 L polyporpylene bottles |
| JS 5.3 Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Laminar Flow Hood | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 Series Clean Bench |
| Microplate Reader | TECAN | infinite M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel vertical electrophoresis system |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels | Bio-Rad | 456-9036 | Any kDa, 15-well comb |
| Ni-NTA Column | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml volume ECONO-Column |
| Plasmid Miniprep Kit | Omega Bio-Tek | D6943-01 | |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
| Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes | VWR | 3119-0050 | 50 ml tubes for JA 25.50 rotor |
| Spin-X UF Concentrators | Corning | 431488, 431483 | 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da |
| Subcloning Service | GenScript USA Inc. | Protein Services | |
| Ultrasonic Processor | Cole-Parmer | 18910445A | Model CV18 |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 |
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