Summary
DNBS / TNBS induzierte Colitis bietet eine alternative und kostengünstige Methode, um die Pathobiologie von entzündlichen Darmerkrankungen zu untersuchen. Die in diesem Papier diskutiert Protokoll beschreibt die erfolgreiche Anwendung von DNBS Colitis bei Mäusen und Ratten zu induzieren, und erlaubt es, Host-Mediated-Darm-Reaktionen gründlich zu studieren.
Abstract
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, sind seit langem mit einer genetischen Basis gebracht worden, und vor kurzem Gastgeber Immunantwort auf mikrobielle und Umweltfaktoren. Dinitrobenzolsulfonsäurelösung (DNBS)-induzierte Colitis ermöglicht es, die Pathogenese der IBD damit verbundenen Umwelt Auslöser wie Stress und Ernährung, die Auswirkungen von möglichen Therapien, und die zugrunde liegenden Mechanismen Darmentzündung und Schädigung der Schleimhaut zu studieren. In dieser Arbeit untersuchten wir die Wirkungen von diätetischen n-3 und n-6-Fettsäuren von der Kolon-Schleimhaut-entzündliche Reaktion auf DNBS-induzierte Colitis bei Ratten. Alle Ratten wurden identisch Diäten mit Ausnahme der verschiedenen Arten von Fettsäuren gefüttert [Färberdistelöl (SO), Rapsöl (CO), oder Fischöl (FO)] drei Wochen vor der Belichtung mit DNBS Intrarectale. Steuer Ratten intrarektalen Ethanol weiter an Gewicht über der 5-Tage-Studie, während DNBS behandelten Ratten Lipid Diäten alle lost Gewicht mit FO-und CO-gefütterten Ratten zeigen signifikanten Gewichtsverlust von 48 h und Ratten SO von 72 Stunden zugeführt. Gewichtszunahme wieder nach 72 Stunden nach DNBS, und um 5 Tage nach DNBS hatte der FO-Gruppe einen höheren Körpergewicht als SO oder CO-Gruppen. Darmabschnitten sammelte 5 Tage nach der Behandlung zeigte DNBS-Brenngeschwürbildung, Krypta Zerstörung, Becher-Zell-Depletion und Schleimhaut Infiltration von akuten und chronischen Entzündungszellen, die in ihrer Schwere unter Diätgruppen unterschieden. Die SO zugeführt Gruppe zeigte die schwersten Schäden, gefolgt von der CO und FO gefüttert Gruppen, die die mildesten Grad der Gewebeverletzung zeigte. Ebenso Kolon Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität, einem Marker der Neutrophilen-Aktivität war signifikant höher in SO durch CO gefütterten Ratten gefolgt, mit LWL-gefütterten Ratten mit deutlich niedrigeren MPO-Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen die Verwendung von DNBS-induzierte Colitis, wie in diesem Protokoll beschrieben, um den Einfluss der Ernährung bei der Pathogenese von IBD zu bestimmen.
Introduction
Entzündliche Darmerkrankungen (IBD) ist durch eine chronische rezidivierende Entzündung im Magen-Darm-Trakt (GI) gekennzeichnet, was zu Symptome von Durchfall, Gewichtsverlust, und Bauchschmerzen. Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD) sind die beiden Hauptformen von IBD und kann von dem Ort der Entzündung im Gastrointestinaltrakt zu unterscheiden. In UC-Patienten, die Entzündung umfasst in der Regel das Rektum und erstreckt sich lückenlos bis der Doppelpunkt für einen variablen Umfang, die nur die oberflächlichen Schleimhaut. Im Gegensatz dazu kann CD jeden Teil des GI-Trakt beeinflussen, obwohl es betrifft vor allem das Ileum und Blinddarm. CD häufig manifestiert sich als transmurale Entzündung häufig mit Granulome verbunden und führt zu Strikturen (fibrostenotischen) und / oder das Eindringen (Fistel) Krankheit. Obwohl die Ätiologie der IBD bleibt schwer zu fassen, ist es gut möglich, dass IBD ist multifaktoriell, an denen Wechselwirkungen zwischen den Hosts Immunsystems, genetische Anfälligkeit und verantwortungsses für Umwelt-und mikrobielle Faktoren.
