Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

DNBs / TNBS kolitt modeller: gir innsikt i inflammatorisk tarmsykdom og effekter av fett

Published: February 27, 2014 doi: 10.3791/51297
* These authors contributed equally

Summary

DNBs / TNBS indusert kolitt tilbyr et alternativ og billig metode for å studere patobiologi av inflammatorisk tarmsykdom. Protokollen diskutert i dette notatet skisserer vellykket bruk av DNBs å indusere kolitt hos mus og rotter, og tillater en å grundig studere verts-mediert tarm svar.

Abstract

Inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), inkludert Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, har lenge vært assosiert med en genetisk basis, og i den senere vert immunresponser mot mikrobielle og miljømessige midler. Dinitrobenzen sulfonsyren (DNBs)-indusert kolitt gjør det interessant å studere patogenesen ved IBD tilhørende miljø triggere som stress og kosthold, effekten av mulige behandlingsformer, og de mekanismene bak tarmbetennelse og slimhinneskader. I denne artikkelen har vi undersøkt effekten av kosttilskudd n-3 og n-6 fettsyrer på colonic slimhinnene inflammatorisk respons på DNBs-indusert kolitt hos rotter. Alle rotter ble foret med dietter identiske med unntak av forskjellige typer fettsyrer [saflorolje (SO), rapsolje (CO), eller fiskeolje (FO)] i tre uker før eksponering for intrarektal DNBs. Kontroll rotter som fikk intrarektal etanol fortsatt økende vekt over 5 dagers studie, mens, DNBs-behandlede rotter matet lipid dietter alle lost vekt med FO og CO matet rotter viser betydelig vekttap ved 48 hr og rotter matet SO etter 72 timer. Vektøkning gjenopptatt etter 72 timers legg DNBs, og etter 5 dager etter DNBs, FO gruppen hadde en høyere kroppsvekt enn SO eller CO grupper. Colonic seksjoner samlet fem dager etter DNBs-behandling viste fokus sårdannelse, krypten ødeleggelse, beger celle uttømming, og slimhinne infiltrasjon av både akutte og kroniske betennelsesceller som skilte i alvorlighetsgrad mellom diet grupper. SO matet gruppen viste den mest alvorlige skaden fulgt av CO, og FO matet grupper som viste den mildeste graden av vevsskade. Tilsvarende colonic myeloperoxidase (MPO) aktivitet, en markør av nøytrofile aktivitet var signifikant høyere i SO fulgt av CO matet rotter, med FO matet rotter har betydelig lavere MPO aktivitet. Disse resultatene viser at bruken av DNBs-indusert kolitt, som beskrevet i denne protokollen, for å bestemme virkningen av dietten i patogenesen av IBD.

Introduction

Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er karakterisert ved kronisk tilbakevend betennelser i mage-tarm (GI)-tarmkanalen, noe som resulterer i symptomer på diaré, vekttap, og abdominale smerter. Ulcerøs kolitt (UC) og Crohns sykdom (CD) er de to store former for IBD, og ​​kan skilles ved plasseringen av inflammasjon i mage-tarmkanalen. I UC-pasienter, betennelse innebærer vanligvis i rektum og strekker contiguously opp i tykktarmen for en variabel grad påvirker bare den overfladiske mucosa. I motsetning til dette kan CD påvirke enhver del av GI-systemet, selv om den overveiende innvirkning på ileum og cecum. CD ofte manifesterer seg som transmural betennelse som ofte forbindes med granulomer og fører til stricturing (fibrostenotic) og / eller gjennomtrengende (fistulizing) sykdom. Selv om etiologien av IBD fortsatt ukjent, er det vel akseptert at IBD er multifaktoriell, involverer interaksjoner blant vertene immunsystem, genetisk sårbarhet og ansvarses til miljømessige og mikrobielle faktorer.

Hittil har forskjellige modeller av IBD er foreslått som vise ulike kliniske, histologiske og immunresponser karakteristisk for UC og CD. De mest brukte modeller inkluderer genmodifiserte mus (IL-2, IL-10, SAMP / YIT), infeksjon indusert modeller (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptivoverføringsmodeller (CD45 + RB Høye, CD62L + celle overføring til SCID mus) og kjemisk indusert kolitt modeller (Dextran Natriumsulfat (DSS), Trinitrobenzene sulfonsyre (TNBS) og dinitrobenzen-sulfonsyre (DNBs)). På grunn av deres lave kostnader og hurtig innsettende sykdom, er kjemiske modeller vurderes uvurderlig til studiet av ulike aspekter ved IBD. Hver av de kjemiske kolitt modellene som er oppført har fordeler samt begrensninger i noen aspekter av deres kliniske, immunologiske og histopatologiske relevans til IBD. DSS er en av de mest vanlige kjemiske fremgangsmåter som anvendes for å indusere colitis hos gnagere en. Administrasjon av 3-10% DSS (MW: 42 kDa) i 7-10 dager i drikkevannet av mus kan indusere symptomer og tegn på kolitt, inkludert vekttap, diaré med blod, colonic forkorte, mucosal sårdannelse og nøytrofile infiltrasjon. Denne modellen er spesielt nyttig for medikamentscreeningstudier, i tillegg til å utforske de mekanismer epitelial av regenerering, virkningen av medfødt immunitet på slimhinne homeostase, og rollen til betennelser i å fremme tarm dysplasia og adenokarsinom utvikling. Det er imidlertid noen ulemper for DSS-modellen, herunder variasjon i konsentrasjonen av DSS som trengs for å indusere kolitt hos forskjellige dyrefasiliteter, så vel som inkonsistente vannopptak ved mus og således inkonsekvente eksponering mot DSS, som resulterer i variasjoner i graden, utstrekning og Fordelingen av slimhinneskade og sår i tykktarmen. Alle disse funksjonene føre til heterogenitet av resultater og begrense muligheten til å sammenligne resultater på tvers av studier frOM ulike forskningsmiljøer.

