Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Expression, Isolation, og Rensing av løselig og uløselig Biotinylated Proteiner for nervevev Regeneration

Published: January 22, 2014 doi: 10.3791/51295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Akron

Summary

Utvikling biotinylatable fusjon proteiner har mange potensielle bruksområder i ulike forskningsfelt. Rekombinant protein engineering er en rett frem prosedyre som er kostnadseffektive, noe som gir høy avkastning av spesialdesignede proteiner.

Abstract

Rekombinant protein engineering har benyttet Escherichia coli (E. coli) ekspresjonssystemer for nesten fire tiår, og i dag E. coli er fortsatt den mest brukte vertsorganisme. Fleksibiliteten i systemet tillater tillegg av deler, så som en biotin signal (for streptavidin interaksjoner) og større funksjonelle proteiner som grønt fluorescerende protein, eller kirsebær rød protein. Videre foreligger det en integrering av unaturlige aminosyrer som metallion-chelatorer, unikt reaktive funksjonelle grupper, spektroskopiske prober, og molekyler som bibringer posttranslasjonelle modifikasjoner aktivert bedre manipulering av protein-egenskaper og funksjonalitet. Som et resultat av denne teknikken skaper passelig fusjonsproteiner som tilbyr betydelig nytteverdi for ulike forskningsfelt. Mer spesifikt har den biotinylatable proteinsekvensen blitt innarbeidet i mange mål proteiner på grunn av den høye affinitet mellom biotin interaksjon med avidin og streptavidin. Dette tillegg har hjulpet i å forbedre deteksjon og rensing av merket proteiner så vel som å åpne veien for sekundære applikasjoner som cellesortering. Dermed biotinmerket molekyler viser en økende og utstrakt innflytelse i bioindustrial og biomedisinske områder. For hensikten med vår forskning har vi konstruert rekombinante biotinylated fusjonsproteiner som inneholder nervevekstfaktor (NGF) og semaphorin3A (Sema3A) funksjonelle regioner. Vi har tidligere rapportert hvordan disse biotinylert fusjonsproteiner, sammen med andre aktive proteinsekvenser, kan være bundet til biomaterialer for vevsteknologi og regenererende formål. Denne protokollen beskriver det grunnleggende ingeniør biotinylatable proteiner på milligram skala, utnytte en T7 lac induserbar vektor og E. coli ekspresjonsverter, med start fra transformasjon for å skalere opp og rensing.

Introduction

Proteiner dekker et bredt spekter av biomolekyler som er ansvarlig for mange biologiske funksjoner, til slutt fører til riktig vev dannelse og organisasjon. Disse molekylene initiere tusenvis av signalveier som styrer opp-regulering og / eller nedregulering av gener og andre proteiner, å opprettholde likevekt i den menneskelige kroppen. Forstyrrelse av et enkelt protein påvirker hele dette nettet av signaler, noe som kan føre til utbruddet av ødeleggende lidelser eller sykdommer. Ingeniør enkelte proteiner i laboratoriet tilbyr en løsning for å bekjempe disse negative effektene, og tilbyr et alternativ til små molekyl narkotika. I 1977, et gen som koder for den 14. aminosyre somatostatin-sekvensen var en av de første modifiserte polypeptider som er opprettet ved hjelp av E. coli ett. Kort tid etter i 1979, ble insulin klonet i plasmid pBR322, forvandlet, uttrykt, og renset to. Siden da har rekombinante proteiner utvidet sin innflytelse til flere felt av resØk ved for eksempel biomaterialer, levering av legemidler, tissue engineering, biofarmasøytiske, jordbruk, industrielle enzymer, biodrivstoff, etc. (for se referanser 3-8). Dette skyldes i stor grad den allsidighet at teknikken tilbyr via tillegg av applikasjonsspesifikke kjemiske rester eller proteinsekvenser for formål, inkludert, men ikke begrenset til, mål protein identifikasjon, stabilisering og rensing.

Via rekombinant DNA-teknologi, kan rekombinante proteiner kan uttrykkes i en rekke eukaryote og prokaryote vertssystemer, inkludert pattedyr-, plante-, insekt-, gjær, sopp eller bakterier. Hver vert tilbyr ulike fordeler og vanligvis det beste systemet fastsettes basert på protein funksjon, ytelse, stabilitet, totalkostnadene og skalerbarhet. Bakterieceller ofte mangler de post-translasjonell modifikasjon mekanismer som eukaryote verter gir (dvs. glykosylering, disulfide bridging, e tc.) 5. Som et resultat av pattedyr-og insektsystemer vanligvis resultere i bedre kompatibilitet og ekspresjon av eukaryote proteiner, men disse verter er vanligvis mer kostbare og tidskrevende 9.. Derfor E. coli er den favoriserte vertskap for uttrykket vårt system fordi cellene ekspandere raskt i rimelige vekstforhold og de ​​genetiske uttrykket mekanismene er godt forstått 5,9. I tillegg er enkel å skalere opp til produksjonsformål og resulterer i funksjonelle proteiner til tross for mangelen av post-translasjonelle modifikasjoner 10 av dette system. Den E. coli K12 belastningen er valgt i denne protokollen for kloning fordi denne belastningen tilbyr gode plasmid avkastning basert på høye transformasjons effektivitet. I tillegg kan en E. coli BL21 stamme anvendes for ekspresjon, fordi dette vertsstammen inneholder T7 RNA polymerase-genet som gir kontrollert proteinekspresjon og stabilitet 11..