Bisher wurden verschiedene Modelle von IBD vorgeschlagen worden, die verschiedene klinische, histologische und Immunantworten Charakteristik UC und CD anzuzeigen. Die am häufigsten verwendeten Modelle sind mit genetisch veränderten Mäusen (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), Infektionen induziert Modelle (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), Adoptivtransfermodelle (CD45 + RB High, CD62L +-Zelltransfer in SCID-Mäuse) und chemisch induzierte Colitis Modelle (Dextran-Natriumsulfat (DSS), Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) und Dinitrobenzolsulfonsäurelösung (DNBS)). Aufgrund ihrer geringen Kosten und schnelles Einsetzen der Krankheit werden chemische Modelle als von unschätzbarem Wert für die Untersuchung der verschiedenen Aspekte der IBD. Jeder der chemischen ulcerosa Modelle aufgelistet hat Vorteile sowie Einschränkungen in einigen Aspekten ihrer klinischen, histologischen und immunologischen Bedeutung für IBD. DSS ist eines der eingesetzten coli zu induzieren häufigsten chemischen Methodentis bei Nagern ein. Die Verabreichung von 3-10% DSS (MW: 42 kDa) für 7-10 Tage im Trinkwasser von Mäusen können Symptome und Anzeichen einer Kolitis einschließlich Gewichtsverlust, Durchfall mit Blut, Darmverkürzung, Schleimhautgeschwüren und neutrophile Infiltration zu induzieren. Dieses Modell ist besonders nützlich für Wirkstoff-Screening-Studien, sowie die Erforschung der Mechanismen der epithelialen Regeneration, die Auswirkungen der angeborenen Immunität auf Schleimhaut-Homöostase und die Rolle von Entzündungen bei der Förderung der Darm Dysplasie und Adenokarzinom Entwicklung. Es gibt jedoch einige Nachteile, die DSS-Modell, einschließlich einer Variation der Konzentration des DSS erforderlich ulcerosa in verschiedenen Tiereinrichtungen zu induzieren, sowie inkonsistent Wasseraufnahme durch Mäuse und somit inkonsistent Einwirkung von DSS, was zu einer Variation in dem Ausmaß, Umfang und Verteilung der Schädigung der Schleimhaut und Geschwüre im Dickdarm. All diese Eigenschaften führen zu Heterogenität der Ergebnisse und die Fähigkeit, Ergebnisse in Studien fr vergleichen begrenzenom verschiedenen Forschungsgruppen.
Eine Alternative zu der DSS-Modell ist die Hapten-induzierte DNBS oder TNBS Modelle ulcerosa. Dieses Modell setzt die rektale Applikation von der Schleimhaut Sensibilisierungsmitteln DNBS oder TNBS, in unterschiedlichen Konzentrationen von Ethanol verdünnt. Die Verabreichung von Ethanol ist eine Voraussetzung, um den Dickdarm Schleimhaut-Barriere zu brechen, um das Eindringen von DNBS oder TNBS in die Lamina propria zu ermöglichen. DNBS / TNBS dann haptenize die lokalisierten Kolon-und Darm mikrobielle Proteine immunogen zu werden, wodurch die Gastgeber angeborenen und adaptiven Immunantworten Triggerung. In der Regel wird dieses Modell mit schweren und manchmal blutigen Durchfall, Gewichtsverlust und Darmwandverdickung jedoch Symptome variieren je nach der Art von Nagetier verwendet wird, als auch den Zeitpunkt, Dosis und der Grad der Belastung durch die DNBS oder TNBS in das verwendete verbunden Studie. Wichtige Unterschiede zwischen Ratten und Mäusen sollte angemerkt werden, mit den Vorteilen der geringeren Kosten für den Kauf und Verpflegung, sowie lower Körpermasse für abnehmende pro-Tier Kosten der Behandlung in vivo. Dies sollte gegen die schnelleren und schwereren Verlauf von Colitis bei Mäusen, denen die zerbrechlich und reaktions Tiere können schnell eine humane Endpunkt erreichen eingestellt werden.
Die Darmentzündung führt zunächst aus Ethanol induzierte Schäden intestinalen Epithelzellen, was zu einer erhöhten Durchlässigkeit epithelialen, mikrobielle Eindringen in die Schleimhaut, haptenization von Wirtsproteinen, all dies was die Infiltration von Neutrophilen, Makrophagen und Th1-T-Lymphozyten in das geschädigte Schleimhaut. Im Vergleich zu DNBS wird TNBS als gefährliche Chemikalie aufgrund seiner hochoxidativen Eigenschaften, die eine Explosionsgefahr bei Kontakt mit Basen, wie Natrium-und Kaliumhydroxid darstellen kann betrachtet. Daher DNBS wird derzeit als bevorzugte Wahl von chemischen über TNBS Colitis induzieren angesehen. Bei Nagetieren ist DNBS ulcerosa als eine der günstigsten Methoden als die fol studierenFlügel IBD verbunden Modifikatoren der Krankheit:
- Depression und Reaktivierung von Colitis: Es hat sich gezeigt, dass Stress, Angst und Depression bei CED-Patienten sind häufig mit Krankheitsrückfall verbunden. DNBS ulcerosa ist ein geeignetes Modell, um die Rolle der Depression und ihre Auswirkungen auf die Reaktivierung von Colitis bei Mäusen untersucht. Das Verfahren beinhaltet typischerweise Anfangs Induktion von Colitis durch DNBS, gefolgt von der Auflösung des ulcerosa, indem man die Mäuse für 6-8 Wochen. Die Mäuse werden dann mit Depressionen verursachen Mittel wie Reserpin oder durch Geruchs Bulbektomie verabreicht, um die Depression, gefolgt von Testen sie für die Reaktivierung der Colitis durch Herausforderung mit einem subcolitic Dosis von 2 DNBS induzieren.
- Stress und Reaktivierung von Colitis: Stress ist ein weiterer gemeinsamer Umweltfaktor, der Pathogenese IBD in Verbindung gebracht wurde. Es gibt eine wachsende Zahl von Hinweisen, die eine starke Assoziation zwischen chronischem Stress und dem Auftreten der Symptome von UC und CD in Nagetier schlägts sowie bei Menschen und nicht-menschlichen Primaten 3. DNBS ulcerosa ist ein gutes Modell, um Stress-assoziierte Kolitis Reaktivierung des in Mäusen und Ratten. Die Methode wird in der Regel in einer ähnlichen Weise, wie oben erwähnt, außer für Depressionen anstelle von Depressionen eingesetzt werden, werden die Tiere auf Stressfaktoren wie Schall-und Zurückhaltung Stress 4 ausgesetzt.
- Neurogener Entzündung: Eine Reihe von Studien haben entweder vorübergehende oder dauernde Veränderungen in der enterische Nervensystem (ENS) Struktur und Funktion, wie in Gewebeproben von Tiermodellen und bei Patienten mit IBD ersichtlich beschrieben. DNBS ist ein gutes Modell, um die Auswirkungen der Entzündung auf der ENS 5 zu erkunden und sowohl noradrenerge und cholinerge Nervenbahnen 6 zu studieren.
- Verletzungs-Reparaturmechanismen: Während IBD Pathogenese, Wirt stamm Verletzungen Mediatoren wie reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Stickstoffmonoxid (NO), interzelluläres Adhäsionsmolekül 3 (ICAM-3), und P-Selektin sind alle p dargestelltlag eine Rolle in der epithelialen Darmstörungen. DNBS ist ein ausgezeichnetes Modell, um Verletzungen durch die Hochregulation dieser Mediatoren sowie Reparaturmechanismen, die durch den Einsatz von selektiven Inhibitoren Drogen oder 7,8 reguliert werden verursacht studieren.
- Transmurale Entzündung: Zusätzlich zu den oben erwähnten Anwendungen der DNBS, das Modell kann auch angewendet werden, um eine transmurale Entzündung des Darms, eine klassische Funktion in Patienten mit CD studieren. Beide DNBS und TNBS-induzierte Colitis mit signifikanten Eindringen von Lymphozyten zugeordnet ist, in die Darmschleimhaut macht diese Modelle besonders nützlich, um T-Zell-abhängigen Immunmechanismen zu untersuchen.
Im Vergleich mit dem DSS-Modell, die Vorteile der DNBS und TNBS-induzierte Colitis sind geringe Kosten, schnelle Entwicklung einer Kolitis (erfordert in der Regel 1-3 Tage, um reproduzierbare Geschwüre und Entzündungen zeigen) und konsistente lokalisierte Schäden an der distalen Dickdarm. Aber die Nachteile sind eine Voraussetzung für einehöheres Maß an technischem Know-how, die Optimierung der DNBS / TNBS-Dosis, und die Notwendigkeit für die Anästhesie für die rektale Verabreichung.
In dieser Methodenpapier untersuchten wir die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von n-6 und n-3 mehrfach ungesättigten Fettsäuren auf die Änderung der Kolon-Schleimhaut Reaktion auf DNBS-induzierte Colitis bei Ratten unter Verwendung der Pflanzenöle Distelöl (SO) und Rapsöl (CO) und Fischöl (FO). Es ist gezeigt worden, dass n-6 und n-3-Fettsäuren sind wichtige Mediatoren von entzündlichen Darmerkrankungen durch ihre Rolle als Acylreste der Zellmembran Phospholipiden 9. Im Gegensatz zu der proinflammatorischen Potential der n-6-Fettsäuren, sind n-3-Fettsäuren bei ausreichend hohen Aufnahme potentiell wirksame entzündungshemmende Mittel. Die entzündungshemmenden Wirkungen von n-3-Fettsäuren werden direkt durch Austausch von Arachidonsäure als Substrat Eicosanoid-vermittelte Hemmung der Arachidonsäure-Metabolismus und indirekt über die Veränderung der proinflammatory Genexpression und Zellsignalisierung. Die n-3-Fettsäuren führen auch zu resolvins, eine Familie von antiinflammatorischen Mediatoren. Hohe Aufnahme von n-3-Fettsäuren mit einer Abnahme in der Produktion von proinflammatorischen Eicosanoiden, Zytokine, Chemokine, reaktiven Sauerstoffspezies und die Expression von Adhäsionsmolekülen verbunden. In dieser Studie wurden Ratten ad libitum Diäten in aller Nährstoffe identisch, außer Fettsäuren zugeführt, wobei als ein Prozent Energie aus Fett, 20% SO, 20% CO, 18% Fischöl plus 2% Distelöl (FO) 10-11 . In Prozent der täglichen Energie die SO Nahrung zuge 15% Linolsäure (LA), mit <0,06% α-Linolensäure (ALA) und keine Eicosapentaensäure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA), die CO-Diät hatte 4,2 LA% und 1,9% ALA ohne EPA oder DHA, und die FO Ernährung vorgesehen 1,4% EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA, und 0,12% ALA. Drei Wochen nach Beginn der Diät Lipid wurden die Mäuse intrarektale DNBS oder 50% igem Ethanol verabreicht und nach 5 Tagen geopfert. Der Einflammatory Antwort wurde durch Bewertung der Gewichtsverlust, histologischen Scores und Gewebeschäden Myeloperoxidaseaktivität ausgewertet.
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Protocol
Verfahren, die Tier Themen folgen Tierpflege Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Universität von British Columbia skizziert.
In diesem Protokoll genannten Verfahren wird sowohl für Ratten und Mäuse beschrieben werden, während die repräsentative Ergebnisse von Sprague-Dawley-Ratten dargestellt.
1. Vorbereitung der DNBS und Intrarectale Verwaltung
- Für die rektale Applikation von DNBS bei Ratten, frisch vorbereiten 15-30 mg DNBS/250 ul 50% Ethanol. Bei Mäusen, bereiten 2-6 mg DNBS/100 ul 50% Ethanol. Hinweis: Optimieren Sie die genaue DNBS Konzentration bei jeder Anlage verabreicht werden. Männliche Sprague-Dawley-Ratten und C57BL / 6 Mäuse sind für die Induktion von Kolitis DNBS bevorzugt, jedoch können auch andere Maus-und Rattenstämme verwendet werden. Mäuse und Ratten nur mit 50% Ethanol behandelt kann als Kontrollgruppen jedoch die Auswirkungen von Ethanol sind mild oder nicht vorhanden, kann man omi werdent die Einbeziehung dieser Gruppe für eine Studie 12.
- Bringen Sie eine 1 ml Spritze zu einer 19 G-Nadel, die eine Polyethylen-Katheter (PE-90 - Ratten oder PE-50 - Mäuse), bis zu seinem Ende befestigt.
- Leicht zu betäuben die Ratte oder Maus ruht auf einem Heizkissen (zB durch die Verabreichung von 1,5% Isofluran via Nasenkegel sollten die Tiere immer noch blinken und Schluckreflexe und zeigen regelmäßige Atmung). Bewerben Tränen Gel auf die Augen, die Augen zu vermeiden Austrocknen.
- Druck mit den Fingerspitzen leicht anzuwenden, um das hintere Ende des Tieres zu jeder Hocker, der im distalen Kolon vorhanden sein können, zu entfernen.
- Schieben Sie den Katheter intrarektal, mit dem Katheter erreicht ca. 8 cm proximal des Anus für Ratten oder 3-4 cm für Mäuse. Spritzen Sie eine kleine Menge der Lösung, während Einführen des Katheters zu schmieren, die einen leichteren Einführen. Hinweis: Wenn ein Widerstand beim Einführen des Katheters fühlte, nicht weiterhin legen, da dies zu Perforation derdie Darmwand. Entfernen Sie den Katheter und versuchen, vorsichtig wieder einsetzen, wieder Schmieren der Doppelpunkt als Sie fortfahren.
- Langsam injizieren 250 (Ratten) bzw. 100 (Mäuse) ul DNBS oder ein gleiches Volumen oder 50% Ethanol für die Kontrollen. Nach dem Einspritzen der DNBS, positionieren Sie den Tierkopf-down für 90 Sekunden, um den Verlust des DNBS vermeiden.
- Nach DNBS Verwaltung, die Tiere füttern 8% Saccharose-Wasser in 0,2% Kochsalzlösung, um eine Dehydratation in der ersten Woche zu verhindern.
- Beachten Sie sorgfältig die Tiere mit täglichen Überwachung zur Gewichtsreduktion und Anzeichen von Austrocknung oder Leiden für die Dauer des Experiments. Hinweis: Gewichtsverlust können schnell nähern sich den Empfehlungen der CCAC maximal zulässige Gewichtsverlust. Da dies meist aus Dehydrierung stammt, Gewichtsverlust sollte als Indikator für die Verwaltung von Ringer-Laktat-Lösung, um eine Dehydratation zu begrenzen, verwendet werden. Bitte achten Sie darauf, mit der Möglichkeit zu Fragen der Gesundheit Tierarzt gegebenenfalls zu beraten.
2. Collecting Gewebe und histologische Beurteilung der Schäden in DNBS Herausgefordert Mäuse
- Bei der gewünschten Zeitpunkt nach der Herausforderung mit DNBS, einschläfern Tiere durch eine Überdosierung mit Isofluran in einem Narkosekammer ausreichend mit Sauerstoff ergänzt. Beobachten Sie das Tier, bis kein Steigen oder Fallen der Brust ist zu sehen, und es gibt keine spürbare Herzschlag. Zu bestätigen, das Tier wurde vollständig durch das Fehlen einer Reaktion auf Zehenklemm oder Berühren der Hornhaut und anschließend durch Genickbruch getötet.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle und entfernen Sie den gesamten Dickdarm. Öffnen des Darms Längs; makroskopischen Schleimhautgeschwüren sollte etwa 5-6 cm proximal von dem distalen Ende des Dickdarms von Ratten (2-3 cm in Mäusen) beobachtet werden. Hinweis: Nach dem Entfernen des Dickdarms, bewerten makroskopischen Schäden Partituren, falls gewünscht. Sammeln Segmente von Dick aus entsprechenden anatomischen Lage von Kontrolltieren. Hinweis: Die Punktwertung der einzelnen Gewebe für makroskopische Schaden Partituren sollteauf die Identität der Behandlungsgruppen geblendet werden. Ergebnis Gewebeschnitte mit folgenden oder ähnlichen Kriterien: Schwere und Umfang der Geschwürbildung (0-10) mit Noten für Abwesenheit oder Anwesenheit von Durchfall (0 oder 1), Verwachsungen (0, 1, oder 2) und maximale Darmwandstärke summiert in Millimetern 11.
- Sammeln 0,5 cm Abschnitte proximal zu dem Ort der maximalen makroskopischen Schäden. Schnellfrost ein 0,5 cm Abschnitt in flüssigem Stickstoff zu einem späteren Zeitpunkt zu beurteilen Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität (ein Maß für die neutrophile Infiltration) und legen den anderen Abschnitt in 10% neutral gepuffertem Formalin für die histologische Analyse. Hinweis: schockgefroren Gewebe für Myeloperoxidase-Assay bei -80 ° C für bis zu 1 Monat gelagert werden.
- Lassen Sie die für die histologische Analyse in Schritt 2.3 entnommenen Gewebe in Formalin über Nacht beheben, und dann waschen mit 70% Ethanol. Gewebe in Paraffin einbetten und auf die gewünschte Dicke (3-5 um), Fleck mit Hemotoxylin und Eosin (HE) für die histologische Scoring geschnitten. Haben zwei Beobachter Gäste mindestens drei Gewebeschnitte von jedem Tier unter einem Lichtmikroskop auf die histologischen Schäden Partituren für jede Gruppe bestimmen. Hinweis: Die Punktwertung der einzelnen Gewebe zur histologischen Schäden Partituren sollte auf die Identität der Behandlungsgruppen geblendet werden. Ergebnis Gewebeschnitte mit folgenden oder ähnlichen Kriterien: Umfang der Entzündungszellen infiltrieren (0 = nicht vorhanden, 3 = transmurale), Verlust der Schleimhaut-Architektur (0 = nicht vorhanden, 3 = schwer), der Anwesenheit oder Abwesenheit von Kryptenabszesse (0-1) und Becherzellverlust (0-3). Bestimmen Sie histologischen Schäden Punktzahl als die Summe dieser Werte 11.
3. Darstellende Myeloperoxidase (MPO)-Assay auf DNBS Herausgefordert Darmgewebe
- Assay MPO-Aktivität in den in Schritt 2.3 erhaltenen 0,5 cm Colonsegmente. Homogenisieren Gewebe MPO Homogenisierungspuffer (0,5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid-ammonium-bromid in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0)), um 50 mg Kolon segme gebennt / ml Homogenisationspuffer Federung.
- Aliquot der homogenisierten Lösung in Portionen von 1 ml und zentrifugiert bei 4 ° C für 2 min bei 10.000 x g.
- Mischungs 100 ul jedes Aliquot mit 2,9 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 0,167 mg / ml o-dianisidinedihydrochloride und 0,0005% Wasserstoffperoxid in einer Küvette.
- Messung der Geschwindigkeit der Absorption unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 460 nm auf. Hinweis: MPO-Aktivität wird als die Menge an Enzym abbau 1 &mgr; mol / min H 2 O 2 zu H 2 O bei Raumtemperatur festgelegt und wird in Einheiten pro mg Gewebe ausgedrückt.
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Representative Results
Herausforderung von Ratten (Sprague-Dawley) oder Mäusen (C57BL / 6) mit DNBS führt in der Regel vorübergehenden Gewichtsverlust und Durchfall, manchmal mit vorliegenden Blut im Stuhl. Allerdings können Faktoren wie Genetik, Ernährung und intestinale Mikrobiota Anfälligkeit DNBS induzierte Colitis ändern. Daher wird in den Experimenten enthalten Tiere sollten von der gleichen Institution zu sein, entweder lokal abgeleitet oder von einem Tier Lieferanten bestellt. Alle Tiere müssen sorgfältig für den Grad der Gewichtsverlust und Symptome der Not während ulcerosa litt überwacht werden.
Die Ergebnisse in den Fig. 1-4 dargestellt sind ein Versuch, bei dem die Wirkungen der drei Nahrungs Öle: Distelöl, Rapsöl und Fischöl auf die resultierende Härte des DNBS ulcerosa wurden bewertet. Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels ANOVA, gefolgt von Post-hoc-Tukey-Test mit Hilfe eines Datenanalyse-Software-Programm bestimmt. AP-Wert von <0,05 war considered signifikant.
Nach intrarektale Herausforderung mit DNBS (20 mg DNBS/250 ul 50% Ethanol), signifikanter Gewichtsverlust wurde durch 48 h in Ratten mit LWL und CO ergänzt und 72 Stunden bei Ratten mit SO (P <0,05) ergänzt beobachtet. Maximale Gewichtsverlust in 48 h bei Ratten mit FO ergänzt und 72 Stunden bei Ratten mit CO ergänzt und SO zu sehen. Gewichtszunahme wieder nach 72 h und um 5 Tage nach DNBS, FO und SO Gruppen Körpergewicht ähnlich zu den Ausgangswerten zeigen. Kontrollratten mit den Diäten ergänzt und mit intrarektalen Ethanol herausgefordert weiterhin Gewicht auf der 5-tägigen Studiendauer zu gewinnen.
Die intestinale Schädigung durch DNBS verursacht werden weit verbreitet, aber der Bereich der maximalen Schädigung wird im allgemeinen an den distalen 6 cm des Dickdarms der Ratte lokalisiert, und die distalen 3 cm in Mäusen. Makroskopisch kann dies als Kolon Wandverdickung, Schleimhautgeschwüren, und gelegentliche Haftung der dist beachtenal Kolon auf benachbarte Organe wie die Blase. Bei näherer histologische Bewertung, umfangreiche epithelialen Verletzungen, in einigen Bereichen, die zur Bildung von Geschwüren, Immunzellinfiltration (vorwiegend Neutrophile und Lymphozyten), Kryptitis, Schleim Verarmungs und Ödeme beobachtet. Obwohl diese histologischen Zeichen einer Entzündung und Gewebeschäden sind in allen drei Diätöl ergänzt Gruppen auf Herausforderung mit DNBS offensichtlich ist die schwerste Schäden in der Distelöl-Gruppe, gefolgt von der Rapsöl-Gruppe gesehen, während die Ratten in der Fischöl-Gruppe zeigen minimal epithelialen Verletzungen und eine begrenzte Infiltration von Entzündungszellen in die Schleimhaut (Abbildung 2).
Unterschiede in der histologischen Schäden quantifiziert werden, um eine bessere Vergleichbarkeit zwischen den Gruppen zu ermöglichen. Kriterien zur histologischen Schadens enthalten das Ausmaß der entzündlichen Zellinfiltrat, Verlust der mukosalen Architektur Becherzellabbau, und die Anwesenheit von kryptot Abszesse. In Abbildung 3 sind die histologischen Schäden Noten für die drei Diätgruppen während Öl DNBS ulcerosa. Wie in den H & E-gefärbten Schnitten in Abbildung 2 zu sehen ist, hat das Distelöl ergänzt Gruppe die größte Ausmaß der Schäden, gefolgt von der Rapsöl-Gruppe, während der Fischölgruppe den geringsten Schaden zu zeigen.
Das Ausmaß der entzündlichen Zellinfiltrat, insbesondere von Neutrophilen, kann durch Durchführen einer Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität Assay untersucht werden. MPO wird als Entzündungsmarker, wie sie ein Enzym in den Granula von neutrophilen Granulozyten und anderen Zellen der myeloiden Linie gefunden. Bewertung der MPO-Aktivität in der Ratte Doppelpunkt am Tag 5 nach DNBS Exposition zeigt eine Zunahme der Aktivität in allen drei Gruppen (Abbildung 4). Die größte MPO-Aktivität in der Distelöl-Gruppe, gefolgt von der Rapsöl-Gruppe beobachtet, während die niedrigste MPO-Aktivität in der zu sehenFischöl-Gruppe, die den histologischen Schäden Partituren in Abbildung 3 bewertet.
Fig. 1 ist. Veränderungen im Körpergewicht (% des Ausgangswertes) nach intrarektalen Verabreichung von 50% Ethanol (Kontrolle) oder Dinitrobenzolsulfonsäurelösung (DNBS) bei erwachsenen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten (250-500 g) zugeführt SO, CO, oder LWL. Die Ratten sind dann für den Verlust von Körpergewicht von Tag 1 bis Tag 5 nach der Behandlung überwacht. Der prozentuale Verlust an Körpergewicht gegen DNBS Tage nach der Behandlung aufgetragen. Werte sind Mittelwerte ± SEM, n = 5 / group. Im Vergleich zu nicht-behandelten DNBS Kollegen, Ratten mit CO und FO gefüttert hatte eine deutliche Verringerung ihrer ursprünglichen Körpergewicht so früh wie Tag 1 nach der Behandlung in der Erwägung, DNBS am 3. Tag alle drei Gruppen von Ratten hatte significant Gewichtsverlust im Vergleich zum Ausgangsgewicht (P <0,01). Alle Gruppen zeigen ulcerosa Gewichtszunahme nach 72 Stunden, mit dem Gewicht der Rückkehr in Ausgangswert in der FO und SO Gruppen zugeführt. Ratten in der Ethanol-Kontrollgruppen zeigen, Gewichtszunahme über der 5-tägigen Studiendauer. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Die histologische Erscheinungsbild der Vertreter von H & E-gefärbten Doppelpunkt Gewebeschnitte 5 Tage nach intrarektalen Verabreichung von 50% Ethanol (CTL) oder DNBS zu erwachsenen weiblichen Ratten, SO, CO, oder LWL. Das Gewebe wird in 10% Formalin gesammelt und für ein Minimum zu beheben von 24 Stunden, gefolgt von Gewebe Schnitte und HE-Färbung. DieGewebeschnitte von Ratten SO zugeführt und CO zeigen signifikante Störung der epithelialen Integrität mit unterschiedlichem Grad der epithelialen Verletzung, Krypta fallen aus, Geschwürbildung und transmurale Immunzellinfiltration mit mehr deutliche Veränderungen mit SO gesehen. In CO gefüttert Mäusen, die Beweise der epithelialen Regeneration und Restitution gesehen. Im Gegensatz dazu gefütterten Ratten FO gehalten epithelialen Integrität und hatte begrenzte Infiltration von Entzündungszellen zu der Lamina propria beschränkt. (M-Schleimhaut, SM-Sub-Schleimhaut und U-Geschwüre; Originalvergrößerung 100X; Maßstab: 100 um). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Die histologische Schäden Punktzahl von Kolon-Gewebe 5 Tage dieach intrarektalen Verabreichung von 50% Ethanol (klar bar) oder DNBS (fest bar) zu erwachsenen weiblichen Ratten, SO, CO, oder LWL. Gewebeschnitte werden durch einen erfahrenen Untersucher, zu den Behandlungen geblendet hat, mit Hilfe eines festgelegten Kriterien, basierend auf histologischen Schäden. Die für diese Studie verwendeten Kriterien beinhaltet: Infiltration von Entzündungszellen (0 = nicht vorhanden, 3 = transmurale), Verlust der Integrität der Schleimhaut (0 = nicht vorhanden, 3 = schwer), Krypta Abszess (0 = nicht vorhanden, 1 = vorhanden) Becher-Zell-Depletion (0 = nicht vorhanden, 3 = hoch). Die histologische Schäden Punktzahl wird als Summe der Noten durch Scoring ein Minimum von drei Gewebeschnitte von jedem Tier erhalten bestimmt. Die Ergebnisse zeigen deutlich, eine reduzierte histologischen Schäden in FO gefütterten Ratten im Vergleich zu SO-und CO-gefütterten Ratten. Werte sind Mittelwerte ± SEM, n = 5 / group. Vergleich mit entsprechenden Kontrollen Ethanol wird DNBS Verabreichung mit einem signifikanten Anstieg der Beschädigung Score (p <0,05); Colitis Gruppen mit unterschiedlichen Symbole signifikant verschieden (P <;. 0,01) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
4. MPO-Aktivität in Kolon-Gewebe 5 Tage nach intrarektalen Verabreichung von 50% Ethanol (klar bar) oder DNBS (fest bar) zu erwachsenen weiblichen Ratten, SO, CO, oder LWL. Entzündete Darmgewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren und für Myeloperoxidase-Aktivität untersucht Schnapp , als ein Index der Granulozyten-Infiltration. Colitis Ratten FO Show reduziert MPO-Aktivität im Vergleich zu SO und CO Werte sind Mittelwerte ± SEM, n = 5 / group. Vergleich mit entsprechenden Kontrollen Ethanol wird DNBS Verabreichung mit einem signifikanten Anstieg der MPO-Aktivität (P <0,001); Colitis Gruppen mit unterschiedlichen Symbole significantly verschieden (P <0,05). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Discussion
Die in diesem Protokoll beschrieben DNBS Modell ist ein wertvolles, kostengünstig und reproduzierbar Colitis-Modell, das verwendet werden kann, um verschiedene Aspekte der IBD zu untersuchen. Wenn intrarektal an Ratten oder Mäusen verabreicht, DNBS induziert einen wesentlichen Grad der Entzündung und Gewebeverletzung im Dickdarm, Menschen Morbus Crohn ähneln in Bezug auf die verschiedenen histologischen Merkmale einschließlich transmurale Infiltration von polymorphkernigen Zellen und vorherrschende NF-kB-abhängigen Th1-Aktivierung.
Dieses Modell wurde verwendet, um verschiedene Faktoren gedacht, um auf IBD Auswirkungen wie Stress, Depressionen und Ernährung, sowie enterische Nervensystem Beteiligung, Verletzungen-Reparaturmechanismen, transmurale Entzündung und präklinische Therapien zu studieren. Die DNBS Modell ist auch eine geeignete Alternative zu TNBS-induzierte Entzündung bei Mäusen und Ratten und bietet eine kostengünstige Alternative zu anderen häufig verwendeten chemischen Modelle von Colitis wie DSS. Die in dieser p beschriebenen Schritterotocol wird es einem, dieses Modell erfolgreich auszuführen.
In Übereinstimmung mit anderen Versuchsmodellen der Colitis 13-16, die aktuelle Studie verstärkt die variable Effekte von Nahrungsfett auf der Darmschleimhaut Immunantworten, wo hohe Zufuhr von EPA und DHA verbraucht vor und nach der Belichtung DNBS dämpft, während hohe Aufnahme von ARA mit minimalem n -3 Fettsäuren verschlimmert die Colitis. Die wohltuende Wirkung von Nahrungs n-3 in dieser Studie beobachtet Fettsäuren sind zum Teil auf n-3-Fettsäuren effektiv niedriger Gewebe Phospholipid ARA sowohl durch Hemmung der Synthese von ARA aus LA und durch den Austausch mit ARA EPA und DHA. Diese Änderung verschiebt die Fettsäuresubstrat für die Freigabe und die anschließende Eicosanoidsynthese in Richtung einer weniger entzündungsfördernde Umgebung zur Verfügung. Im Gegensatz dazu ist die hohe Zufuhr von n-6-Fettsäuren mit einem hohen Kolon ARA mit anschließender Synthese von proinflammatorischen Mediatoren, die mukosale Immunantwort verstärken verbunden. In Keeping mit unserer aktuellen Studie in Citrobacter rodentium induzierte Colitis, Ratten mit weniger ARA als Distelöl Rapsöl gefüttert, aber mit n-3 ALA und ohne EPA oder DHA hatte einen Zwischenentzündungsreaktion 16.
Es gibt mehrere wichtige Schritte, die auf die erfolgreiche Umsetzung des DNBS Modell auswirken können. Verschiedene Studien haben unterschiedliche Konzentrationen von DNBS Bereich verwendet 3-6 mg / Maus oder 15-30 mg / Ratte ulcerosa zu etablieren. Daher ist es wichtig, für die einzelnen Ermittler, um die Dosierung von DNBS für ihre Studien zu optimieren, da die optimale Dosis kann von einem Tier auf das andere Anlage variieren. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Konzentration von DNBS wird entsprechend dem Typ und der Tierart, dass ein Prüfer mit (Ex: bestimmte Stämme anfälliger und andere resistenter gegen DNBS) unterscheiden. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Konzentration von DNBS nicht zu hoch, da dies kann dazu führen, die einen schnellen Tod der Tiere resu werdenlting von Darmperforation und Sepsis. Ein weiterer kritischer Schritt, um mit Hilfe dieses Modells ist die Entwicklung der geeigneten Methode zur intrarektalen Katheter in den distalen Dickdarm des Tieres. Die Anwesenheit von Stuhl im Dickdarm kann eine angemessene Einführung des Katheters während Einträufeln verhindern. Um dies zu vermeiden, leicht anzuwenden Druck am hinteren Ende des Afters aus leicht anästhesierten Mäuse, jede Hocker im distalen Kolon / Rektum zu entfernen. Es wird empfohlen, den Katheter etwa 3-4 cm vom Anus stecken, auch wenn es zu einem Maximum von 6-8 cm bei Ratten verlängert werden, bis zur linken Flexur (eine scharfe Biegung zwischen Quer-und absteigender Dickdarm) 7. Es ist wichtig zu beachten, dass während der Instillation Verfahren das Schmieren der Katheter durch Injektion DNBS / Ethanol in kleinen Mengen wird erleichtert das Einführen des Katheters zu ermöglichen. Um den Rückfluss des retrograden DNBS aus dem Anus zu vermeiden, ist es wichtig, die Tiere in einer Kopfüber-Position für 90 Sekunden zu halten oder alternativ dieMäuse können für 15 min in der Trendelenburg-Position (Rückenlage, wo die Füße höher als der Kopf von 15-30 ° platziert) gehalten werden.
Gewebe können an ausgewählten Zeitpunkten in Abhängigkeit von den Interessen der Forscher und ob die Studie auf akute oder chronische Entzündung konzentriert gesammelt werden. Zusätzlich kann das Gewebe auch dazu verwendet werden, die Darm ENS und angeborene und erworbene Immunsystem zu studieren. Es ist jedoch wichtig, um sicherzustellen, dass Gewebe richtig abgetastet werden. Es wird empfohlen, um die Gewebe in ein großes Volumen von 10% Formalin in einem 5 ml-Vials gesammelt, im Gegensatz zu kleineren Volumen Fläschchen, um eine ordnungsgemäße Befestigung zu gewährleisten. Geeignete Fixierung der Proben ist ein Schlüssel, um sowohl die histopathologischen Schäden und Visualisierung der Zielmoleküle in Geweben von H & E-und Immunfärbung bzw. studieren. Die histologische Scoring von Geweben sollte von erfahrenen Personen, die den experimentellen Bedingungen geblendet werden durchgeführt werden, wobei durch t gesetzt festen Kriteriener einzelne Ermittler 11,17. Myeloperoxidase (MPO) ist ein guter Marker für Entzündungen, Gewebeschäden und die neutrophile Infiltration Magen-Darm-Gewebe 11. Um die MPO-Tests durchzuführen, ist es empfohlen, Snap Einfrieren der Gewebe in flüssigem Stickstoff und am Tag der Analyse, ist es empfehlenswert, mit frisch zubereiteten Puffer und Lösungen arbeiten, um die besten und genauesten Ergebnisse zu erhalten. Dieses Modell kann auch verwendet werden, um Entzündungszellen, die den Darm zu infiltrieren, die Mechanismen der Chemotaxis und Transmigration von Entzündungszellen und die verschiedenen Wege in die Aktivierung und Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren in anderen Gewebeverletzung beteiligt sowie als Mediatoren bei der Modulation beteiligt beteiligt beteiligt studieren die Entzündungsreaktion und bei der Gewebereparatur.
Die klinische Nachteile derzeit mit immunsuppressiven Arzneimitteln oder eine Targeting proinflammatorischen Zytokins, wie TNF-α gesehen sollte Beobachtungs förderntoren, um bessere Therapiestrategien bei Patienten mit IBD Verwaltung zu entwickeln. Modelle wie der DNBS Modell ermöglicht Ermittler zu unserem Verständnis der Pathogenese der IBD zu erhöhen, möglicherweise die Identifizierung neuer therapeutischer Targets und Entwicklung / Verbesserung von Strategien, um die Entzündung durch die Verwendung neuartiger Entzündungswege und neue Therapien zu kontrollieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse zur KJ aus den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und der Morbus Crohn und Colitis Foundation of Canada (CCFC) unterstützt. VM wird von einem CFRI Fellowship und GB ein Absolvent Stipendium von der kanadischen Institutes für Gesundheitsforschung (CIHR) unterstützt. BAV ist ein Kinder mit Darm-und Leber-Erkrankungen Foundation (KIND) Lehrstuhl für Pädiatrische IBD Forschung und dem Canada Research Chair in Pädiatrische Gastroenterologie und KJ ist Senior Scientist Kliniker von Kind und die Kinder-und Familienforschungsinstitut (CFRI) Arzt-Wissenschaftler Award-Programm unterstützt , University of British Columbia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
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