Et alternativ til DSS modellen er haptenen-indusert DNBs eller TNBS modeller av kolitt. Denne modellen benytter rektal instillasjon av mucosal sensibiliserende agenter DNBs eller TNBS, fortynnet i varierende konsentrasjoner av etanol. Administreringen av etanol er en forutsetning for å bryte den colonic mucosal barriere for å tillate inntrengning av DNBs eller TNBS inn i lamina propria. DNBs / TNBS vil da haptenize de lokaliserte kolon og gut mikrobielle proteiner for å bli immunogene, og dermed utløser verten medfødte og ervervede immunresponser. Generelt er denne modellen forbundet med alvorlige og noen ganger blodig diaré, vekttap og tarm fortykkede imidlertid symptomer varierer avhengig av typen av gnager benyttes, så vel som tidspunkt, dose og graden av eksponering for DNBs eller TNBS som brukes i studien. Viktige forskjeller mellom rotter og mus bør bemerkes, med fordelene av lavere kostnader for kjøp og styret, samt lower kroppsvekt for å redusere per-dyr kostnadene for behandling in vivo. Dette bør settes mot raskere og mer alvorlig forløp av kolitt hos mus, der de mer skjøre og følsomme dyr kan raskt nå en human endepunkt.

Den intestinal inflammasjon opprinnelig resulterer fra etanol indusert skade på intestinale epitelceller, som fører til økte epithelial permeabilitet, mikrobiell penetrasjon inn i mucosa, haptenization vertsproteiner, alt dette resulterer i infiltrasjon av nøytrofiler, makrofager og T-lymfocytter Th1 inn i det skadede mucosa. I forhold til DNBs er TNBS betraktes som et farlig kjemisk på grunn av sin svært oksidative egenskaper som kan utgjøre en risiko for eksplosjon ved kontakt med baser slik som natrium-og kalium-hydroksyd. Derfor DNBs er ansett som en foretrukket valg av kjemisk løpet TNBS å indusere kolitt. I gnagere, er DNBs kolitt ansett som en av de mest praktiske metoder for å studere den følfløyen IBD forbundet modifikatorer av sykdom:

  1. Depresjon og reaktivering av colitis: Det har vist seg at stress, angst og depresjon hos IBD-pasienter er ofte assosiert med sykdoms tilbakefall. DNBs kolitt er en egnet modell for å studere rollen til depresjon og dens konsekvenser på reaktivering av kolitt hos mus. Fremgangsmåten omfatter typisk innledende utløsning av colitt ved DNBs, etterfulgt av oppløsningen av kolitt ved å la mus i 6-8 uker. Musene er deretter gis med depresjon kallende stoffer som reserpin eller ved lukte bulbectomy å indusere depresjon fulgt ved å teste dem for reaktivering av kolitt gjennom utfordring med en subcolitic dose av DNBs to.
  2. Stress og reaktivering av kolitt: Stress er en annen vanlig miljøfaktor som har vært knyttet til IBD patogenesen. Det er en økende mengde bevis som tyder på en sterk sammenheng mellom kronisk stress og utbruddet av symptomer på UC og CD i gnagers så vel som hos mennesker og ikke-menneskelige primater 3. DNBs kolitt er en god modell for å studere stress forbundet reaktivering av kolitt hos både mus og rotter. Fremgangsmåten blir vanligvis anvendt på en lignende måte som nevnt ovenfor for depresjon, bortsett fra i stedet for depresjon, blir dyrene utsatt for belastninger som sonisk og holde belastning 4..
  3. Nevrogen inflammasjon: En rekke studier har beskrevet enten forbigående eller permanente forandringer i det enterisk nervesystem (ENS) struktur og funksjon, som vist i vevsprøver fra dyremodeller og hos pasienter med IBD. DNBs er en god modell for å undersøke effekten av betennelse på ENS 5 og til å studere både noradrenergic og kolinerge nervebaner seks.
  4. Skade-reparasjonsmekanismene: Under IBD patogenese, vertsavledet skademediatorer slik som reaktive oksygenarter (ROS), nitrogenoksid (NO), intercellulært adhesjonsmolekyl 3-(ICAM-3), og P-selektin er alle blitt vist å plå en rolle i tarmepitel avbrudd. DNBs er en utmerket modell for å studere skader som følge av den opp-regulering av disse mediatorer, så vel som reparasjonsmekanismene som er regulert ved hjelp av selektive medikamenter eller inhibitorer 7,8.
  5. Transmuralt inflammasjon: I tillegg til de ovenfor nevnte anvendelser av DNBs, modellen kan også brukes til å studere transmural betennelse i tarmen, en klassisk funksjon som finnes hos pasienter med CD. Begge DNBs og TNBS-indusert kolitt er forbundet med signifikant infiltrasjon av lymfocytter inn i kolon mukosa gjøre disse modellene spesielt nyttige for å studere T-celleavhengig immunmekanismer.

I sammenligning med DSS modellen, fordelene ved DNBs og TNBS-indusert kolitt omfatter lav pris, rask utvikling av kolitt (krever vanligvis 1-3 dager for å vise reproduserbar sår og inflammasjon) og konsistent lokalisert skade på den distale colon. Men ulempene er en forutsetning for enstørre grad av teknisk ekspertise, optimalisering av DNBs / TNBS dose, og behovet for anestesi for rektal administrasjon.

I denne metode papir studerte vi effektene av varierende konsentrasjoner av n-6 og n-3 flerumettede fettsyrer på å endre den colonic mucosal respons på DNBs-indusert kolitt hos rotter ved hjelp av vegetabilske oljer saflorolje (SO) og rapsolje (CO) , og fiskeolje (FO). Det har vist seg at n-6 og n-3 fettsyrer, er viktige formidlere av inflammatorisk sykdom gjennom tarm deres rolle som acyldelene cellemembranen phosopholipids 9. I motsetning til den proinflammatoriske potensialet av n-6 fettsyrer, n-3 fettsyrer med tilstrekkelig høyt inntak er potensielt potente anti-inflammatoriske midler. Den anti-inflammatoriske handlingene til n-3 fettsyrer er mediert direkte gjennom erstatning av arakidonsyre som eicosanoid substrat, inhibering av arachidonsyre metabolismen og indirekte via forandring av proinflammatory genuttrykk og cellesignalering. De n-3-fettsyrer også gi opphav til resolviner, en familie av anti-inflammatoriske mediatorer. Høy inntak av n-3 fettsyrer er assosiert med en reduksjon i produksjon av proinflammatoriske eikosanoider, cytokiner, kjemokiner, reaktive oksygen-arter og ekspresjonen av adhesjonsmolekyler. I denne studien ble rotter foret ad libitum dietter identiske i alle næringsstoffer bortsett fettsyrer, og som en prosent energi fra fett, 20% SO, 20% CO, og 18% fiskeolje pluss 2% saflorolje (FO) 10-11 . Som andel av det daglige energi, SO diett gitt 15% linolsyre (LA), med <0,06% α-linolensyre (ALA) og ingen eikosapentaensyre (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA), CO-diett hadde 4.2 % LA og 1,9% ALA uten EPA eller DHA, og FO diett gitt EPA 1,4%, 4,9% DHA, 0,32% LA og 0,12% ALA. Tre uker etter initiering av lipid-dietter, ble musene administrert intrarektal DNBs eller 50% etanol og avlivet 5 dager senere. Den inflammatory responsen ble vurdert ved vurdering av vekttap, histologiske skader resultatene og vev myeloperoksidase-aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyr fag følger retningslinjene dyr omsorg skissert av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of British Columbia.

Prosedyrene som er nevnt i denne protokollen vil bli beskrevet for både rotter og mus, mens de representative resultatene vil bli presentert fra Sprague-Dawley rotter.

En. Utarbeidelse av DNBs og intrarektal Administrasjon

  1. For rektal instillasjon av DNBs hos rotter, tilbereder 15-30 mg DNBS/250 mL av 50% etanol. For mus, forberede 2-6 mg DNBS/100 mL av 50% etanol. Merk: Optimal nøyaktig DNBs konsentrasjonen som skal administreres ved hvert anlegg. Hann Sprague-Dawley rotter, og C57BL / 6 mus er å foretrekke for induksjon av DNBs kolitt, kan imidlertid andre muse-og rottestammer anvendes. Mus og rotter behandlet bare med 50% etanol, kan benyttes som kontrollgrupper gis imidlertid virkningene av etanol er milde eller fraværende, kan man omit inkludering av denne gruppen for en studie 12.
  2. Fest en 1 ml sprøyte til en 19 G nål som har en polyetylen kateter (PE-90 - rotter eller PE-50 - muse) festet til sin ende.
  3. Lett bedøve rotte eller mus hviler på en varmepute (f.eks ved å gi 1,5% isofluran via nesen membran, bør dyrene har fortsatt blinke og svelge reflekser og vise vanlig respirasjon). Påfør tåre gel til øynene for å unngå øynene tørker ut.
  4. Anvende forsiktig trykk med fingrene til den bakre ende av dyr for å fjerne avføring som kan være tilstede i den distale colon.
  5. Forsiktig inn katetret intrarectally, med kateteret nådde omtrent 8 cm proksimalt til anus for rotter eller 3-4 cm for mus. Injisere en liten mengde av oppløsningen mens innsetting av kateteret for å smøre, slik at lettere innsetting. Merk: Hvis noen kjenner motstand mens du setter inn kateteret, ikke fortsette å sette inn, da dette kan føre til perforering avtarmveggen. Fjern kateteret og forsøke å forsiktig inn igjen, igjen smøring av tykktarmen som fortsetter.
  6. Sakte injisere 250 (rotter) eller 100 (mus) pl av DNBs, eller et tilsvarende volum eller 50% etanol i kontrollene. Etter å ha injisert DNBs, plassere dyr hode ned i 90 sekunder for å unngå tap av DNBs.
  7. Etter DNBs administrasjon, mate dyrene 8% sukrose vann i 0,2% saltvann for å forhindre dehydrering i løpet av den første uken.
  8. Nøye observere dyr, med daglig overvåking for vekttap og tegn på dehydratisering eller ubehag for varigheten av eksperimentet. Merk: Vekttap kan raskt nærme seg CCAC anbefalinger fra tillatte totalvekt tap. Etter denne hovedsakelig avledet fra dehydrering, bør vekttap benyttes som en indikator for administrering av melkesur Ringers løsning for å begrense dehydratisering. Vennligst sørg for å konsultere med anlegget veterinær om helsespørsmål som passer.

2. Collecting Vev og Assessing Histologisk Skade i DNBs Utfordret Mus

  1. På ønsket tidspunkt etter utfordring med DNBs, avlive dyr etter overdoser med isofluran i en bedøvelse kammer supplert med tilstrekkelig oksygen. Legg merke til at dyret til det ikke stiger eller faller av brystet er sett, og det er ingen følbar hjerteslag. Kontroller at dyret er blitt fullstendig avlivet ved fravær av en respons på tå klype eller berøring av hornhinnen, etterfulgt av cervical dislokasjon.
  2. Åpne bukhulen og fjerne hele tykktarmen. Åpne tarmen i lengderetningen; makroskopiske mukosale sår bør observeres om lag 5-6 cm proksimalt fra den distale enden av tykktarmen hos rotter (2-3 cm i mus). Merk: Når du har fjernet tykktarmen, vurdere makroskopiske skader score hvis ønskelig. Samle segmenter av kolon fra tilsvarende anatomiske plassering fra kontrolldyrene. Merk: Individene scoring vevet for makroskopiske skader score børbli blindet til identiteten til behandlingsgruppene. Resultat vevssnitt ved hjelp av følgende eller lignende kriterier: alvorlighetsgrad og omfang av sårdannelse (0-10), oppsummerte med score for fravær eller tilstedeværelse av diaré (0 eller 1), sammenvoksninger (0, 1 eller 2) og maksimal colonic veggtykkelse i millimeter 11.
  3. Samle 0,5 cm seksjoner proksimale til området av maksimal makroskopiske skader. Snap fryse en 0,5 cm seksjon i flytende nitrogen for å vurdere senere myeloperoksidase (MPO)-aktivitet (et mål på nøytrofil infiltrering) og plasser den andre seksjon i 10% nøytral buffret formalin for histologisk analyse. Merk: Feste frosne vev for myeloperoksidase assay kan lagres ved -80 ° C i opp til 1 måned.
  4. Tillat vev samles for histologisk analyse i trinn 2.3 å fikse i formalin over natten, og vask med 70% etanol da. Embed vev i parafin og klippes til ønsket tykkelse (3-5 mikrometer), flekken med hemotoxylin og eosin (HE) for histologisk scoring. Har to observatører score minst tre vevssnitt fra hvert dyr i henhold til et lysmikroskop for å bestemme de histologiske skader skårer for hver gruppe. Merk: Individene scoring vevet for histologiske skade score bør bli blindet til identiteten til behandlingsgruppene. Poeng vevssnitt ved hjelp av følgende eller lignende kriterier: utstrekning av inflammatorisk celle infiltrere (0 = fraværende, 3 = transmural), tap av mukosal arkitektur (0 = fraværende, 3 = alvorlige), tilstedeværelse eller fravær av krypten abscesser (0-1) , og beger celle uttømming (0-3). Bestem histologisk skade poengsum som summen av disse score 11.

Tre. Utføre Myeloperoxidase (MPO) analysen på DNBs Utfordret tarmvevet

  1. Assay MPO aktivitet på 0,5 cm colonic segmenter oppnådd i trinn 2.3. Homogen vev i MPO homogenisering buffer (0,5% hexadecyltrimethyl-ammonium-bromid i 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,0)) for å gi en 50 mg kolon segmeNT / ml homogenisering buffer suspensjon.
  2. Aliquot den homogeniserte løsningen i 1 ml porsjoner og sentrifuge ved 4 ° C i 2 minutter ved 10.000 x g.
  3. Bland 100 ul av hver prøve med 2,9 ml av 50 mM fosfatbuffer (pH 6,0) inneholdende 0.167 mg / ml o-dianisidinedihydrochloride og 0,0005% hydrogenperoksid i en kyvette.
  4. Måle frekvensen av absorbans ved hjelp av et spektrofotometer ved 460 nm. Merk: MPO-aktivitet er definert som mengden av enzym-nedbrytende 1 pmol / min i H 2 O 2 i H2O ved romtemperatur og er uttrykt i enheter pr mg vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utfordring av rotter (Sprague-Dawley) eller mus (C57BL / 6) med DNBs vanligvis resulterer i transient vekttap og diaré, noen ganger med blod i avføring. Men, kan faktorer som genetikk, kosthold og tarmfloraen endre mottakelighet for DNBs indusert kolitt. Derfor, inkludert dyr i forsøkene bør være fra samme institusjon, enten avledet lokalt eller bestilles fra ett dyr leverandør. Alle dyr bør overvåkes nøye for graden av vekttap og symptomer på nød led under kolitt.

Resultatene presenteres i figur 1-4 representerer et eksperiment der virkningene av tre kosttilskudd oljer: safflower olje, rapsolje, og fiskeolje på den resulterende alvorlighetsgraden av DNBs kolitt ble vurdert. Statistiske forskjeller mellom gruppene ble bestemt ved hjelp av ANOVA etterfulgt av post hoc Tukey test, ved hjelp av en dataanalyse program. AP verdi på <0,05 var considered betydelig.

Etter intrarektal utfordring med DNBs (20 mg DNBS/250 ul av 50% ethanol), ble betydelig vekttap observert ved 48-timers hos rotter supplert med FO og CO, og ved 72 timer hos rotter supplert med SO (P <0,05). Maksimal vekttap er sett på 48 timer i rotter supplert med FO og etter 72 timer i rotter supplert med CO og SO. Vektøkning gjenopptatt etter 72 timer, og etter 5 dager etter DNBs, FO og så grupper viser kroppsvekt lik baseline-verdier. Kontroll rotter supplert med dietter og utfordret med intrarektal etanol fortsette å få vekten over fem dagers studieperioden.

Den intestinal skade forårsaket av DNBs kan være utbredt, men området for maksimal skade er generelt lokalisert til de distale 6 cm i tykktarmen hos rotter, og den distale 3 cm i mus. Makroskopisk dette kan observeres som colonic fortykkede, mucosal sårdannelse, og sporadiske vedheft av distal kolon til tilstøtende organer, så som blæren. Ved nærmere histologiske undersøkelser, omfattende epithelial skade, i enkelte områder som fører til dannelsen av magesår, immun celle infiltrasjon (hovedsakelig nøytrofile granulocytter og lymfocytter), cryptitis, slim uttømming, og ødem er observert. Selv om disse histologiske tegn på inflammasjon og vevsskade er tydelig i alle tre diett olje supplert grupper ved felling med DNBs, er den mest alvorlige skade som man ser i saflorolje-gruppen, etterfulgt av rapsolje-gruppen, mens rotter i fiskeoljegruppen demonstrere minimal epithelial skade og en begrenset infiltrasjon av inflammatoriske celler inn i mucosa (figur 2).

Forskjeller i histologiske skader kan kvantifiseres for å tillate en bedre sammenligning mellom gruppene. Kriteriene som brukes for å vurdere histologiske skader inkludert utstrekningen av inflammatorisk celle infiltrere, tap av slimhinne-arkitektur, beger celle uttømming, og tilstedeværelsen av crypt abscesser. Vist i figur 3 er de histologiske skade score for de tre kosttilskudd olje grupper under DNBs kolitt. Som det sees i H & E-fargede seksjoner i figur 2, har saflorolje supplert gruppe i størst grad av skade, etterfulgt av rapsolje-gruppen, mens tran-gruppen viser minst mulig skade.

Omfanget av inflammatorisk celle infiltrere, særlig av nøytrofile, kan bli ytterligere undersøkt ved å utføre en myeloperoxidase (MPO) aktivitet analysen. MPO er ansett som en markør for inflammasjon, som det er et enzym som finnes i de granulater av nøytrofile granulocytter og andre celler i myeloid avstamning. Vurdering av MPO aktivitet i rotte kolon på dag 5 etter DNBs eksponering avslører en økning i aktivitet i alle tre gruppene (figur 4). Den største MPO-aktivitet er observert i saflorolje gruppe, etterfulgt av rapsolje-gruppen, mens den laveste MPO-aktivitet er sett ifiskeolje gruppen i henhold til de histologiske skader resultatet vurderes i figur 3..

Figur 1
Figur 1. Endring i kroppsvekt (% av utgangsverdien) Følgende intrarektal administrering av 50% etanol (kontroll) eller dinitrobenzen-sulfonsyre (DNBs) i voksne hunn Sprague-Dawley rotter (250-500 g) matet SO, CO eller FO. Rottene deretter overvåket for tap av kroppsvekt fra dag 1 inntil dag 5 etter behandling. Den prosentvise tap av kroppsvekt er plottet mot dager post DNBs behandling. Verdier er midler ± SEM, n = 5 / gruppe. Når sammenlignet med ikke-behandlede DNBs motstykker, rotter matet med CO-og FO hadde en betydelig reduksjon i sin opprinnelige kroppsvekt så tidlig som dag 1 post DNBs behandling, mens på dag 3 alle tre grupper av rotter som hadde sigdelig vekttap forhold til baseline vekt (P <0,01). Alle kolitt grupper demonstrere vektøkning etter 72 timer, med vekt tilbake til baseline i FO og så lei grupper. Rotter i etanol kontrollgrupper demonstrere vektøkning over fem dagers studieperioden. Klikk her for å se større bilde .

Fig. 2

Figur 2. Histologisk utseende av representative H & E farget kolon vevssnitt fem dager etter intrarektal administrasjon av 50% etanol (CTL) eller DNBs til voksne hunnrotter matet SO, CO, eller FO. Vevet blir samlet i 10% formalin og lov til å fikse for et minimum av 24 timer etterfulgt av vev seksjonering og HE farging. Denvevssnitt fra rotter fôret med SO og CO demonstrere betydelig forstyrrelse av epitelial integritet med varierende grad av epithelial skade, krypten droppe ut, sårdannelse og transmuralt immun celle infiltrasjon, med mer markerte endringer sett med SO. I CO matet mus, er bevis på epitelial regenerasjon og restitusjon sett. I kontrast, rotter fôret med FO opprettholdt epitelial integritet og hadde begrenset infiltrasjon av betennelsesceller begrenset til lamina propria. (M-slimhinnen, SM-sub-slimhinne og U-sårdannelse; opprinnelige forstørrelse 100X; skala bar: 100 mikrometer). Klikk her for å se større bilde .

Figur 3
Figur 3. Histologisk skade score på colonic vev fem dager ifter intrarektal administrasjon av 50% etanol (klar bar) eller DNBs (solid bar) til voksne hunnrotter matet SO, CO, eller FO. vevssnitt blir bedømt av en erfaren etterforsker, blindet for behandlinger, ved hjelp av et sett kriterier basert på histologiske skade. Kriteriene som brukes for denne studien inkluderer: inflammatorisk celle infiltrasjon (0 = fraværende, 3 = transmural), tap av mucosal integritet (0 = fraværende, 3 = alvorlig), krypten abscess dannelse (0 = fraværende, 1 = tilstede) beger celle uttømming (0 = fraværende, 3 = høy). Histologisk skade poengsum bestemmes som en sum av skårer oppnådd ved å score et minimum av tre vevssnitt fra hvert dyr. Resultatene viser tydelig redusert histologisk skade i FO matet rotter i forhold til SO og CO matet rotter. Verdier er midler ± SEM, n = 5 / gruppe. Sammenlignet med respektive etanol kontroller, er DNBs administrasjon forbundet med en betydelig økning av skaden poengsum (P <0,05); kolitt grupper med forskjellige symboler er signifikant forskjellige (P <;. 0,01) Klikk her for å se større bilde .

Figur 4
Figur 4. MPO-aktivitet in colonic vev 5 dager etter intrarektal administrering av 50% etanol (klar bar) eller DNBs (fylt stolpe) til voksne hunnrotter som mates SO, CO eller FO. Colonic betent vev er snap frosset i flytende nitrogen og analysert for myeloperoksidase-aktivitet , som en indeks på granulocytt infiltrasjon. Colitic rotter fôret med FO viser redusert MPO aktivitet sammenlignet med SO og CO Verdier er midler ± SEM, n = 5 / gruppe. Sammenlignet med respektive etanol kontroller, er DNBs administrasjon forbundet med en betydelig økning av MPO-aktivitet (P <0,001), kolitt grupper med forskjellige symboler er significantly forskjellig (P <0,05). Klikk her for å se større bilde .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den DNBs modellen som beskrives i denne protokoll er et verdifullt, billig og reproduserbar kolitt-modell som kan bli anvendt for å studere forskjellige aspekter av IBD. Når administreres intrarectally til rotter eller mus, induserer DNBs en betydelig grad av betennelse og vevsskade i tykktarmen, ligner menneskelige Crohns sykdom i form av dens ulike histologiske funksjoner, inkludert transmural infiltrasjon av polymorfnukleære celler og dominerende NF-κB-avhengig Th1 aktivering.

Denne modell er blitt brukt til å studere forskjellige faktorer som antas å påvirke IBD eksempel stress, depresjoner, og diett, så vel som enteriske nervesystemet, skade-reparasjonsmekanismene, transmuralt inflammasjon og prekliniske terapier. Den DNBs modellen er også et egnet alternativ til TNBS-indusert inflammasjon i mus og rotter, og gir et mindre kostbart alternativ til andre som vanligvis anvendes kjemiske modeller av kolitt eksempel DSS. Fremgangsmåten i denne protocol vil tillate en å kunne gjennomføre denne modellen.

I samsvar med andre eksperimentelle modeller av kolitt 13-16, forsterker den aktuelle studien de variable effekter av fett på intestinal mucosal immunresponser hvor høyt inntak av EPA og DHA konsumert før og etter DNBs eksponering demper, mens høyt inntak av ARA med minimal n -3 fettsyrer forverret kolitt. Den gode effekten av kosttilskudd n-3 fettsyrer observert i denne studien er delvis på grunn av n-3 fettsyrer effektivt lavere vev fosfolipid ARA både ved å hemme syntese av ARA fra LA og ved å erstatte ARA med EPA og DHA. Denne endringen skifter fettsyre underlaget tilgjengelig for utgivelsen og påfølgende eicosanoid syntese mot en mindre proinflammatoriske miljø. I motsetning til dette er det høye inntak av n-6-fettsyrer i forbindelse med en høy colonic ARA med påfølgende syntese av proinflammatoriske mediatorer som forverre mukosal immunrespons. I keeping med vår siste undersøkelse i Citrobacter rodentium indusert kolitt, rotter fôret med rapsolje med mindre ARA enn safflower olje, men med n-3 ALA og ingen EPA eller DHA hadde en middels inflammatorisk respons 16.

Det er flere viktige tiltak som kan påvirke den vellykkede gjennomføringen av DNBs modell. Forskjellige studier har benyttet varierende konsentrasjoner av DNBs strekker 3-6 mg / mus eller 15 til 30 mg / rotte for å etablere kolitt. Derfor er det viktig for de enkelte forskere å optimalisere dosen av DNBs for studiene, da optimale doser kan variere fra ett dyr innretningen til den andre. Det er også viktig å merke seg at konsentrasjonen av DNBs vil variere i henhold til type og art av dyr som en undersøker bruker (Ex: visse stammer kan være mer utsatt, og andre mer motstandsdyktig mot DNBs). Forsiktighet bør utvises for å sikre at konsentrasjonen av DNBs ikke er for høy, da dette kan føre til rask død av dyr resulting fra tarmperforasjon og sepsis. Et annet kritisk punkt for å bruke denne modellen er å utvikle den passende metode for intrarektal kateter innsetting i den distale colon av dyret. Tilstedeværelsen av avføring i tykktarmen kan hindre tilstrekkelig innsetting av kateteret under drypping. For å unngå dette, forsiktig press ved den bakre ende av anus av lett bedøvede mus for å fjerne eventuell avføring i den distale tykktarm / endetarm. Det anbefales å føre inn katetret ca. 3-4 cm fra anus, selv om den kan bli utvidet til et maksimum på 6-8 cm i rotter før miltformuttrekk (en skarp bend mellom transverse og nedadgående colon) 7. Det er viktig å merke seg at i løpet av instillasjon fremgangsmåte for smøring og kateteret ved å injisere DNBs / etanol i små volumer vil tillate lettere innsetting av kateteret. For å unngå den retrograde refluks av DNBs av anus, er det avgjørende å holde dyrene i en hode-ned-stilling i 90 sekunder, eller alternativt,mus kan holdes i 15 minutter i Trendelenburg stilling (en liggende stilling hvor føttene er plassert høyere enn hodet ved 15-30 °).

Vev kan samles på utvalgte tidspunkter avhengig av interessene til etterforskeren og om studien fokuserer på akutt eller kronisk betennelse. I tillegg kan vev også brukes til å studere de intestinale ENS og medfødte og adaptive immunsystemet. Det er imidlertid viktig å sikre at vevene er riktig samplet. Det anbefales å samle vev i et stort volum av 10% formalin i 5 ml ampuller, i motsetning til mindre volum ampuller for å sikre tilfredsstillende fiksering. Hensiktsmessig fiksering av prøvene er en nøkkel for å studere både histopatologisk skade og visualisering av målmolekyler i vev ved H & E-og farging, respektivt. Histologisk scoring av vev bør utføres av erfarne personer som er blinde for de eksperimentelle forhold, ved hjelp av faste kriterier satt av than enkelte etterforsker 11,17. Myeloperoksidase (MPO) fungerer som en god markør for inflammasjon, vevsskade og nøytrofile infiltrasjon i gastrointestinale vev 11. For å utføre de MPO analyser, er det foreslått å knipse fryse vevet i flytende nitrogen og på dagen for analyse, anbefales det å jobbe med nylagde buffere og løsninger for å få de beste og mest nøyaktige resultater. Modellen kan også brukes til å studere inflammatoriske celler som infiltrerer i tarmen, de mekanismer som er involvert i kjemotaksis og transmigrasjon av inflammatoriske celler og de forskjellige baner som er involvert i aktivering, og frigjøring av andre proinflammatoriske mediatorer er involvert i vev skade så vel som mediatorer er involvert i moduler inflammatorisk respons og i vev reparasjon.

De kliniske ulemper som nå undersøkes med hjelp av immundempende medisiner eller målretting en proinflammatoriske cytokiner som TNF-α bør oppmuntre investigators å utvikle bedre terapeutiske strategier for å håndtere pasienter med IBD. Modeller, slik som DNBs modellen, gjør det mulig for forskere å øke forståelsen av patogenesen av IBD, potensielt identifisere nye terapeutiske mål og utvikling / forbedring av strategier for å kontrollere inflammasjon ved bruk av nye betennelses trasé og nye behandlingsformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av driftsstøtte til KJ fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC) og Crohns og kolitt Foundation of Canada (CCFC). VM er støttet av en CFRI Fellowship og GB utdannet studieplass fra den kanadiske Institutes for Health Research (CIHR). BAV er et barn med tarm og leverlidelser Foundation (BARN) Chair of Pediatric IBD Forskning og Canada Research Chair i Pediatric Gastroenterology og KJ er en erfaren kliniker Scientist støttes av barnet og barnet og familien Research Institute (CFRI) Lege Forskere Award Program , University of British Columbia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml Syringe BD Biosciences 309659  
19 G Needle BD Biosciences 305187  
Polyethylene tubing PE-50 BD Biosciences 427517 for intrarectal administration in mice
Polyethylene tubing PE-90 BD Biosciences 427519 for intrarectal administration in rat
DNBS MP Bio 150959  
Tear gel Novartis 63601662596  
10% Formalin Fisher 5F93-4  
Warming pad Kent Scientific TPZ-0510  
Ethanol Fisher A-962.4  
Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide Sigma-Aldrich H5882  
Potassium phosphate buffer solution Sigma-Aldrich 79628-  
o-Dianisidine dihydrochloride Sigma-Aldrich D3252  
30% H2O2 Sigma-Aldrich 31642 hydrogen peroxide
Spectrophotometer BioRad Benchmarker Plus  
Light Microscope Zeiss Axio Image.Z1  
Data analysis software program  GraphPad Software GraphPad Prism Software Version 4.00 www.graphpad.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Biotechnol, J. . B. iomed , (2012).
  2. Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression. Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).
  3. Reber, S. Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).
  4. Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis. Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).
  5. Boyer, L., et al. Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis. Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).
  6. Saunders, P., et al. Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat. Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).
  7. Cuzzocrea, S., et al. Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat. Gut. 48 (4), 478-488 (2001).
  8. Cuzzocrea, S., et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).
  9. Innis, S., Jacobson, K. Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease. Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).
  10. Innis, S. M., de La Presa Owens, S. Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain. J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).
  11. Jacobson, K. Mundra H.,Innis S.M. Intestinal responsiveness to experimental colitis in young rats is altered by maternal diet. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 13-20 (2005).
  12. Sanovic, S., Lamb, D. P., Blennerhassett, M. G. Damage to the enteric nervous system in experimentalcolitis. Am. J. Pathol. 155 (4), 1051-107 (1999).
  13. Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis. Gut. 31, 539-544 (1990).
  14. N-3 fatty acid-rich diet prevents early response of interleukin-6 elevation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced enteritis. Int. J. Mol. Med. Andoh, A., Tsujikawa, T., Ishizuka, I., Araki, Y., Sasaki, M., Koyama, S., Fujiyama, Y. 12, 721-725 (2003).
  15. Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis. Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).
  16. Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).
  17. Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).

Tags

Medicine Chemical kolitt inflammatorisk tarmsykdom intra rektal administrering intestinal inflammasjon transmuralt inflammasjon myeloperoksidase-aktivitet
DNBs / TNBS kolitt modeller: gir innsikt i inflammatorisk tarmsykdom og effekter av fett
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morampudi, V., Bhinder, G., Wu, X.,More

Morampudi, V., Bhinder, G., Wu, X., Dai, C., Sham, H. P., Vallance, B. A., Jacobson, K. DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat. J. Vis. Exp. (84), e51297, doi:10.3791/51297 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter