Summary
Utveckla biotinylatable fusionsproteiner har många potentiella tillämpningar inom olika forskningsområden. Rekombinant protein engineering är en rättfram procedur, som är kostnadseffektiv och ger höga utbyten av skräddarsydda proteiner.
Abstract
Rekombinant protein engineering har utnyttjat Escherichia coli (E. coli) expressionssystem för nästan 4 decennier och idag E. coli är fortfarande den mest använda värdorganismen. Flexibiliteten hos systemet tillåter tillägg av delar, såsom en biotin-tag (för streptavidin växelverkan) och större funktionella proteiner såsom grönfluorescerande protein eller körsbärsröd protein. Dessutom har integrationen av onaturliga aminosyror såsom metalljon-kelater, unikt reaktiva funktionella grupper, spektroskopiska prober, och molekyler överförande posttranslationella modifieringar aktiverat bättre manipulering av proteinegenskaper och funktioner. Som ett resultat av denna teknik skapar anpassningsfusionsproteiner som erbjuder betydande verktyg för olika forskningsområden. Mer specifikt har det biotinylatable proteinsekvensen införlivats i många målproteiner grund av den höga affinitetsväxelverkan mellan biotin med avidin och streptavidin. Detta tillägg har hjälpt till att förbättra upptäckt och rening av märkta proteiner samt öppnar för sekundära applikationer såsom cellsortering. Således biotinmärkta molekylerna visar en ökande och utbredd inflytande i bioindustrial och biomedicinska områden. För vår forskning har vi konstruerat rekombinanta biotinylerad fusionsproteiner som innehåller nervtillväxtfaktorn (NGF) och semaphorin3A (Sema3A) funktionella regioner. Vi har tidigare rapporterat om hur dessa biotinylerade fusionsproteiner, tillsammans med andra aktiva proteinsekvenser, kan vara bundna till biomaterial för vävnadsteknik och regenerativ ändamål. Detta protokoll beskriver grunderna i teknisk biotinylatable proteiner i milligram skala, att använda en T7-lac inducerbar vektor och E. coli-uttrycksvärdar, med start från transformations att skala upp och rening.
Introduction
Proteiner täcker ett brett spektrum av biomolekyler som är ansvariga för många biologiska funktioner, vilket slutligen leder till korrekt vävnadsbildning och organisation. Dessa molekyler initiera tusentals signalvägar som kontrollerar uppreglering och / eller nedreglering av gener och andra proteiner, bibehålla jämvikt inom den mänskliga kroppen. Rubbning av ett enda protein påverkar hela denna bana av signaler, vilket kan leda till uppkomsten av förödande störningar eller sjukdomar. Engineering enskilda proteiner i labbet erbjuder en lösning för att motverka dessa negativa effekter och erbjuder ett alternativ till småmolekylära läkemedel. År 1977, en gen som kodar för 14 aminosyror somatostatin sekvensen var en av de första modifierade polypeptider som skapats med hjälp av E. coli 1. Strax efter 1979, var insulin klonad i plasmiden pBR322, förvandlas, uttryckt och renat 2. Sedan dess har rekombinanta proteiner utökat sitt inflytande till flera områden av resök såsom biomaterial, drug delivery, vävnadsteknik, biologiska läkemedel, jordbruk, industriella enzymer, biobränslen etc. (för översikter se referenserna 3-8). Detta är till stor del på grund av den mångsidighet som tekniken erbjuder via tillsättning av applikationsspecifika kemiska delar eller proteinsekvenser för syften, inklusive, men inte begränsat till, målprotein identifiering, stabilisering och rening.
Via rekombinant DNA-teknologi kan rekombinanta proteiner som uttrycks i en mångfald eukaryota och prokaryota värdsystem inkluderande däggdjurs-, växt-, insekts-, jäst, svamp eller bakterier. Varje värd har olika fördelar och oftast det bästa systemet bestäms utifrån proteinfunktion, avkastning, stabilitet, totalkostnad, och skalbarhet. Bakterier celler saknar ofta de post-translationell modifiering mekanismer som eukaryota värdar ger (dvs. glykosylering, disulfid brygg, e tc.) 5. Som ett resultat, däggdjurs-och insekts system brukar leda till bättre kompatibilitet och uttryck av eukaryota proteiner, men dessa värdar är oftast dyrare och mer tidskrävande 9. Därför E. coli är gynnad värd för vår expressionssystem eftersom cellerna expandera snabbt i billiga tillväxtförhållanden och de genetiska uttryck mekanismerna är väl förstådda 5,9. Dessutom är det lätt att skala upp för produktion och som resulterar i funktionella proteiner trots frånvaro av posttranslationella modifieringar 10 detta system. Den E. coli K12 stam väljs i detta protokoll för kloning eftersom denna stam erbjuder utmärkta plasmid avkastning baserade på hög omvandlingseffektivitet. Dessutom en E. coli BL21-stammen användes för expression eftersom denna värdstammen innehåller T7-RNA-polymerasgenen som ger kontrollerad proteinexpression och stabilitet 11.
tält "> Efter värd val, skall ytterligare försiktighet iakttas i valet den perfekta expressionsvektor för att underlätta utvalda och kontrollerade proteinuttryck. Syntetisera rekombinanta proteiner börjar med en mål-DNA-sekvens som är klonade under ledning av bakteriofag T7 transkription och signaler översättning, och expression induceras i värdceller som innehåller kromosomala kopior av T7-RNA-polymerasgenen 12. Dessa vektorer, härledda från plasmid pBR322 (för översikt se referens 13), är tätt kontrolleras av den T7-promotor som ursprungligen utvecklats av Studier och kollegor 14 och ge ytterligare kontroll genom införande av det lac-operatorn och lac-repressorn (lac1) 15,16. För rekombinant proteinteknik, erbjuder denna expressionssystem förmågan att skräddarsy en särskild aminosyrasekvensen för ett önskat protein genom att sätta in olika mål-DNA-sekvenser eller för att skapa fusionsproteiner består av kombinerad domäns från enstaka proteiner. Dessutom kan vissa vektor serien är peptid tag ändringar som skall placeras på N-eller C-terminalen. För våra designändamål var taggen en histidin (His) sattes till DNA-målsekvensen för rening och en 15 aminosyra biotinylatable sekvensen inkluderades för biotinylering 17,18. I detta protokoll en plasmid innehållande en ampicillinresistensgen, valdes för att genomföra våra biotinylatable fusionsproteinsekvenser. Uttryck styrs i denna vektor via T7-lac-promotorn och är lätt induceras med isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG).Test uttryck (småskaliga kulturer) används för att bestämma närvaron och lösligheten av målproteinet, vilket kan uttryckas i antingen en löslig eller olöslig form formulera reningsförfaranden. Ett lösligt protein som uttrycks i bakteriecellen genomgår spontan vikning för att behålla sin ursprungliga struktur 19. Typiskt den nativastruktur är termodynamiskt gynnsam. I många fall kan den metaboliska aktiviteten hos värden är inte bidrar till målproteinet, placera stress på det system som leder till olösliga proteinproduktion och bildning av inklusionskroppar som består av olösliga proteinaggregat. Således målproteinet denaturerar, gör dem generellt biologiskt inaktiva 20. Båda testuttryck skalas upp och isoleringsförfaranden bestäms av lösligheten av målproteinet. Ytterligare en renaturering eller återveck steg krävs för olösliga proteiner. De resulterande rekombinanta proteinerna kan renas ytterligare med användning av storleksuteslutningskromatografi.
I huset rekombinant proteinproduktion ger kostnadsfördelar över kommersiella produkter eftersom milligram målprotein kan isoleras per liter huvudkulturen. Det mesta av den nödvändiga utrustningen är tillgänglig i ett typiskt biologiskt eller kemiskt laboratorium. Protein engineering möjliggör skapandeav anpassade fusionsproteiner med kompletterande funktioner som inte alltid är tillgängliga i handeln. Figur 1 visar de viktigaste förfarandena som är involverade i konstruktion av rekombinanta proteiner. Med detta expressionssystem har vi skapat många biotinylatable proteiner, såsom interferon-gamma, platelet-derived growth factor, och ben-morphogenetic protein 21-23, men vi kommer att fokusera på två proteiner som vi utformade för Axon vägledning, NGF (29 kDa ) och Sema3A (91 kDa) 10 (för översikt se referens 24). Biotinylering är en vanlig teknik för identifiering, immobilisering och isolering av märkta proteiner som utnyttjar den välkända biotin-streptavidin samspel 25-27. Biofysiska sonder 28,29, Biosensors 30, och kvantprickar 31 är några exempel på system som utnyttjar den höga affiniteten av biotin-streptavidin konjugering med ett Kd i storleksordningen 10 -15 M 27. Den E. coli biotenn-ligas, BirA, stöd i den kovalenta bindningen av biotin till lysinsidokedja finns inom biotinmärkta sekvens 18,32. Internetdelning biotin material och biomolekyler har producerat ihållande leverans av tillväxtfaktorer till cell för flera vävnadstekniska tillämpningar 21,33-35. Därför engineering dessa skräddarsydda biotinylatable proteiner är ett kraftfullt verktyg som kan överskrida flera forskningsintressen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Projektering av målprotein
- Med hjälp av National Center for Biotechnology Information webbplats (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhålla en amino sekvens för målproteinet med hänsyn till arten av intresse och eventuella splitsvarianter. Välj den aminosyrasekvens som motsvarar den aktiva regionen av intresse för proteinet.
Obs! Sema3A ades aminosyrorna 21-747 valt. Ett fusionsprotein designades med NGF där sekvensen av barstar, aminosyra 1 till 90, tillsattes till NGF-aminosyrorna 122-241. - Till N-terminalen lägger föl sekvenser: 6X-His tag för rening (hhhhhh), Tobacco Etch Virus (TEV) proteas snitt platsen för borttagning av Hans tag (ENLYFQG), biotin taggade sekvens för biotinylering av protein vid K (GLNDIFEAQKIEWHE) och flexibla gångjärn med luckor som gör att utrymme för korrekt proteinvecknings (EFPKPSTPPGSSGGAP).
Anmärkning: Dessa sekvenser kan variera beroende på det önskade fusions protein. - Skicka fullständig aminosyrasekvens till ett företag för gen design / optimering för värd önskade arter och syntes. Subklona in i en vektor med knappen BamHI-Notl-stället med hjälp av en sats eller genom att använda kommersiella tjänster.
2. Making agarplattor
OBS: Det är mycket viktigt att alla lager av antibiotika, tallrikar, buffertar etc. är ordentligt lagrade (temperatur och varaktighet) och förbli fri från proteaser (steriliserad).
- Väg upp agar på 1,5 vikt% och lysogeny buljong (LB) på 20 g / L och placera i en glasmedieflaska. En 500 ml flaska gör cirka 15 plattor.
- Volumetriskt tillultrarent vatten, blanda väl, och autoklav.
- Låt flaskan sval vid beröring och lägga till lämpliga antibiotika. Undvika för tidig stelning av agar, men om flaskan kyls för mycket och lösningen börjar att stelna, värma i mikrovågsugn.
OBS: Vår plasmid innehåller en ampicillin motstånd gene. Därför måste alla steg innehåller ampicillin vid 100 pg / ml. Den E. coli kloning K12 stam kräver tetracyklin (12,5 ng / ml) antibiotika. BL21 bakterieceller kräver ingen ytterligare antibiotika. - Häll 25-30 ml lösning i 90 mm petriskålar och ge tid för att torka.
- Tillverkare skålen med lämpliga antibiotika och lagra upp och ned i 4 ° C, med Parafilm eller i en återförslutningsbar påse.
Anm: Plattorna är bra för ungefär en månad.
3. Kloning av biotinmärkta Plasmid
OBS: Villkor görs aseptiskt.
- Centrifugera ner plasmidvektor vid 6000 x g under 3 min för att pelletera, och tillsätt 10 | il av steriliserat ultrarent vatten.
- Avlägsna 50 pl kemiskt kompetent E. coli hög omvandlingseffektivitet celler från -80 ° C och omedelbart placera på is i 5-10 min.
- Tillsätt 1 l av vektor-lösning på 0,5-1 ng/5056, l celler till 50 ^ E. coli-celler och placera återstående plasmiden i -80 ° C.
- Placera bakterieceller innehållande vektorn på is under 5 min.
- Värmechock cellen och vektorblandningen under 30 till 45 sek i 42 ° C vattenbad och placera celler tillbaka på is under 2 min.
- Addera 250 pl av super optimal buljong med katabolitrepression (SOC)-medium (2% vikt / volym Bacto-trypton, 0,5% vikt / volym Bacto-jästextrakt, 8,56 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO 4, 20 mM glukos , ultrarent vatten, pH = 7,0) och skaka vid 250 rpm vid 37 ° C under 30 min.
OBS: SOC ska inte autoklaveras utan att filtret steriliseras genom ett 0,22 ìm filter. - Torra plattor 10-15 min före plätering celler.
- Pipettera 25, 50, och 100 | il av cellösningen på separata agarplattor innehållande ampicillin (100 | ig / ml) och tetracyklin (12,5 pg / ml) antibiotika. Använd glaspärlor för att fördela lösningen jämnt över agarplattor. <li> Inkubera plattorna upp och ned vid 37 ° C under 15-18 timmar.
- Kontrollera för små enskilda bakteriekolonier på plattor och lagra upp och ned vid 4 ° C fram till användning (Figur 2A).
- Om inga kolonier finns:
- Kontrollera färskhet och sterilitet av buffertar och förnödenheter.
- Öka mängden plasmid sattes till E. coli K12 stam.
- Om stora kolonier finns eller om det finns en överväxt av kolonier (Figur 2B och 2C), restreak en ny agarplatta med en steril ympning slinga eller plattceller vid lägre volym.
- Om inga kolonier finns:
- Inokulera 5 ml LB innehållande ampicillin (100 pg / ml) och tetracyklin (12,5 pg / ml) antibiotika med en enda koloni av den transformerade E. coli-celler. Odla upp cellerna över natten vid 37 ° C vid 250 till 300 rpm.
- Följande dag, använd en plasmid isolering kit för att isolera målvektorn från natten grow-upp och lagra renades plasmiden vid -80 ° C tills vidare användning.
- Tillval: Kontrollera renhet och koncentration av plasmid med hjälp absorbansavläsning erhålls vid 260 och 280 nm.
4. Transformation av plasmiden i expressionsvärden
OBS: Villkor görs aseptiskt.
- Upprepa steg från 3,2 till 3,10 för E. coli BL21-celler med följande ändringar:
Anm: BL21-celler som inte kräver några ytterligare antibiotika, därför endast ampicillin sättes till agarplattorna för transformation.- Lägg 2-5 l av isolerade plasmid vid 0.5-2 ng/50 pl celler från steg 3,12 till 50 pl E. coli-expressionsvärdceller.
- Heat shock celler för 60-90 sek.
- Skaka lösningen innehållande SOC-medium vid 250 rpm under 60 minuter i stället för 30 min.
- Plocka en enda koloni av transformerade bakterieceller från en petriskål med en sterile applikatorpinne och placera detta i ett provrör innehållande 5 ml LB-buljong med lämplig koncentration av ampicillin (100 | ig / ml).
- Placera provrören i skakapparat över natten vid 37 ° C vid 250 rpm.
- Följande morgon, ta 200 l av dags växa upp och lägga till den i 5 ml LB innehållande ampicillin vid 100 mikrogram / ml.
- Frys ner de återstående cellerna med 250 l 50% glycerol (steril) till 750 pl kultur och hålla i -80 ° C.
OBS: Nytt test uttryck och skala upp rutiner kan göras med hjälp av en steril applikator pinne för att få en skrapning av frusna celler och ympa LB med lämpliga antibiotika. - Placera provröret i skakapparat vid 250 till 300 rpm vid 37 ° C tills den optiska densiteten (OD) mäts mellan 0,7 till 0,8 vid en absorbans av 600 nm.
- Inducera cellerna med IPTG vid en slutlig koncentration av 1 mM.
- Skaka om under ytterligare 4 h vid 37 ° C vid 300 rpm. Alternativt celler kan ocksåskakas över natt vid 18 ° C vid 250 till 300 rpm. Detta kan ge ett högre utbyte av plasmid beroende på målproteinet.
- Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) Analys av testuttryck
- Ta 500 l av kultur och plats i en 1,5 ml tub. Spinn ner vid 13-15 xg under 5 minuter. Häll av överstående vätska och etikett "Löslig." Resuspendera pelleten med virvling i 200 | il laddningsfärg (50 | il 2-merkaptoetanol, 950 | il Laemmli-provbuffert).
Anm: Lösliga bakterie pellets kommer att användas för att bestämma om det rekombinanta proteinet är i de cytoplasmatiska regioner i bakteriecellerna. Pellets kan förvaras i -80 ° C utan att ladda färgämnet tills det behövs. En kontrollbakteriekultur som inte har omvandlats eller inducerad kan behandlas som lösligt samt för jämförelse. - Ta 1.000 l av kultur och plats i en 1,5 ml tub. Spinn ner vid 13-15 xg under 5 minuter.Häll av överstående vätska och etikett "olöslig."
OBS: Olösliga pellets kommer att genomgå denatureringsförfaranden nedan för att frigöra proteiner som finns i inklusionskroppar av bakterieceller. Pellets kan förvaras i -80 ° C tills de behövdes. En kontrollbakteriekultur som inte har omvandlats eller inducerad kan behandlas som olösligt samt för jämförelse.- Resuspendera den olösliga pelleten i 200 | il BugBuster och låt stå i rumstemperatur i 30 min.
- Spinn ner provet igen vid 13-15 xg under 5 minuter och ta 50 l av supernatanten och lägga till nya "olöslig" 1,5 ml tub.
- Tillsätt sedan 50 pl laddningsfärg till denna nya prov.
- Koka både lösliga och olösliga prover i 5 min för att denaturera proteinerna för SDS-PAGE-analys.
- Ladda varje prov i elektrofores gel med vanlig stege.
- I syfte att visualisera proteinprover använda en staining reagens och följa bolagets protokoll.
- Bestäm huruvida proteinet uttrycker i de lösliga och / eller olösliga fraktioner genom att jämföra dessa två körfält samt jämföra de köer till de lösliga och olösliga kontrollköer (se not 4.9.1 och 4.9.2) på SDS-PAGE-gel (Figur 2). Ett mörkt band bör visas runt molekylvikten av proteinet i de lösliga eller olösliga körfält. Detta kommer att avgöra vilken isoleringsförfarande för användning i protokoll 6.
OBS: Om det finns ett band i båda dessa regioner än någon isolering som används i protokoll 6 nedan kan utföras, eller proteinet kan isoleras båda hållen för att avgöra vilken isolering metoden ger ett högre utbyte av rekombinant protein (Figur 3) . - Om en 4 timmar och natten induktion genomfördes, bestämma vilken induktionsmetod har den högsta proteinproduktion för att skala upp processen (Figur 2).
5. Huvud Kultur Uppskalning Förfarande och - Ta 500 l av kultur och plats i en 1,5 ml tub. Spinn ner vid 13-15 xg under 5 minuter. Häll av överstående vätska och etikett "Löslig." Resuspendera pelleten med virvling i 200 | il laddningsfärg (50 | il 2-merkaptoetanol, 950 | il Laemmli-provbuffert).
- Förbered tillväxtmedia med 85,7 g av Terrific Broth och 28,8 ml av 50% glycerol i 1,8 L av ultrarent vatten och autoklav på flytande cykel för en timme.
- Starta en övernattning kultur från frusen cell lager skapade i steg 4,5.
OBS: Villkor görs aseptiskt.- Blanda 20 ml LB och med en slutkoncentration av ampicillin vid 100 pg / ml i en steril 125 ml Erlenmeyer-kolv.
- Med hjälp av en steril applikator pinne ta en skrotning av transformerad E. coli-celler och släppa applikator i kolven. Ta applikatorpinne och plugg kolv med skum propp eller bomull och täck med aluminiumfolie för att bibehålla sterilitet.
- Skaka om under natten vid 250 rpm vid 37 ° C.
- Huvudkultur
OBS: Villkor görs aseptiskt.- Häll över natten kultur i 1,8 L av sterila tillväxtmedier och lägg ampicillin vid 100 ng / ml och 6 till 8 droppar steril skumdämpare 204 med hjälp av en Pasteur-pipett.
- Placera kulturer i ett 37 ° C vattenbad med 0,2 mm filtrerad tryckluft bubblande i kulturer genom luftningsstenar.
- När OD 600nm når 0,7-0,8, inducerar med IPTG (1 mM) och tillåta induktion att uppstå för antingen 4 timmar vid 37 ° C eller över natt vid 18 ° C beroende på lösliga / olösliga resultat från SDS-PAGE i steg 4,9.
- Samla E. coli-celler
- Centrifugera ner cellkulturen i en L centrifugflaskor (2 flaskor / odling) under 15 minuter vid 14.000 xg vid 4 ° C.
- Häll av supernatanten och med hjälp av en tunn spatel, scoop bakterierna pellets i två 50 ml rör. Cellerna kan pelleteras igen genom centrifugering under ett par minuter.
Notera: Varje 1,8 L kultur kommer att resultera i två bakteriepellets, en i varje 50 ml centrifugeringsrör. - Förvara pellets i -80 C tills proteinisolering.
- Cellys
- Nonnative
- Ta omvandlas E. coli pellets från -80 ° C frys, och tillsätt 20 ml Lysis / tvättbuffert (tabell 1) till varje centrifugrör.
- Vortex och skaka den frusna pellets tills den tinar och solubiliserar in i buffertlösningen utan några stora bitar. Inkubera på nutator över natten. Följande morgon bör pellets nu vara en viskös uppslamning beror på denaturering av proteinet från bufferten.
- Centrifugera suspensionen vid 20500 x g vid rumstemperatur under 30 min. Överför supernatanten till ett nytt rör för isolering och kasta pelleten.
- Skaffa omvandlas E. coli pellets från -80 ° C frys.
- Lägg Lysis Buffer (tabell 1) till centrifugröret för att nå en slutlig volym på 30 ml, och få bort fryst pellets genom virvelbildning och skaka noggrant. Placera pellets på is.
- Tvätta sonikator sond med 70% etanol vid 100% amplitud under 1-2 min. Upprepa sedan med ultrarent vatten.
- Sonikera bakterier pellet medan på is i 5 minuter (total förfluten tid av 10 min).
- Ställ sonikator vid 30% amplitud med puls på 30 sek on/30 sek av.
- Bob centrifugröret upp och ned under sonikering intervall för att fullständigt bryta upp cellpelleten. I slutet av den totala förflutna tiden bör det inte finnas några synliga bakterier pellets lämnar en trådiga, trögflytande slurry.
- Rengör ultraljudsonden mellan olika protein isoleringar samt för lagring med hjälp av 70% etanol och ultrarent vatten enligt beskrivningen i steg 6.1.2.3.
- Nonnative
6. Isolering och rening av rekombinant protein
OBS: Om proteinet är belägen i den lösliga regionen baserat på SDS-PAGE analys från steg 4.9 då "Native Isolation" att användas, men för olösliga proteiner "nonnative Isolation" förfaranden kommer att utföras.
- Nonnative
- Tillsätt 1 ml Ni2 +-NTA-harts-lösning till varje centrifugrör (2 ml harts totalt för en 1,8 L kultur) och inkubera vid rumstemperatur under åtminstone 1 timme på nutator.
- Häll slam i affinitetskolonn och låt lösningen rinna genom kranen ventil helt i avfallsbägare.
- Utför 10 tvättar med 10 ml Lysis / tvättbuffert för varje tvätt.
- För de första två tvättningar, tillsätt 10 ml till centrifugröret för att avlägsna ytterligare harts och häll sedan i kolonnen. De extra tvättar kan tillsättas direkt till kolumn.
- Efter varje tvätt, rör om hartset med en glasomrörningsstav. När tvätt droppar ner i avfallsbägare, kan de närmaste 10 ml tillsättas.
- Efter tvätta helt drips igenom, stäng kranen ventil, ta bort avfall bägare och ersätt med 50 ml centrifugrör för proteinsamling.
- Tillsätt 15 ml elueringsbuffert (tabell 1) och rör upp hartset och att låta lösningen stå under 5 min. Öppna kranen ventilen och samla eluering. Upprepa igen med ytterligare 15 ml.
- Native
- Följ den externa affinitetskromatografi ovan (Steg 6.2.1.1-6.2.1.4) utom justera följande parametrar:
- Inkubera Ni2 +-NTA-harts-lösning vid 4 ° C under åtminstone 1 timme på nutator.
- Använd lämplig tvättbuffert (Tabell 1).
- Tillsätt 5 ml elueringsbuffert (tabell 1) och inkubera med hartset under 5 min.
- Öppna kranen ventilen och samla eluering tills det mesta av lösningen har droppat igenom.
- Addera 90 pl / brunn av Bradford-reagens för att ta bort 96-brunnar. Efter varje eluering tillåter 10 pl sålution droppa från kolumn i väl innehållande 90 pl Bradford reagens.
- Fortsätt att tillsätta 5 ml elueringsbuffert i taget tills Bradford-analysen inte längre känner av protein (färg går från mörkblått till ljusblått för att rensa). Det tar vanligtvis 4-5 elueringsvolymer.
- Följ den externa affinitetskromatografi ovan (Steg 6.2.1.1-6.2.1.4) utom justera följande parametrar:
- Gör nonnative (renaturering) och infödda dialysbuffertar (tabell 1) och förvara i 4 ° C.
Anm: pH-värdet hos dialysbuffertarna bestäms av målproteinet isoelektriska punkt (pl). Som en tumregel proteiner bör buffras minst en hel punkt ovanför eller nedanför deras pl-värden. - Överför infödda och externa handen elueringar till dialysslangen med lämplig molekylviktsavskärning (25.000 MWCO för NGF och 50.000 MWCO för Sema3A). Placera varje prov protein i respektive dialysbuffert 1 i 4 timmar vid 4 ° C och sedan ersätta med respektive buffert 2 övernatten vid 4 ° C.
Anm: Protein måste dialyse i varje buffert under minst 4 h för korrekt återveckning och buffertutbyte skall äga rum. - Koncentrera de dialyseprotein elueringarna till mindre än 5 ml med hjälp av centrifug spin koncentratorer.
Anm: Proteiner kan vidare renas genom användning av snabb protein-vätskekromatografi (FPLC) och koncentrerades på nytt.
- Valfritt: bestämma extinktionskoefficienten, ε, så att koncentrationen av protein kan bestämmas i framtida isoleringar genom mätning av absorbansen av ett prov vid 280 nm med användning av Lambert-Beers lag: C = A 280nm / εl, där L är väglängden.
7. Biotinylering av renat protein
- Dialysera proteiner i 10.000 MWCO dialyskassetter against 10 mM Tris (pH = 8,0), att ändra buffert varje 4 h med totalt sex ändringar.
- Överför rekombinanta proteiner (nu i 10 mM Tris-buffert) till 2 ml mikro-centrifugrör för biotinyleringen.
- Biotinylera proteiner med användning av en biotin-protein-ligassats.
- Dialysera proteiner mot PBS (pH = 7,4) med användning av 10.000 MWCO dialys kassetter med tre buffertbyten om dagen under två dagar.
- Bestäm procent biotinylering av proteiner med användning av ett kvantifieringskit.
- Bestäm koncentrationen åter såsom beskrivits i 6.4 och lagra vid 4 ° C eller alikvot och förvara vid -20 ° C för långtidsförvaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kloning och testuttryck
När plätering utförs på rätt sätt, bör enskilda isolerade kolonier bildas för att öka chanserna att plocka klonal omvandlade bakterieceller (Figur 2A). Om alltför många celler stryks, plattorna inkuberas för länge vid 37 ° C eller transformation är tveksamt, kolonier kan täcka agarplatta eller bilda större aggregat av celler (fig. 2B och 2C). Under testuttryck, NGF och Sema3A först inducerades under 4 h vid 37 ° C, och SDS-PAGE-analys bestämdes båda proteinerna var lokaliserade i den lösliga fraktionen (fig 2D). Protein uttryck verkade rättvis och därmed ett annat test uttryck med övernattning induktion vid 18 ° C undersöktes. NGF resulterade i bättre uttryck i den lösliga fraktionen, medan det inte fanns någon märkbar skillnad med Sema3A (Figur 2E).
"> Isolering, rening och BiotinylationBåde NGF och Sema3A isolerades med användning av nativa isoleringstekniker såsom beskrivits i ovanstående protokoll och köras genom FPLC-kolonn för rening. Dessutom dessa rekombinanta proteiner isolerades och renades nonnatively. Även om NGF var i den lösliga fraktionen under testuttryck, native isoleringsförfaranden gav ett lågt utbyte av NGF efter både 37 ° C (4,57 mg / huvudkultur av 2 liter) och 18 ° C (6,11 mg / huvudkultur av två L; Figur 3A, fasta linjer) induktioner. Dock ett högre utbyte av NGF som erhållits genom nonnative isolering med renaturering (10,72 ± 1,8 mg / huvudkultur 2 L, figur 3A, streckad linje) efter 18 ° C, över natten induktion. Å andra sidan, icke-nativ isolering gav ingen Sema3A produktion (Figur 3B, streckad linje) med 8,61 ± 3,1 mg / huvudkultur av två L för nativt isolering (figur 3 B, heldragen linje). Som ett resultat var NGF isoleras under externa handen förhållandena efter över natten induktion vid 18 ° C, under det att, Sema3A gick nativa isolering efter 4 h av induktion vid 37 ° C. FPLC toppar uppsamlades, och NGF-och Sema3A Proven analyserades med SDS-PAGE (fig 3). Ytterligare proteintoppar hittades i FPLC-utgång för Sema3A (Figur 3B) uppsamlades och analyserades med SDS-PAGE och inte var belägna i Sema3A molekylviktsregionen. Dessa fraktioner är mest sannolikt nedbrytningsprodukter eftersom de inte beter sig funktionellt i cellbaserade analyser som gjorde Sema3A topp visas i figur 3B. Proteiner biotinylerades med hjälp av en BirA enzym och dialyseras för att avlägsna eventuella oreagerade arter. Biotinylation bekräftades med en biotin kvantifiering kit och fluorescerande mikroplattläsare.
ftp_upload/51295/51295fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51295/51295fig1.jpg "/>
Figur 1. Protein engineering utnyttjar ett E. coli expressionssystem. Den grundläggande processen av rekombinant protein engineering innebär utformning av en plasmid för kloning och uttryck i E. coli. Transformerade kolonier selekteras med användning av antibiotika. Små prov uttryck används för att optimera och identifiera produktionen och lösligheten för målproteinet. Denna procedur skalas upp till stora satsodlingar (liters skala). Kromatografi metoder används för att isolera och rena den önskade engineered protein. Modifikationer såsom biotinylering kan ske under satsvisa odlingar eller efter rening.
Figur 2. Optimizing testet expression av NGF och Sema3A. (A) Plating 25 ul av transformerad E. coli-K12-celler resulterade i små isolerade kolonier. En enskild koloni ska väljas för testuttryck. För BL21 transformerade celler liknande koloni fördelning skulle inträffa. (BC) Plating 50 l och 100 l av K12 celler, respektive, resulterade i överbefolkning av bakteriekolonier. Plockning från dessa plattor skulle kunna resultera i en lägre sannolikhet för att välja en koloni härrörande från en enda transformerad cell. (D) Test uttryck av transformerade celler inducerades under 4 h vid 37 ° C med IPTG och SDS-PAGE visar att NGF-fusionsprotein (29 kDa) och Sema3A fusionsprotein (91 kDa) uttryckes i den lösliga fraktionen. (E) Över natten induktion vid 18 ° C visar NGF expression fortfarande i den lösliga fraktionen, dock är uttryck för Sema3A inte förbättras.
Figur 3. Rening av NGF och Sema3A använder FPLC. (A) nonnative isolering efter 18 ° C över natten induktion (streckad linje) resulterade i bättre NGF utbyten jämfört med nativt isolering på både 4 timmar, 37 ° C och över natten, 18 ° C induktioner (heldragna linjer). (B) För Sema3A, induktion vid 37 ° C under 4 h och nativt isolering tillstånd producerade bättre utbyten i jämförelse med icke-nativ isolering vid samma odlingsparametrar. SDS-PAGE visar FPLC-topp samlingar (pilar) både (A) NGF, och (B) Sema3A. En gelfiltrering proteinstandard kördes för att bekräfta molekylviktsfördelning av topparna och indikeras i bakgrunden av FPLC tomter i kDa.
| Isolering | Buffert | Komponenter |
| Nonnative | Lysis / Wash | 6 M GuHCl, 100 mM H2 NaPO 4, 10 mM Tris bas, 10 mM imidazol, pH = 8,0 |
| Eluering | 6 M GuHCl, 200 mM isättika (17,4 M) | |
| Dialys (Återställande) | Fosfatbuffrad saltlösning (PBS): 21,7 mM NaH 2 PO 4, 15,3 mM Na 2 HPO 4, 149 mM NaCl | |
| Buffert 1: PBS, 0,2 M GuHCl, 1,99 mM ditiotreitol (DTT) i 4 L ultrarent vatten, pH = 7,4 | ||
| Buffert 2: PBS i 4 L ultrarent vatten, pH = 7,4 | ||
| Native | Lysis | 50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH = 8,0 |
| Tvätta | 50 mMNaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH = 8,0 | |
| Eluering | 50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH = 8,0 | |
| Dialys | Fosfatbuffrad saltlösning (PBS): 21,7 mM NaH 2 PO 4, 15,3 mM Na 2 HPO 4, 149 mM NaCl | |
| Buffert 1: PBS, 1,99 mM DTT i 4 L ultrarent vatten, pH = 7,4 | ||
| Buffert 2: PBS i 4 L ultrarent vatten, pH = 7,4 |
Tabell 1. Rekombinanta proteinisolering buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rekombinant protein engineering är en mycket kraftfull teknik som spänner över många discipliner. Det är kostnadseffektivt, avstämbara och en relativt enkel procedur, vilket gör att produktionen av höga utbyten av skräddarsydda proteiner. Det är viktigt att notera att konstruera och uttrycka målproteiner är inte alltid enkelt. Basal uttryck och rekombinanta proteinstabilitet är beroende av specifika val av vektor, E. coli-cellstammar, peptidmärkning additioner och odlingsparametrar. Vår specifika utformningen kriterium utnyttjar väletablerade E. coli-stammar för protein engineering. Dessutom innehåller plasmidvektor en T7-lac-promotor och ampicillinresistensgen för stabilt uttryck av rekombinant protein.
Efter erhållande av högrenad subklonade plasmiden, är att framgångsrikt omvandla målproteinet in i värdcellen och bestämma lösligheten av den första huvudförfarandetproteinet. Test uttryck är den bästa tiden att optimera syntesen av målproteinet. Det är viktigt att plocka små, isolerade kolonier (Figur 2A) för att säkerställa ett bättre val av bakterieceller som innehåller plasmiden. Felsökning strategier såsom restreaking att omfördela kolonierna eller inkubera agarplattor under kortare tidsperioder kunde bistå i bättre koloniformationer. Det är ingen överraskning att rekombinant proteinproduktion framkallar stress på värdstammen 36. Under detta skede, om uttrycket är dålig, kan faktorer som antibiotika och IPTG koncentration samt induktionstiden och temperaturen justeras för att uppnå den optimala målprotein (för recensioner visa 37-38). Detta sågs för NGF var det bästa uttrycket berodde natten induktion vid 18 ˚ C (Figur 2E).
Sema3A gav proteinproduktion för nativa betingelser men nonnative isolering visade ingen proteinproduktion (Figur 3B). Huvudsakliga kulturer av NGF inducerades i 4 timmar vid 37 ˚ C samt över natten vid 18 ˚ C och isolerades under nativa betingelser. FPLC rening gav ett lägre utbyte av NGF i jämförelse med huvud kulturer som isolerades nonnatively efter natten induktion vid 18 ˚ C (Figur 3A). Bildningen av proteiner i inklusionskroppar i allmänhet tros vara oönskad eftersom renaturering är ibland svårt och inte alltid framgångsrik. Detta har lett till utvecklingen av metoder för att förbättra proteinlöslighet inklusive tillägg av lösliga proteinsekvenser 39-41. Men proteiner visat sig ha former av konforma stater medan isolerade i inklusionskroppar, och parametrar som lägre induktionstemperaturer bidrar till att upprätthålla dessa aktiva strukturer 42-46. När ett protein som endast kan uttryckas i den olösliga formen är det vanligtvis möjligt att åternatur proteinet efter isolering med hjälp av enkla tekniker med mycket liten förlust avkastning som vi tidigare har rapporterat 21.
Vi har visat hur man framgångsrikt konstruera och producera biotinylatable proteiner med hjälp av ett E. coli-klonings-och expressionssystem som värd i utbyte ge ca 8-10 mg / huvudkultur av två L. Det är viktigt att notera att den totala sekvensen av händelser som förblir densamma vid framställning av nya rekombinanta proteiner (Figur 1), men var och en skräddarsydd gjorde protein bör behandlas från fall till fall för att avgöra hur man specifikt producera den högsta avkastningen av renad produkt. Vi har visat hur NGF och Sema3A beter sig olika i samma odlingssystemet och hur man kan optimera sin produktion. Dessutom är vi för närvarande använder en annan E. coli B värdstam som kan biotinylera in vivo 47 för andra målproteiner, vilket visar vikten av Staying välinformerad om de pågående framsteg och förändringar avseende rekombinant protein engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för The University of Akron för finansieringen som stött detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
| 2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
| Acetic acid, glacial | EMD | AX0073-9 | 2.5 L |
| Agar | Bioshop | AGR001.500 | 500 g |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | 25 g |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich | A6426 | 500 g |
| Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | 1 ml; Expression Host |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
| Gel filtration standard | Bio-Rad | 151-1901 | 6 vials |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
| Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
| His-Pur Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-3 | 2.5 L |
| Imidazole | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
| Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | 1 kg |
| NovaBlue Competent Cells | Novagen | 69825 | 1 ml; Cloning Host |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Potassium Chloride | Chem-Impex International | 01247 | 1 kg |
| Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1 kg |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| Sodium phosphate diabasic | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500 g |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | 500 g |
| Terrific Broth | Bioshop | TER409.5 | 5 kg |
| Tetracycline hydrochloride | Chem-Impex International | 667 | 25 g |
| Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x | Bio-Rad | 1610732 | 1 L |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Tryptone, pancreatic | EMD | 1.07213.1000 | 1 kg |
| Yeast extract, granulated | EMD | 1.03753.0500 | 500 g |
| ÄKTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | Includes kits and accessories |
| Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution |
| Dialysis Casette | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (Extra Strength) |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories | 132127, 132129 | MWCO: 25,000 and 50,000 |
| Flow Diversion Valve FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit | Invitrogen | 1094598 | |
| Frac-950 Tube Racks, Rack C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| Fraction Collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | Includes kits and accessories |
| Heated/Refrigerated Circulator | VWR | 13271-102 | Model 1156D |
| Heating Oven FD Series | Binder | Model FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | 393126 | |
| JA 25.50 Rotor | Beckman Coulter | 363055 | |
| JLA 8.1 Rotor | Beckman Coulter | 969329 | Includes 1 L polyporpylene bottles |
| JS 5.3 Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Laminar Flow Hood | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 Series Clean Bench |
| Microplate Reader | TECAN | infinite M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel vertical electrophoresis system |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels | Bio-Rad | 456-9036 | Any kDa, 15-well comb |
| Ni-NTA Column | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml volume ECONO-Column |
| Plasmid Miniprep Kit | Omega Bio-Tek | D6943-01 | |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
| Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes | VWR | 3119-0050 | 50 ml tubes for JA 25.50 rotor |
| Spin-X UF Concentrators | Corning | 431488, 431483 | 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da |
| Subcloning Service | GenScript USA Inc. | Protein Services | |
| Ultrasonic Processor | Cole-Parmer | 18910445A | Model CV18 |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 |
References
- Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
- Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).
- Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).
- Sengupta, D., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).
- Kamionka, M. Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli. Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).
- Rao, A. G. The outlook for protein engineering in crop improvement. Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).
- Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).
- Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes. Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).
- Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), (2011).
- McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).
- Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli. B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).
- Novagen pET System Manual. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).
- Balbas, P., Bolivar, F. Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli. Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).
- Dubendorff, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
- Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
- Tucker, J., Grisshammer, R. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).
- Schatz, P. J. Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli). Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- Anfinsen, C. B. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181 (4096), 223-230 (1973).
- Villaverde, A., Carrio, M. M. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).
- Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).
- Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate. J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).
- Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. 3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds. PLoS One. 7 (11), (2012).
- McCormick, A. M., Leipzig, N. D. Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).
- Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. High-throughput biotinylation of proteins. Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).
- Bayer, E. A., Wilchek, M. Protein biotinylation. Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).
- Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science. 243 (4887), 85-88 (1989).
- Chen, I., Ting, A. Y. Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).
- Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies. Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).
- Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane. J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).
- Cull, M. G., Schatz, P. J. Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags. Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).
- Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds. Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).
- Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials. Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).
- Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions. Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).
- Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli. Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).
- Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Marston, F. A. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).
- de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
- de Groot, N. S., Ventura, S. Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies. FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).
- Ventura, S., Villaverde, A. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).
- Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).
- Peternel, S., Komel, R. Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells. Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).
- Garcia-Fruitos, E. Inclusion bodies: a new concept. Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).
- Li, Y., Sousa, R. Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation. Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).