telt "> Etter at vertsvalg, må ytterligere forsiktighet utvises ved valg av en ideell ekspresjonsvektor for å lette valgt og kontrollert proteinekspresjon. Syntetisere rekombinante proteiner som begynner med en mål-DNA-sekvens som er klonet i regi av bakteriofag T7 transkripsjon og oversettelse signaler, og ekspresjon induseres i vertsceller inneholdende kromosomale kopi av den T7 RNA-polymerase-gen 12.. disse vektorer, avledet fra plasmid pBR322 vektor (for gjennomgang se henvisningstallet 13), blir kontrollert av T7 promoter opprinnelig utviklet av Studier og kolleger 14 og gi ytterligere kontroll gjennom inkludering av lac operator-og lac-repressor (lac1) 15,16. For rekombinant protein engineering, har dette ekspresjonssystem muligheten til å skreddersy en spesifikk aminosyre-sekvensen av et ønsket protein ved å sette inn forskjellige target DNA-sekvenser, eller for å skape fusjonsproteiner består av kombinerte domenets fra single proteiner. I tillegg har noen vektor serien inkluderer peptid tag modifikasjoner som skal plasseres på N eller C endestasjonen. For designformål ble en histidin (His) tag tilsatt til DNA-mål-sekvens for rensning og en 15 aminosyre-sekvens biotinylatable ble inkludert for biotinylering 17,18. I denne protokoll et plasmid som inneholder et ampicillin-resistens-genet, ble valgt til å bære våre biotinylatable fusjonsproteinsekvenser. Ekspresjon styres i denne vektoren via T7 lac-promotoren, og er lett indusert med isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).

Test uttrykk (småskala kulturer) blir brukt til å bestemme tilstedeværelsen og oppløselighet av målproteinet, som kan uttrykkes i enten en oppløselig eller uoppløselig formen for å formulere renseprosedyrer. En løselig protein uttrykt i bakterier celle vil gjennomgå spontan folding å opprettholde sin opprinnelige struktur 19. Vanligvis de innfødteStrukturen er termodynamisk gunstig. I mange tilfeller er den metabolske aktiviteten til verten ikke bidrar til målproteinet, plassere stress på systemet som fører til uoppløselige proteinproduksjon og dannelse av inklusjonslegemer som består av uoppløselige proteinaggregater. Dermed målproteinet denatures, gjør dem generelt biologisk inaktivt 20. Begge test uttrykk er skalert opp og isoleringsprosedyrer er bestemt av løseligheten av målproteinet. En ytterligere renaturering eller refolding trinnet er nødvendig for uoppløselige proteiner. De resulterende rekombinante proteiner kan bli ytterligere renset ved hjelp av gelfiltrerings-kromatografi.

I huset har rekombinant proteinproduksjon kostnads ​​fordeler i forhold til kommersielle produkter siden milligram av målprotein kan isoleres per liter av hovedkulturen. Det meste av det nødvendige utstyr er tilgjengelig i en typisk biologisk eller kjemisk laboratorium. Protein engineering gir mulighet for etableringav tilpassede fusjonsproteiner med ekstra funksjonalitet som ikke alltid kommersielt tilgjengelig. Figur 1 viser de viktigste fremgangsmåter som er involvert i ingeniør rekombinante proteiner. Med dette uttrykket system har vi skapt mange biotinylatable proteiner, slik som interferon-gamma, platelet-derived growth factor, og bein-morphogenetic protein 21-23, men vi vil fokusere på to proteiner som vi utviklet for axon veiledning, NGF (29 kDa ) og Sema3A (91 kDa) 10 (for gjennomgang se referanse 24). Biotinylering er en vanlig teknikk for identifikasjon, immobilisering og isolering av merkede proteiner som benytter den kjente biotin-streptavidin interaksjon 25-27. Biofysiske sonder 28,29, biosensorer 30, og kvanteprikker 31 er noen eksempler på systemer som benytter høye affinitet biotin-streptavidin konjugering med en K d på størrelsesorden 10 -15 M 27. Den E. coli biotinn-ligase, BIRA, hjelpemidler i den kovalente binding av biotin til lysin-sidekjeden finnes innenfor biotin merket sekvens 18,32. Tethering biotin til materialer og biomolekyler har produsert vedvarende tilførsel av vekstfaktorer til celle for flere tissue engineering applikasjoner 21,33-35. Derfor, prosjektering disse spesialdesignede biotinylatable proteiner er et kraftig verktøy som kan overskride flere forskningsinteresser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Prosjektering av Target Protein

  1. Bruk av National Center for Biotechnology Information nettside (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) skaffe amino sekvens for målet protein tar hensyn til arter av renter og eventuelle skjøte varianter. Merk av aminosyresekvensen som svarer til den aktive region av interesse av proteinet.
    Merk: For Sema3A, ble aminosyrer 21-747 valgt. Et fusjonsprotein ble utformet med NGF, hvor sekvensen av barstar, aminosyre 1 til 90, ble innført i NGF-aminosyrene 122-241.
  2. Til N-enden legge den følge sekvenser: 6X-His tag for rensing (hhhhhh), tobakk Etch Virus (TEV) protease cut stedet for fjerning av Hans tag (ENLYFQG), biotin merket sekvens for biotinylering av protein ved K (GLNDIFEAQKIEWHE) og fleksibelt hengsel med hull som gjør at rommet for riktig protein refolding (EFPKPSTPPGSSGGAP).
    Merk: Disse sekvenser kan variere avhengig av den ønskede fusjon protein.
  3. Send en komplett aminosyre sekvens til et selskap for genet design / optimalisering for ønskede vertsarter og syntese. Subklon inn i en vektor for valg ved hjelp av BamHI-NotI-området ved hjelp av en kit, eller ved å benytte kommersielle tjenester.

2. Making Agar Plates

Merk: Det er svært viktig at alle bestander av antibiotika, plater, buffere, etc. er lagret på riktig måte (temperatur og varighet) og forbli fri for proteaser (sterilisert).

  1. Vei opp agar med 1,5 vekt-% og lysogeny buljong (LB) ved 20 g / l og plasseres i en glassflaske media. En 500 ml flaske gjør omtrent 15 plater.
  2. Volumet legge ultrarent vann, bland godt, og autoklav.
  3. La flaske kjølig å ta på og legge de aktuelle antibiotika. Unngå for tidlig størkning av agaren, men hvis flasken kjøles for mye, og oppløsningen begynner å størkne, oppvarmer i mikrobølgeovn.
    Merk: Vår plasmidet inneholder en ampicillinresistans gene. Derfor må alle trinn inneholde ampicillin ved 100 pg / ml. Den E. coli klonings K12 stamme krever tetracyklin (12,5 pg / ml) antibiotikum. BL21 bakterieceller ikke krever noen ekstra antibiotika.
  4. Hell 25-30 ml oppløsning i 90 mm petriskåler og gi tid til å tørke.
  5. Etikett tallerken med passende antibiotika og lagre opp-ned i 4 ° C, med Parafilm eller i en pose som kan lukkes.
    Merk: Platene er god for om lag en måned.

Tre. Kloning av Biotin Tagged Plasmid

Merk: Forhold gjøres aseptisk.

  1. Spinn ned plasmidvektor på 6000 xg i 3 min for å pellet, og tilsett 10 mL av sterilisert ultrarent vann.
  2. Fjern 50 ul av kjemisk kompetent E. coli høy transformasjonseffektivitet celler fra -80 ° C og straks sette på is i 5-10 min.
  3. Legg en mL av vektor løsning på 0,5-1 ng/5056, l celler til 50 ul E. coli-celler og plassere de rester plasmid i -80 ° C.
  4. Plasser bakterieceller inneholdende vektoren på is i 5 min.
  5. Termisk sjokk cellen og vektoren blandingen i 30 til 45 sekunder i 42 ° C vannbad og plassere cellene tilbake på is i 2 min.
  6. Til 250 pl av super optimal kokes med catabolite undertrykkelse (SOC) medium (2% w / v Bacto-trypton, 0,5% w / v Bacto-gjærekstrakt, 8,56 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO 4, 20 mM glukose , ultrarent vann, pH = 7,0) og ristes ved 250 rpm ved 37 ° C i 30 min.
    Merk: SOC bør ikke autoklavert men bli filtersterilisert gjennom et 0,22 mikrometer filter.
  7. Tørrplater 10-15 min før plating celler.
  8. Pipetter 25, 50, og 100 ul av celleløsningen på separate agarplater inneholdende ampicillin (100 pg / ml) og tetracyklin (12,5 pg / ml) antibiotika. Bruk glassperler å distribuere løsningen jevnt over agar plater.
    9. <li> Inkuber platene opp ned på 37 ° C i 15-18 timer.
  9. Kontroller for små individuelle bakteriekoloniene på platene og lagrer opp-ned ved 4 ° C inntil videre bruk (figur 2A).
    1. Hvis ingen kolonier er til stede:
      1. Sjekk friskhet og sterilitet av buffere og forsyninger.
      2. Øke mengden av plasmidet innført i E. coli K12 belastning.
    2. Hvis store kolonier er til stede, eller det er en overvekst av kolonier (figur 2B og 2C), restreak en ny agar plate ved hjelp av en steril inokulasjon sløyfe eller plateceller ved lavt volum.
  10. Inokulere 5 ml LB inneholdende ampicillin (100 pg / ml) og tetracyklin (12,5 pg / ml) antibiotika med en enkelt koloni av transformert E. coli-celler. Vokse opp cellene over natten ved 37 ° C ved 250-300 rpm.
  11. Den følgende dag, bruker et plasmid isoleringssett for å isolere målvektoren fra over natten grow-opp og lagre renset plasmid ved -80 ° C inntil videre bruk.
    1. Valgfritt: Kontroller renhet og konsentrasjon av plasmid ved hjelp av absorbans lesing oppnådd ved 260 og 280 nm.

4. Transformasjon av Plasmid inn Expression Host

Merk: Forhold gjøres aseptisk.

  1. Gjenta trinn 03.02 til 03.10 for E. coli BL21 celler med følgende endringer:
    Merk: BL21 celler ikke krever noen ekstra antibiotika, derfor bare ampicillin er lagt til agarskålene for transformasjon.
    1. Legg 2-5 mL av isolert plasmid på 0,5-2 ng/50 mL celler fra trinn 3,12 til 50 mL E. coli-ekspresjon vertsceller.
    2. Heat shock celler for 60-90 sek.
    3. Rist-løsning inneholdende SOC medium ved 250 rpm i 60 minutter i stedet for 30 min.
  2. Nappe en enkelt koloni av transformerte bakterier celler fra petriskål med en sterile applikatorpinne og plasseres i et prøverør inneholdende 5 ml LB-næringsløsning med den hensiktsmessige konsentrasjonen av ampicillin (100 ug / ml).
  3. Plasser reagensglass i shaker over natten ved 37 ° C ved 250 rpm.
  4. Følgende morgen, ta 200 mL av natten vokse opp og legge den til 5 ml LB inneholder ampicillin på 100 mikrogram / ml.
  5. Fryse ned de resterende cellene med 250 mL 50% glyserol (sterilt) til 750 mL kultur og holde i -80 ° C.
    Merk: Ny test uttrykk og oppskalering prosedyrer kan gjøres ved hjelp av en steril applikatorpinne å få en skraping av frosne celler og inoculating LB med de aktuelle antibiotika.
  6. Plasser testrør i rystemaskin ved 250 til 300 rpm ved 37 ° C inntil optisk tetthet (OD) måles mellom 0,7 til 0,8 ved en absorbans på 600 nm.
  7. Fremkall celler med IPTG ved en sluttkonsentrasjon på 1 mM.
  8. Rist i ytterligere 4 timer ved 37 ° C ved 300 rpm. Alternativt celler kan ogsåristes over natten ved 18 ° C ved 250-300 rpm. Dette kan gi et høyere utbytte av plasmid avhengig av målproteinet.
  9. Natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) analyse av test Expression
    1. Ta 500 mL av kultur og plasser i en 1,5 ml tube. Spinn ned på 13-15 xg i 5 min. Hell av Supernatantvæsken og merke "Løselig." Resuspender pellet med virvling i 200 mL av laste-fargestoff (50 ul 2-merkaptoetanol, 950 pl Laemmli prøvebuffer).
      Merk: Oppløselige bakterier pellets vil bli brukt for å bestemme om det rekombinante protein er de cytoplasmatiske regioner i bakteriecellene. Pellets kan lagres i -80 ° C uten å laste inn fargestoff inntil nødvendig. En kontrollbakteriekultur som ikke er blitt transformert eller indusert kan behandles som oppløselig så vel for sammenligning.
    2. Ta 1000 mL av kultur og plasser i en 1,5 ml tube. Spinn ned på 13-15 xg i 5 min.Hell av Supernatantvæsken og merke "Uløselig."
      Merk: Uløselig pellets vil gjennomgå denaturering prosedyrer under for å frigjøre proteiner som finnes i inkludering organer av bakterieceller. Pellets kan lagres i -80 ° C inntil behov. En kontrollbakteriekultur som ikke er blitt transformert eller indusert kan behandles som uoppløselig samt for sammenligning.
      1. Resuspender uoppløselige pellet i 200 ul Bugbuster og la ved romtemperatur i 30 min.
      2. Spinn ned prøve igjen på 13-15 xg i 5 min og ta 50 mL av supernatanten og legge den til nye "Uløselig" 1,5 ml tube.
      3. Deretter legger 50 mL av lasting fargestoff til denne nye prøven.
    3. Kok både oppløselige og uoppløselige prøvene i 5 min for å denaturere proteiner for SDS-PAGE-analyse.
    4. Laste hver prøve til elektroforese gel med standard stigen.
    5. For å visualisere de proteinprøver bruke en staining reagens og følge selskapets protokollen.
    6. Bestem hvorvidt proteinet uttrykker i de oppløselige og / eller uoppløselige fraksjoner ved å sammenligne disse to baner, så vel som sammenligning av banene til de oppløselige og uoppløselige kontrollfelt (se note 4.9.1 og 4.9.2) på SDS-PAGE-gel (figur 2). Et mørkt bånd skal vises rundt molekylvekten av proteinet i de løselige eller uløselige baner. Dette vil avgjøre hvilken isolasjon prosedyre å bruke i protokoll 6.
      Merk: Hvis det er et bånd i begge disse områder enn både isolering benyttet i protokoll 6 nedenfor kan utføres, eller proteinet kan bli isolert på begge måter for å bestemme hvilken isolasjonsmetoden gir et høyere utbytte av rekombinant protein (Figur 3) .
    7. Hvis en 4 timers induksjon over natten og ble utført, bestemme hvilke induksjonsmetode har den høyeste proteinproduksjon for oppskalering prosessen (figur 2).
    10. 5. Oppskalering Prosedyre and Main Kultur

    1. Forbered vekstmedier med 85,7 g Terrific Broth og 28,8 ml 50% glyserol i 1,8 L av ultrarent vann, og autoklav på væskesyklus i 1 time.
    2. Begynn en overnatting kultur fra frossen celle lager opprettet i trinn 4.5.
      Merk: Forhold gjøres aseptisk.
      1. Bland 20 ml LB og med en endelig konsentrasjon av ampicillin på 100 mikrogram / ml i en steril 125 ml Erlenmeyerkolbe.
      2. Ved hjelp av en steril applikatorpinne ta en opphugging av transformert E. coli-celler og dråpe applikatoren til kolben. Fjern applikatorpinne og plug kolbe med skumpropp eller bomull og dekk med aluminiumsfolie for å opprettholde sterilitet.
      3. Rist over natten ved 250 rpm ved 37 ° C.
    3. Hoved Kultur
      Merk: Forhold gjøres aseptisk.
      1. Hell over natten kultur inn 1,8 L av sterile vekstmedier og legge ampicillin på 100 pg / ml og 6-8 dråper av sterile Antifoam 204 ved hjelp av en Pasteur-pipette.
      2. Plasser kulturer i et 37 ° C vannbad med 0,2 mm filtrert komprimert luft bobler inn i kulturer gjennom lufte steiner.
      3. Når OD 600nm når 0,7-0,8, induserer med IPTG (1 mM), og tillate induksjon til å oppstå enten 4 timer ved 37 ° C eller over natten ved 18 ° C, avhengig av oppløselige / uoppløselige resultater fra SDS-PAGE i trinn 4.9.
    4. Samle E. coli Cells
      1. Spinn ned cellekulturen i en L sentrifugeflasker (2 flasker / kultur) i 15 min ved 14 000 x g ved 4 ° C.
      2. Hell av supernatanten og ved hjelp av en tynn spatel, scoop bakteriene pellet i to 50 ml-rør. Cellene kan bli pelletert ved sentrifugering på nytt i noen minutter.
        Merk: Hvert 1,8 L-kultur vil resultere i to bakterier pellets, en i hver 50 ml sentrifugerør.
      3. Oppbevar pellets i -80 C til protein isolasjon.
      </ Li>

    6. Isolering og rensing av rekombinant Protein

    Merk: Hvis proteinet er lokalisert i den oppløselige regionen basert på SDS-PAGE analyse fra trinn 4,9 og deretter "Native Isolation" vil bli brukt, men for uløselige proteiner "nonnative Isolation" prosedyrer vil bli gjennomført.

    1. Cellelysis
      1. Nonnative
        1. Fjern forvandlet E. coli pellet fra -80 ° C fryseren, og tilsett 20 ml lyse / vaskebuffer (tabell 1) til hvert sentrifugerør.
        2. Vortex og rist den frosne pellet før det tiner og solubilizes inn i bufferløsning uten noen store biter. Inkuber på nutator over natten. Den følgende morgen, bør pelleten nå være en viskøs oppslemming på grunn av denaturering av proteinet fra bufferen.
        3. Sentrifuger oppslemmingen ved 20.500 xg ved romtemperatur i 30 min. Overfør supernatanten til et nytt rør for isolering og kast pelleten.
      2. Skaffe forvandlet E. coli pellet fra -80 ° C fryser.
      3. Legg Lysis Buffer (Tabell 1) til sentrifugerør for å nå et endelig volum på 30 ml, og løsne frosne pellet ved å virvle og ryster grundig. Plasser pellet på is.
      4. Vask sonicator probe med 70% etanol ved 100% amplitude i 1-2 min. Deretter gjentar med ultrarent vann.
      5. Sonicate bakterier pellet mens på is i 5 min (total medgått tid på 10 min).
        1. Sett sonicator på 30% amplitude med puls på 30 sek on/30 sek av.
        2. Bob sentrifugerøret opp og ned under sonikering intervall for å fullstendig bryte opp cellepelleten. Ved slutten av den totale medgåtte tid bør det ikke være noen synlige bakterier pellet forlater en seig, viskøs slurry.
        3. Rens sonicator probe mellom forskjellige protein isoleringer samt for lagring ved hjelp av 70% etanol og ultrarent vann som beskrevet i trinn 6.1.2.3.
        Sentrifuger oppslemmingen ved 20 500 x g ved 4 ° C i 30 min. Overfør supernatanten til et nytt rør for isolering og kast pelleten.
  10. Ni-NTA affinitetskromatografering
    1. Nonnative
      1. Tilsett 1 ml Ni 2 +-NTA-harpiks-løsning til hvert sentrifugerør (2 ml harpiks totalt for en 1,8 l kultur) og inkuberes ved romtemperatur i minst 1 time på nutator.
      2. Hell slurry inn affinitetskolonne og tillate løsningen å dryppe gjennom stoppekran ventilen helt inn avfall beger.
      3. Utfør 10 vask med 10 ml av Lysis / vaskebuffer for hver vask.
        1. For de første to vaskinger, tilsett 10 ml til sentrifugerør for å fjerne ytterligere harpiks og deretter helles inn i kolonnen. De ekstra vasker kan legges direkte til kolonne.
        2. Etter hver vask, omrøring av harpiks med en glassrørestav. Når vaske drypper ned i avfallsbegerglass, kan de neste 10 ml tilsettes.
      4. Etter vask helt drips gjennom, nær stoppekran ventil, fjerne avfall beger og erstatte med 50 ml sentrifugerør for protein samling.
      5. Tilsett 15 ml Eluering Buffer (Tabell 1) og rør-up-harpiks, slik at løsningen for å stå i 5 min. Åpne stoppekran ventil og samle eluering. Gjenta på nytt med ytterligere 15 ml.
    2. Native
      1. Følg nonnative affinitetskromatografering ovenfor (trinn 6.2.1.1-6.2.1.4) bortsett justere følgende parametere:
        1. Inkuber Ni 2 +-NTA-harpiks-løsning ved 4 ° C i minst 1 time på nutator.
        2. Bruk riktig vaskebuffer (Tabell 1).
      2. Tilsett 5 ml Eluering Buffer (Tabell 1) og inkuberes med harpiks i 5 min.
        1. Åpen stoppekran-ventil og samle eluering inntil mesteparten av løsningen har dryppet igjennom.
        2. Legg 90 ul / brønn av Bradford-reagens for å fjerne 96-brønns plate. Etter hver eluering tillate 10 pl slik atlution å dryppe fra kolonne inn godt med 90 mL Bradford reagens.
        3. Fortsett å tilsette 5 ml Elution Buffer om gangen til Bradford assay ikke lenger registrerer protein (fargen går fra mørk blå til lys blå for å fjerne). Dette tar vanligvis 4-5 elueringsvolumene.
  11. Dialyse / renaturering
    1. Gjør nonnative (renaturering) og innfødte dialyse buffere (Tabell 1) og oppbevar i 4 ° C.
      Merk: pH i dialysebuffer bestemmes av målproteinet er isoelektrisk punkt (pI). Som en tommelfingerregel proteiner bør bufret minst en hel poeng over eller under deres pi verdier.
    2. Overfør innfødte og nonnative elueringer til dialyse slanger med egnet molekylvekt cutoff (25000 MWCO for NGF og 50000 MWCO for Sema3A). Plasser hver proteinprøve i respektive dialysebuffer 1 i 4 timer ved 4 ° C og deretter erstatte med de respektive buffer 2 i løpetnatt ved 4 ° C.
      Merk: Protein må dialysert i hvert buffer i minst 4 timer for riktig refolding og bufferutveksling skal finne sted.
    3. Konsentrer de dialysert protein elueringer til mindre enn 5 ml ved hjelp av sentrifuger spin konsentratorer.
      Merk: Proteiner kan ytterligere renses ved hjelp av hurtig protein-væskekromatografi (FPLC), og konsentrert på nytt.
  12. Bestem proteinkonsentrasjonen (mg / ml) etter frysetørking et 10 til 50 ml prøve i en på forhånd veiede mikrosentrifugerør.
    1. Valgfritt: bestemme ekstinksjonskoeffisient, ε, slik at konsentrasjonen av protein kan bestemmes i fremtidige isoleringer ved å måle absorbansen til en prøve ved 280 nm ved hjelp av Beer-Lamberts lov: C = A 280nm / εl, hvor L er veilengden.

7. Biotinylering av Purified Protein

  1. Dialyser proteiner i 10000 MWCO dialyse kassetter against 10 mM Tris (pH = 8,0), endring av buffer hver 4. time med totalt 6 endringer.
  2. Overfør rekombinante proteiner (som nå er i 10 mM Tris buffer) til 2 ml mikro-sentrifugerør for biotinylering.
  3. Biotinylere proteiner ved hjelp av en biotin protein ligase kit.
  4. Dialyser proteiner mot PBS (pH = 7,4) med 10 000 MWCO dialyse kassetter med tre buffer forandrer en dag for to dager.
  5. Bestem prosent biotinylering av proteiner ved hjelp av en kvantifisering kit.
  6. Bestem konsentrasjonen igjen som beskrevet i 6.4 og oppbevar ved 4 ° C eller delmengde og oppbevar ved -20 ° C for langtidslagring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kloning og Test Expression

Når plating er utført på riktig måte, bør enkle isolerte kolonier danne å øke sjansene for å plukker klonal transformerte bakterier celler (figur 2a). Imidlertid, hvis det er for mange celler er belagt, blir platene inkubert for lenge ved 37 ° C eller transformasjon er tvilsom, kolonier kan dekke agar plate eller danne større aggregater av celler (figurene 2B og 2C). Under test ekspresjon, ble NGF og Sema3A først indusert i 4 timer ved 37 ° C, og SDS-PAGE-analyse fastslått begge proteinene ble lokalisert i den oppløselige fraksjon (figur 2D). Protein uttrykket virket rettferdig og derfor en annen test uttrykk med overnatting induksjon ved 18 ° C ble undersøkt. NGF resulterte i bedre uttrykk i den oppløselige fraksjon, mens det var ingen merkbar forskjell i Sema3A (figur 2E).

"> Isolasjon, Rensing og Biotinvlerina

Både NGF og Sema3A ble isolert ved anvendelse av fremmedisolasjonsteknikker som beskrevet i det ovennevnte protokoll og kjørt gjennom FPLC kolonne for rensing. I tillegg har disse rekombinante proteiner ble isolert og renset nonnatively. Selv om NGF var i den oppløselige fraksjonen under test ekspresjon produserte opprinnelige isolasjonsprosedyrer et lavt utbytte av NGF etter både 37 ° C (4,57 mg / hovedkultur av 2 L) og 18 ° C (6,11 mg / hovedkultur av 2 L; Figur 3A, heltrukne linjer) induksjoner. Det ble imidlertid en høyere yield på NGF innhentet gjennom nonnative isolasjon med renaturering (10,72 ± 1,8 mg / hoved kultur av to L, figur 3A, stiplet linje) etter 18 ° C, over natten induksjon. På den annen side, nonnative isolasjon resulterte i ingen Sema3A produksjon (figur 3B, stiplet linje) med 8,61 ± 3,1 mg / hovedkultur på 2 liter til opprinnelig isolert (figur 3 B, heltrukket linje). Som et resultat, ble isolert i henhold til NGF nonnative forhold etter induksjon natten over ved 18 ° C, mens, Sema3A gikk opprinnelig isolert etter 4 timers induksjon ved 37 ° C. FPLC toppene ble samlet, og NGF-og Sema3A prøver ble analysert med SDS-PAGE (figur 3). Ytterligere protein-topper som finnes i det FPLC-utgang for Sema3A (fig. 3B) ble samlet og analysert med SDS-PAGE, og ble ikke plassert i Sema3A molekylvekt-området. Disse fraksjonene er mest sannsynlige nedbrytningsprodukter fordi de ikke oppfører seg funksjonelt i cellebaserte analyser som gjorde Sema3A peak indikert i Figur 3B. Proteiner ble biotinylert ved å bruke en BIRA enzym og dialysert for å fjerne eventuelle uomsatte arter. Biotinylering ble bekreftet med en biotin kvantifisering kit og fluoriserende mikroplateleser.

ftp_upload/51295/51295fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51295/51295fig1.jpg "/>
Figur 1. Protein engineering utnytte en E. coli ekspresjonssystem. den grunnleggende prosessen av rekombinant protein engineering omfatter utforming av et plasmid for kloning og ekspresjon i E. coli. Transformerte kolonier velges ut med bruk av antibiotika. Små prøve uttrykk brukes for å optimalisere og identifisere produksjon og oppløselighet av målproteinet. Denne prosedyren er skalert opp til store batch cultivations (liter skala). Kromatografi metoder brukes for å isolere og rense det ønskede konstruert protein. Modifikasjoner som biotinylering kan oppstå under satsbearbeiding eller etter rensing.

Fig. 2
Figur 2. Optimizing test uttrykk for NGF og Sema3A. (A) Plating 25 pl av transformert E. coli K12-celler resulterte i små isolerte kolonier. En individuell koloni bør velges for testen uttrykket. For BL21 forvandlet celler som ligner koloni fordelingen bør skje. (BC) Kontaktflate 50 mL og 100 mL av K12-celler, henholdsvis ført til overbefolkning av bakteriekolonier. Plucking fra disse platene kan resultere i en lavere sannsynlighet for å velge en koloni avledet fra en enkelt transformert celle. (D) Test uttrykk for transformerte celler ble indusert i 4 timer ved 37 ° C med IPTG, og SDS-PAGE viser at NGF fusion protein (29 kDa) og Sema3A fusion protein (91 kDa) blir uttrykt i den oppløselige fraksjonen. (E) induksjon over natten ved 18 ° C viser NGF uttrykk fremdeles er i den oppløselige fraksjon, men er uttrykket for Sema3A ikke forbedret.


Fig. 3. Rensing av NGF og Sema3A ved hjelp av FPLC. (A) nonnative isolasjon etter at 18 ° C over natten induksjon (stiplet linje) resulterte i bedre utbytter sammenlignet med NGF opprinnelig isolert på begge 4 timer, 37 ° C og natten over, 18 ° C induksjoner (heltrukne linjer). (B) For Sema3A, induksjon ved 37 ° C i 4 timer og opprinnelig isolert tilstand ga bedre utbytter sammenlignet med nonnative isolert på samme dyrkingsparametrene. SDS-PAGE viser FPLC peak samlinger (piler) for begge (A) NGF og (B) Sema3A. En gelfiltrering proteinstandard ble kjørt for å bekrefte molekylvektsfordeling av toppene, og er indikert i bakgrunnen av FPLC flater i kDa.

Isolasjon Buffer Komponenter
Nonnative Lysis / Wash 6 M GuHCl, 100 mm H 2 Napo 4, 10 mM Tris Base, 10 mM imidazol, pH = 8,0
Eluering 6 M GuHCl, 200 mM iseddik (17,4 M)
Dialyse (renaturering) Fosfatbuffer saltvannsoppløsning (PBS):
21.7 mm NaH 2 PO 4, 15,3 mM Na 2 HPO 4, 149 mM NaCl
Buffer 1: PBS, 0,2 M GuHCl, 1,99 mM ditiotreitol (DTT) i 4 L ultrarent vann, pH = 7,4
Buffer 2: PBS i 4 L ultrarent vann, pH = 7,4
Native Lysis 50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH = 8,0
Vask 50 mMNaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH = 8,0
Eluering 50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH = 8,0
Dialyse Fosfatbuffer saltvannsoppløsning (PBS):
21.7 mm NaH 2 PO 4, 15,3 mM Na 2 HPO 4, 149 mM NaCl
Buffer 1: PBS, 1,99 mM DTT i 4 L ultrarent vann, pH = 7,4
Buffer 2: PBS i 4 L ultrarent vann, pH = 7,4

Tabell 1. Rekombinante protein isolasjon buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant protein engineering er en meget kraftfull teknikk som spenner over mange fagområder. Det er kostnadseffektivt, fleksibel og en relativt enkel prosedyre, slik at produksjon av høy avkastning av spesialdesignede proteiner. Det er viktig å merke seg at utformingen og uttrykke målproteiner ikke alltid er enkelt. Basal uttrykk og rekombinant protein stabilitet avhenger av spesifikke valg av vektor, E. coli cellestammer, peptid tag tilføyelser og dyrkings parametere. Vår spesifikke designkriterie utnytter godt etablert E. coli stammer for protein engineering. I tillegg inneholder plasmidvektor en T7-lac-promotoren, og ampicillin-resistensgenet for stabilt rekombinant proteinekspresjon.

Etter innhenting av høyrenset subklonet plasmid, er den første store fremgangsmåte for å kunne omdanne målproteinet i vertscellen, og å bestemme løselighetenproteinet. Test uttrykk er det beste tidspunkt for å optimalisere syntesen av målproteinet. Det er viktig å rive små, isolerte kolonier (figur 2A) for å sikre bedre utvalg av bakterieceller inneholdende plasmidet. Feilsøking strategier som restreaking å omfordele koloniene eller ruger agar plater for kortere tidsperioder kan hjelpe til bedre koloni formasjoner. Det er ikke overraskende at rekombinant proteinproduksjon induserer stress på vertsstammen 36.. I løpet av dette stadium dersom uttrykket er dårlig, kan faktorer slik som antibiotika og IPTG-konsentrasjon samt induksjonstid og temperatur reguleres for å oppnå optimal målprotein (for se 37-38). Dette ble sett for NGF hvor det beste uttrykket resulterte fra natten induksjon ved 18 ˚ C (figur 2E).

Sema3A resulterte i protein produksjon for innfødte forhold, men nonnative isolasjon viste ingen proteinproduksjon (Figur 3B). Hoved kulturer av NGF ble indusert for fire timer ved 37 ˚ C samt overnatting på 18 ˚ C og isolert i henhold innfødte forhold. FPLC rensing produsert en lavere avkastning av NGF i forhold til hoved kulturer som ble isolert nonnatively etter natten induksjon ved 18 ˚ C (figur 3A). Dannelsen av proteiner i inklusjonslegemer er generelt antatt å være uønsket siden renaturering er noen ganger vanskelig og ikke alltid vellykket. Dette har ført til utvikling av teknikker for å forbedre proteinløseligheten, inkludert tilsetning av oppløselige proteinsekvenser 39-41. Imidlertid er proteiner er vist å besitte former konformasjonsforandringer tilstander mens isolert i inklusjonslegemer, og parametere som for eksempel lavere induksjonstemperaturer bidrar til å opprettholde disse aktive strukturer 42-46. Når et protein som bare kan uttrykkes i uløselig form er det vanligvis mulig å renatur proteinet etter isolasjon ved hjelp av enkle teknikker med svært lite avkastning tap som vi tidligere har rapportert 21.

Vi har vist hvordan du lykkes konstruere og produsere biotinylatable proteiner ved hjelp av en E. coli kloning og ekspresjon system som verts gir ca 8-10 mg / hovedkultur av 2 L. Det er viktig å merke seg at den samlede sekvens av hendelser forblir den samme ved fremstilling av nye rekombinante proteiner (figur 1), men hver tilpasset gjort protein bør behandles på en sak til sak for å finne ut hvordan du spesifikt produsere den høyeste avkastningen av renset produkt. Vi har vist hvordan NGF og Sema3A oppfører seg forskjellig i samme dyrking systemet og hvordan du kan optimalisere sin produksjon. I tillegg er vi nå bruker en annen E. coli B vert belastning som kan biotinylere in vivo 47 for andre mål proteiner, noe som viser viktigheten av oppholdet ig godt informert om den pågående fremskritt og modifikasjoner angå rekombinant protein engineering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke The University of Akron for finansiering som støttet dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% Chem-Impex International 127 100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol Chem-Impex International 642 250 ml
Acetic acid, glacial EMD AX0073-9 2.5 L
Agar Bioshop AGR001.500 500 g
Ampicillin sodium salt  Sigma-Aldrich A9518 25 g
Antifoam 204 Sigma-Aldrich A6426 500 g
Barstar-NGF pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 1 ml; Expression Host
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916 500 ml
BugBuster Novagen 70922-3 100 ml
Gel filtration standard Bio-Rad 151-1901 6 vials
Glycerol Bioshop GLY001.1 1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride Chem-Impex International 152 1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88222 100 ml
Hydrochloric acid EMD HX0603-3 2.5 L
Imidazole  Chem-Impex International 418 250 g
IPTG Chem-Impex International 194 100 g
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface Chem-Impex International 270 500 g
LB Broth   Sigma-Aldrich L3022 1 kg
NovaBlue Competent Cells Novagen 69825 1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK 10 pack
Potassium Chloride Chem-Impex International 01247 1 kg
Sema3A-pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 1 L
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG 1 kg
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 500 g
Sodium phosphate diabasic Sigma-Aldrich S5136-500G 500 g
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 500 g
Terrific Broth Bioshop TER409.5 5 kg
Tetracycline hydrochloride Chem-Impex International 667 25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x Bio-Rad 1610732 1 L
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503 1 kg
Tryptone, pancreatic EMD 1.07213.1000 1 kg
Yeast extract, granulated EMD 1.03753.0500 500 g
 ÄKTApurifier10 GE Healthcare 28-4062-64 Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000 MAXQ 4000
BirA500 Avidity BirA500 Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette Thermo Scientific 66380 Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories 132127, 132129 MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923 GE Healthcare 11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit Invitrogen 1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C GE Healthcare 18-6083-13
Fraction Collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00 Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator  VWR 13271-102 Model 1156D
Heating Oven FD Series Binder Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg GE Healthcare 17-1069-01 Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge Beckman Coulter 393126
JA 25.50 Rotor Beckman Coulter 363055
JLA 8.1 Rotor Beckman Coulter 969329 Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor Beckman Coulter 368690
Laminar Flow Hood Themo Scientific 1849 Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader TECAN infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8004 4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels Bio-Rad 456-9036 Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column Bio-Rad 737-2512 49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit Omega Bio-Tek D6943-01
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 164-5052 250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes VWR 3119-0050 50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators Corning 431488, 431483  20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service GenScript USA Inc. Protein Services
Ultrasonic Processor  Cole-Parmer 18910445A Model CV18
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236 Model G560

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
  2. Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).
  3. Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).
  4. Sengupta, D., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).
  5. Kamionka, M. Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli. Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).
  6. Rao, A. G. The outlook for protein engineering in crop improvement. Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).
  7. Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).
  8. Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes. Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).
  9. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), (2011).
  10. McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).
  11. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli. B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).
  12. Novagen pET System Manual. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).
  13. Balbas, P., Bolivar, F. Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli. Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).
  14. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).
  15. Dubendorff, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  16. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
  17. Tucker, J., Grisshammer, R. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).
  18. Schatz, P. J. Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli). Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
  19. Anfinsen, C. B. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181 (4096), 223-230 (1973).
  20. Villaverde, A., Carrio, M. M. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).
  21. Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).
  22. Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate. J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).
  23. Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. 3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds. PLoS One. 7 (11), (2012).
  24. McCormick, A. M., Leipzig, N. D. Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).
  25. Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. High-throughput biotinylation of proteins. Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).
  26. Bayer, E. A., Wilchek, M. Protein biotinylation. Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).
  27. Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science. 243 (4887), 85-88 (1989).
  28. Chen, I., Ting, A. Y. Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).
  29. Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).
  30. Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies. Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).
  31. Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane. J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).
  32. Cull, M. G., Schatz, P. J. Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags. Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).
  33. Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds. Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).
  34. Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials. Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).
  35. Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions. Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).
  36. Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli. Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).
  37. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).
  38. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  39. Marston, F. A. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).
  40. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).
  41. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  42. de Groot, N. S., Ventura, S. Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies. FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).
  43. Ventura, S., Villaverde, A. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).
  44. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).
  45. Peternel, S., Komel, R. Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells. Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).
  46. Garcia-Fruitos, E. Inclusion bodies: a new concept. Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).
  47. Li, Y., Sousa, R. Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation. Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).

Tags

Bioteknologi protein engineering rekombinant protein produksjon AviTag Bira biotinylering PET vektorsystem, Inkludering organer Ni-NTA størrelse utelukkelse kromatografi
Expression, Isolation, og Rensing av løselig og uløselig Biotinylated Proteiner for nervevev Regeneration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCormick, A. M., Jarmusik, N. A.,… More

McCormick, A. M., Jarmusik, N. A., Endrizzi, E. J., Leipzig, N. D. Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (83), e51295, doi:10.3791/51295 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter