Summary
DNBS / TNBS التهاب القولون الناجم يقدم بديلا وسيلة غير مكلفة لدراسة البيولوجيا المرضية لمرض التهاب الامعاء. بروتوكول مناقشتها في هذه الورقة الخطوط العريضة للتطبيق الناجح لDNBS للحث على التهاب القولون في الفئران والجرذان ويسمح احد لدراسة وافية الردود الأمعاء بوساطة المضيف.
Abstract
لطالما ارتبط أمراض التهابات الأمعاء (IBD)، بما في ذلك مرض كرون والتهاب القولون التقرحي، مع الأساس الجيني، واستضافة المزيد من الاستجابات المناعية مؤخرا إلى العوامل الميكروبية والبيئية. التهاب القولون ثنائي نتروبنزين حمض السلفونيك (DNBS) التي يسببها يسمح احد لدراسة التسبب في IBD المسببات البيئية المرتبطة بها مثل الإجهاد والنظام الغذائي، وآثار العلاجات المحتملة، والآليات الكامنة وراء التهاب الأمعاء والمخاطية إصابة. في هذه الورقة، ونحن التحقيق آثار الأحماض N-3 و n-6 الدهنية الغذائية على الاستجابة الالتهابية المخاطية القولون التهاب القولون لDNBS التي يسببها في الفئران. تم تغذية الفئران حمية جميع متطابقة مع استثناء من أنواع مختلفة من الأحماض الدهنية [زيت القرطم (SO)، وزيت الكانولا (CO)، أو زيت السمك (FO)] لمدة ثلاثة أسابيع قبل التعرض لDNBS داخل المستقيم. استمرت السيطرة الفئران أعطيت الايثانول داخل المستقيم اكتساب الوزن على مدى 5 أيام الدراسة، في حين والجرذان DNBS المعاملة حمية الدهون تغذية جميع لوسر الوزن مع FO وCO تغذية الفئران مما يدل على فقدان وزن كبير قبل 48 ساعة والفئران التي تغذت SO قبل 72 ساعة. استأنفت زيادة الوزن بعد 72 DNBS آخر ساعة، وبنسبة 5 DNBS أيام آخر، وكان مجموعة FO على وزن أعلى من SO أو مجموعات CO. جمعت أقسام القولون أظهرت 5 أيام آخر DNBS معالجة تقرح التنسيق، وتدمير سرداب، واستنفاد الخلايا الكأسية، والغشاء المخاطي تسلل كل من الخلايا الالتهابية الحادة والمزمنة التي تختلف في شدتها بين الجماعات النظام الغذائي. أظهرت مجموعة تغذية SO الضرر أشد تليها CO، وFO تغذية الجماعات التي أظهرت أخف درجة من إصابة الأنسجة. وبالمثل، كان الميلوبيروكسيداز القولون (MPO) النشاط علامة على النشاط العدلة أعلى بكثير في ذلك وتتبعه الفئران CO فدان، مع وجود FO الفئران التي تغذت أقل بكثير النشاط MPO. هذه النتائج تثبت استخدام DNBS التي يسببها التهاب القولون، على النحو المبين في هذا البروتوكول، لتحديد تأثير النظام الغذائي في التسبب في مرض التهاب الأمعاء.
Introduction
يتميز مرض التهاب الأمعاء (IBD) عن الالتهاب المزمن الناكس في المعدة والأمعاء (GI) المسالك، مما أدى إلى أعراض الإسهال، وفقدان الوزن، وألم في البطن. التهاب القولون التقرحي (UC) ومرض كرون (CD) هما أشكال رئيسية من مرض التهاب الأمعاء، ويمكن تمييزها عن طريق موقع التهاب في الجهاز الهضمي. في المرضى UC، الالتهاب عادة ما ينطوي على المستقيم وتمتد متاخم يصل القولون لحد متغير تؤثر فقط على الغشاء المخاطي السطحي. في المقابل، يمكن أن تؤثر على CD أي جزء من الجهاز الهضمي، على الرغم من أنه يؤثر في الغالب على الدقاق والأعور. يظهر CD كثيرا ما التهاب بطريق غالبا ما ترتبط مع حبيبية ويؤدي إلى stricturing (fibrostenotic) و / أو اختراق (fistulizing) المرض. على الرغم من أن مسببات مرض التهاب الأمعاء لا يزال بعيد المنال، ومن المتفق عليه أيضا أن IBD هو سياقاتها، التي تنطوي على تفاعلات بين المضيفين الجهاز المناعي، والقابلية الوراثية المسؤولةسيس إلى العوامل البيئية والجرثومية.
حتى الآن، تم اقتراح نماذج مختلفة من IBD التي تعرض مختلف الاستجابات السريرية والنسيجية والمناعية سمة من جامعة كاليفورنيا وCD. وتشمل النماذج الأكثر شيوعا الفئران المعدلة وراثيا (IL-2، IL-10، SAMP / تطلب الشركة)، والعدوى النماذج التي يسببها (الليمونية rodentium، السالمونيلا التيفية الفأرية)، ونماذج نقل بالتبني (CD45 + RB عالية، ونقل الخلايا CD62L + في الفئران SCID) و نماذج التهاب القولون يسببها كيميائيا (ديكستران كبريتات الصوديوم (DSS)، Trinitrobenzene حامض السلفونيك (TNBS)، وثنائي نتروبنزين حامض السلفونيك (DNBS)). نظرا لانخفاض تكلفتها وسرعة ظهور المرض، وتعتبر النماذج الكيميائية لا تقدر بثمن لدراسة مختلف جوانب IBD. كل من نماذج التهاب القولون مادة كيميائية مدرجة مزاياه فضلا عن القيود في بعض الجوانب ذات الأهمية السريرية، والمناعية والأنسجة لبنك التنمية بين الامريكتين. مفاجآت صيف دبي هي واحدة من الطرق الكيميائية الأكثر شيوعا المستخدمة للحث على القولونيةتيس في القوارض 1. إدارة 3-10٪ DSS (MW: 42 كيلو دالتون) لمدة 7-10 أيام في مياه الشرب من الفئران يمكن أن تحدث أعراض وعلامات التهاب القولون بما في ذلك فقدان الوزن والاسهال والدم، تقصير القولون، تقرح المخاطية والعدلة التسلل. هذا النموذج هو مفيدة بشكل خاص للدراسات فحص المخدرات، فضلا عن استكشاف آليات التجديد الظهارية، وتأثير المناعة الفطرية في المخاطية التوازن، ودور الالتهاب في تعزيز النمو الشاذ المعوية والتنمية غدية. ولكن هناك بعض السلبيات لنموذج مفاجآت صيف دبي، بما في ذلك الاختلاف في تركيز DSS اللازمة للحث على التهاب القولون في مرافق حيوانية مختلفة، فضلا عن امتصاص المياه غير متناسقة من قبل الفئران وبالتالي التعرض لمفاجآت صيف دبي تتعارض، مما أدى إلى تفاوت في درجة ومدى و توزيع إصابة الغشاء المخاطي وتقرحات في القولون. كل هذه الميزات يؤدي إلى عدم تجانس النتائج والحد من القدرة على مقارنة النتائج عبر دراسات الابام مجموعات بحثية مختلفة.
بديلا للنموذج مفاجآت صيف دبي هو DNBS التي يسببها ناشبة أو نماذج TNBS من التهاب القولون. هذا النموذج يستخدم تقطير المستقيم من المخاطية توعية وكلاء DNBS أو TNBS، مخففة في تركيزات متفاوتة من الايثانول. إدارة الإيثانول هو شرط أساسي لكسر حاجز الغشاء المخاطي للقولون للسماح تغلغل DNBS أو TNBS في الصفيحة المخصوصة. سوف DNBS / TNBS ثم haptenize القولون والأمعاء الميكروبي البروتينات المترجمة لتصبح مناعة، مما اثار المضيف الفطرية والاستجابات المناعية التكيفية. بشكل عام، ويرتبط هذا النموذج مع الإسهال الشديد والدموي أحيانا، وفقدان الوزن وسماكة جدار الأمعاء ولكن الأعراض تختلف تبعا لنوع من القوارض المستخدمة، وكذلك توقيت والجرعة ودرجة التعرض إلى DNBS أو TNBS المستخدمة في الدراسة. وتجدر الإشارة إلى الفروق المهمة بين الفئران والجرذان، مع فوائد أقل تكلفة للشراء والمجلس، وكذلك لويص كتلة الجسم لتقليل لكل حيوان تكاليف العلاج في الجسم الحي. هذا يجب تعيين ضد مسار أكثر سرعة وشديدا من التهاب القولون في الفئران، حيث الحيوانات أكثر هشاشة وتستجيب بسرعة قد تصل إلى نقطة نهاية إنسانية.
التهاب الأمعاء النتائج في البداية من الإيثانول الناجم عن تلف الخلايا الظهارية في الأمعاء، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية الظهارية، والاختراق الميكروبية في الغشاء المخاطي، haptenization من البروتينات المضيف، كل هذا أدى إلى تسلل العدلات، الضامة والخلايا اللمفية تي الاستجابة Th1 في الغشاء المخاطي للتلف. بالمقارنة مع DNBS، ويعتبر TNBS كمادة كيميائية خطرة نظرا لخصائص التأكسدي للغاية لأنه يمكن أن تشكل خطر الانفجار على اتصال مع القواعد مثل الصوديوم وهيدروكسيد البوتاسيوم. لذا يعتبر DNBS حاليا كخيار يفضل الكيميائية على TNBS للحث على التهاب القولون. في القوارض، ويعتبر التهاب القولون DNBS باعتبارها واحدة من الأساليب الأكثر ملاءمة لدراسة فولو فوتبال شيIBD الجناح المرتبطة معدلات المرض:
- الاكتئاب وتنشيط التهاب القولون: ولقد ثبت أن التوتر والقلق والاكتئاب في المرضى الذين يعانون IBD وكثيرا ما يرتبط مع انتكاس المرض. DNBS التهاب القولون هو نموذج مناسب لدراسة دور الاكتئاب وآثاره على تنشيط التهاب القولون في الفئران. طريقة الاستقراء الأولي عادة ما ينطوي على التهاب القولون بواسطة DNBS، يليه قرار من التهاب القولون من خلال ترك الفئران لمدة 6-8 أسابيع. ثم تدار الفئران مع الاكتئاب العوامل المسببة مثل ريزيربين أو عن طريق حاسة الشم bulbectomy للحث على الاكتئاب يليه اختبار لهم لتنشيط التهاب القولون من خلال التحدي مع جرعة من subcolitic DNBS 2.
- التوتر وتنشيط التهاب القولون: الإجهاد هو عامل بيئي آخر شائع التي تم ربطها إلى IBD المرضية. هناك مجموعة متزايدة من الأدلة التي تشير إلى وجود علاقة قوية بين التوتر المزمن وظهور الأعراض من جامعة كاليفورنيا وCD في القوارضق وكذلك في البشر والرئيسيات غير البشرية 3. DNBS التهاب القولون هو نموذج جيد لدراسة تفعيل المرتبطة الإجهاد التهاب القولون في كل من الفئران والجرذان. وعادة ما يتم استخدام طريقة بطريقة مماثلة على النحو المذكور أعلاه لعلاج الاكتئاب إلا في مكان والاكتئاب، وتتعرض الحيوانات لعوامل الإجهاد مثل الصوت وضبط النفس الإجهاد 4.
- التهاب العصبية: وقد وصف عدد من الدراسات إما تعديلات عابرة أو دائمة في الجهاز العصبي المعوي (ENS) البنية والوظيفة، كما رأينا في عينات الأنسجة من النماذج الحيوانية ومن المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء. DNBS هو نموذج جيد لاستكشاف آثار التهاب على ENS 5 ودراسة كل من نورأدريني والمسارات العصبية كوليني 6.
- آليات إصابة إصلاح: خلال IBD المرضية، كلها قد أظهرت المستمدة من المضيفة وسطاء إصابة مثل أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، وأكسيد النيتريك (NO)، بين الخلايا جزيء التصاق 3 (ICAM-3)، وف selectin عيكمن دور في تعطيل الظهارية في الأمعاء. DNBS هو نموذج ممتاز لدراسة الإصابات الناجمة عن تنظيم ما يصل من هذه الوسطاء فضلا عن آليات الإصلاح التي يتم تنظيمها باستخدام أدوية مثبطات انتقائية أو 7،8.
- التهاب بطريق: بالإضافة إلى التطبيقات المذكورة أعلاه من DNBS، ونموذج يمكن أن تطبق أيضا على دراسة الالتهابات بطريق للامعاء، وميزة الكلاسيكية وجدت في المرضى الذين يعانون من CD. وترتبط كل من DNBS والتهاب القولون TNBS التي يسببها مع تسلل كبيرة من الخلايا الليمفاوية، في الغشاء المخاطي للقولون مما يجعل هذه النماذج مفيدة بشكل خاص لدراسة خلايا T المناعية آليات التابعة.
بالمقارنة مع النموذج مفاجآت صيف دبي، ومزايا DNBS والتهاب القولون TNBS التي يسببها تشمل منخفضة التكلفة، والتطور السريع للالتهاب القولون (وعادة ما يتطلب 1-3 أيام لتظهر تقرحات والتهاب استنساخه) والضرر المترجمة متسقة إلى القولون البعيدة. ولكن السلبيات هي شرط لمستوى أعلى من الخبرة التقنية، والتحسين من جرعة DNBS / TNBS، والحاجة للتخدير لإدارة المستقيم.
في هذه الورقة المنهجية درسنا آثار تركيزات مختلفة من ن 6 و n-3 الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة على تغيير استجابة القولون المخاطي لالتهاب القولون DNBS التي يسببها في الفئران باستخدام الزيوت النباتية زيت القرطم (SO) وزيت الكانولا (CO) ، وزيت السمك (FO). وقد تبين أن الأحماض N-6 و n-3 الدهنية وسطاء هاما من مرض التهاب الأمعاء من خلال دورها في الأنصاف أسيل من phosopholipids غشاء الخلية 9. وعلى النقيض من المحتمل proinflammatory ن 6 والأحماض الدهنية، ن 3 الدهنية في تناول جرعات عالية بما فيه الكفاية يمكن أن تكون الأدوية المضادة للالتهابات. يتم بوساطة الإجراءات المضادة للالتهابات ن 3 الدهنية مباشرة من خلال استبدال حمض الأراكيدونيك باعتبارها الركيزة eicosanoid، تثبيط استقلاب حمض الأراكيدونيك وبشكل غير مباشر من خلال تغيير proinflالتعبير الجيني ammatory وإشارة الخلية. الأحماض الدهنية ن 3 أيضا إلى نشوء resolvins، وهي عائلة من الوسطاء المضادة للالتهابات. ويرتبط تناول كميات كبيرة من ن 3 الأحماض الدهنية مع انخفاض في إنتاج eicosanoids proinflammatory، السيتوكينات، كيموكينات، أنواع الاكسجين التفاعلية والتعبير عن جزيئات الالتصاق. في هذه الدراسة، تم تغذية الفئران حمية بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية متطابقة في جميع العناصر الغذائية ما عدا الأحماض الدهنية، مع كطاقة في المئة من الدهون، 20٪ SO، 20٪ CO، أو 18٪ زيت السمك بالاضافة الى 2٪ زيت القرطم (FO) 10-11 . كنسبة مئوية من الطاقة يوميا، شريطة النظام الغذائي SO 15٪ حمض اللينوليك (LA)، مع <0.06٪ α حمض اللينولينيك (ALA)، وحمض الدهني لا (EPA) أو حمض الدوكوساهيكسانويك (DHA)، وكان النظام الغذائي CO 4.2 LA٪ و 1.9٪ مع عدم وجود ALA EPA DHA أو، والنظام الغذائي FO قدمت وكالة حماية البيئة 1.4٪، 4.9٪ DHA، 0.32٪ LA، و 0.12٪ ALA. بعد ثلاثة أسابيع من بدء النظام الغذائي الدهون، كانت تدار على الفئران DNBS داخل المستقيم أو 50٪ من الإيثانول وضحى بعد 5 أيام. وinflتم تقييم استجابة ammatory عن طريق تقييم من فقدان الوزن، وعشرات الضرر النسيجي والأنسجة النشاط الميلوبيروكسيداز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الإجراءات التي تجرى على الحيوانات اتباع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان التي حددتها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة كولومبيا البريطانية.
وسيتم وصف الإجراءات المذكورة في هذا البروتوكول لكلا الفئران والجرذان، في حين سيتم عرض نتائج ممثلة من الفئران سبراغ داولي.
1. إعداد DNBS والإدارة داخل المستقيم
- لتقطير المستقيم من DNBS في الفئران، وإعداد طازجة 15-30 ملغ من DNBS/250 ميكرولتر من 50٪ من الايثانول. بالنسبة للفئران، وإعداد 2-6 ملغ من DNBS/100 ميكرولتر من 50٪ من الايثانول. ملاحظة: تحسين تركيز DNBS بالضبط على أن تدار في كل مرفق. ويفضل الذكور سبراغ داولي الفئران، وC57BL / 6 الفئران لتحريض DNBS التهاب القولون، وسلالات الفئران والجرذان ولكن الآخرين يمكن استخدامها. الفئران والجرذان تعامل فقط مع 50٪ من الإيثانول يمكن أن تستخدم إلا مجموعات المراقبة نظرا للآثار الإيثانول خفيفة أو غائبة، يمكن للمرء أن اومير إدراج هذه المجموعة لدراسة 12.
- نعلق حقنة 1 مل إلى 19 إبرة G لديها القسطرة البولي إثيلين (PE-90 - الفئران أو PE-50 - الفئران) تثبيتها حتى نهايتها.
- بخفة تخدير الفئران أو الماوس يستريح على وسادة التدفئة (مثلا عن طريق إدارة 1.5٪ isoflurane وعبر مخروط الأنف، يجب أن الحيوانات لا تزال لديها وميض وردود الفعل البلع والتنفس العادية عرضه). تطبيق هلام المسيل للدموع لعينيه لتجنب جفاف العينين.
- تطبيق الضغط بلطف مع أطراف الأصابع إلى نهاية الخلفي من الحيوان إلى إزالة أي البراز التي قد تكون موجودة في القولون البعيدة.
- إدراج بلطف القسطرة intrarectally، مع القسطرة ليصل إلى حوالي 8 سم الأقرب إلى فتحة الشرج بالنسبة للفئران، أو 3-4 سم للفئران. حقن كمية صغيرة من الحل في حين إدخال القسطرة لتليين، مما يسهل الإدراج. ملاحظة: إذا كان يشعر أي مقاومة أثناء إدخال القسطرة، لا تستمر لإدراج لأن هذا قد يؤدي إلى انثقابجدار الأمعاء. إزالة القسطرة ومحاولة معاودة بلطف، ومرة أخرى التشحيم القولون كما المتابعة.
- حقن ببطء 250 (الفئران) أو 100 (الفئران) ميكرولتر من DNBS، أو حجم مساو أو 50٪ من الإيثانول لعناصر. بعد حقن DNBS، ضع الحيوان الرأس إلى أسفل لمدة 90 ثانية لتجنب فقدان DNBS.
- بعد تناوله DNBS، وإطعام الحيوانات 8٪ من المياه في السكروز 0.2٪ المالحة لمنع الجفاف خلال الأسبوع الأول.
- مراقبة بعناية الحيوانات، مع المتابعة اليومية لفقدان الوزن وعلامات الجفاف أو استغاثة لمدة التجربة. ملاحظة: فقدان الوزن قد تقترب بسرعة التوصيات CCAC من الحد الأقصى المسموح به وفقدان الوزن. لأن هذا المستمدة في معظمها من الجفاف، يجب استخدام وفقدان الوزن كمؤشر لإدارة حل رينغر اللاكتيكية للحد من الجفاف. يرجى التأكد من التشاور مع الطبيب البيطري منشأة على القضايا الصحية حسب الاقتضاء.
2. شاركllecting مناديل وتقييم الأضرار النسيجية في الفئران DNBS متحدي
- في نقطة الوقت المطلوب بعد التحدي مع DNBS، الموت ببطء الحيوانات عن طريق جرعة زائدة مع isoflurane وفي غرفة التخدير تستكمل مع ما يكفي من الأوكسجين. مراقبة الحيوان حتى لا ينظر الصاعدة والهابطة من الصدر وليس هناك ضربات القلب واضح. تأكيد الحيوان الموت الرحيم تم بشكل صحيح عن طريق عدم وجود استجابة لقرصة أخمص القدمين أو لمس القرنية، تليها خلع عنق الرحم.
- فتح تجويف البطن وإزالة الأمعاء الغليظة بأكمله. فتح الأمعاء طوليا؛ ينبغي مراعاة القرحة المخاطية العيانية حوالي 5-6 سم القريبة من النهاية البعيدة من القولون في الفئران (2-3 سم في الفئران). ملاحظة: بعد إزالة الأمعاء الغليظة، وتقييم الأضرار عشرات العيانية اذا شئت. جمع شرائح القولون من المقابلة الموقع التشريحي من الحيوانات السيطرة. ملاحظة: إن الأفراد بتسجيله الأنسجة لدرجات الضرر العيانية ينبغييكون أعمى لهوية الجماعات العلاج. يسجل أقسام الأنسجة باستخدام معايير التالية أو ما شابه ذلك: شدة ومدى تقرح (0-10)، وقد لخص مع عشرات لغياب أو وجود إسهال (0 أو 1)، التصاقات (0 أو 1 أو 2) وأقصى سمك الجدار القولون في ملليمتر 11.
- جمع 0.5 سم أقسام الأقرب إلى موقع الضرر العيانية القصوى. المفاجئة تجميد واحد القسم 0.5 سم في النيتروجين السائل في وقت لاحق لتقييم الميلوبيروكسيداز (MPO) النشاط (مقياس العدلات تسلل)، ووضع القسم الآخر في 10٪ من الفورمالين مخزنة محايدة للتحليل النسيجي. ملاحظة: عض الأنسجة المجمدة لويمكن تخزين الميلوبيروكسيداز مقايسة في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
- السماح للأنسجة التي تم جمعها للتحليل النسيجي في الخطوة 2.3 لإصلاح في الفورمالين بين عشية وضحاها، ثم يغسل مع الايثانول 70٪. تضمين الأنسجة في البارافين وقطع لسمك المطلوب (3-5 ميكرون)، وصمة عار مع hemotoxylin ويوزين (HE) لتسجيل النسيجي. لديهم اثنين من المراقبين يسجل على الأقل ثلاثة أقسام الأنسجة من كل حيوان تحت المجهر ضوء لتحديد درجات الضرر النسيجي لكل مجموعة. ملاحظة: يجب أن يكون أعمى والأفراد بتسجيله الأنسجة لدرجات الضرر النسيجي للهوية مجموعات العلاج. يسجل أقسام الأنسجة باستخدام معايير التالية أو ما شابه ذلك: مدى ارتشاح الخلايا الالتهابية (0 = غائبة، 3 = بطريق)، وفقدان العمارة المخاطية (0 = غائبة، 3 = شديد)، وجود أو عدم وجود خراجات سرداب (0-1) ، واستنفاد الخلايا الكأسية (0-3). تحديد درجة الضرر النسيجي كمجموع هذه الحسابات 11.
3. أداء الميلوبيروكسيداز (MPO) على الفحص DNBS تحدى المعوية الأنسجة
- النشاط MPO مقايسة في قطاعات سم 0.5 القولون حصلت عليه في الخطوة 2.3. التجانس الأنسجة العازلة في التجانس MPO (0.5٪ hexadecyltrimethyl الأمونيوم بروميد في 50 ملي العازلة فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 6.0)) لإعطاء 50 ملغ القولون segmeالإقليم الشمالي / مل من التجانس العازلة التعليق.
- قسامة الحل المتجانس في 1 مل أجزاء وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة في 10،000 ز س.
- مزيج 100 ميكرولتر من كل قسامة مع 2.9 مل من 50 ملي العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 6.0) تحتوي على 0.167 ملغ / مل من س dianisidinedihydrochloride و0.0005٪ بيروكسيد الهيدروجين في كفيت.
- قياس معدل الامتصاص باستخدام معمل في 460 نانومتر. ملاحظة: يتم تعريف النشاط MPO كما كمية انزيم المهينة 1 ميكرومول / دقيقة من H 2 O 2 إلى H 2 O في درجة حرارة الغرفة، ويعبر عنها في وحدات لكل ملغ من الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التحدي المتمثل في الفئران (سبراغ داولي) أو الفئران (C57BL / 6) مع DNBS النتائج عادة في فقدان الوزن والاسهال عابرة، وأحيانا مع الحاضر الدم في البراز. ومع ذلك، يمكن لعوامل مثل الوراثة، والنظام الغذائي ومجهريات البقعة المعوية تعديل القابلية للالتهاب القولون DNBS التي يسببها. وبالتالي، الحيوانات المدرجة في التجارب يجب أن تكون من نفس المؤسسة، إما مشتقة محليا أو أمر من المورد في حيوان واحد. وينبغي رصد جميع الحيوانات بعناية لدرجة فقدان الوزن وأعراض الشدة عانى خلال التهاب القولون.
النتائج المقدمة في أرقام 1-4 تمثل تجربة فيها آثار ثلاثة الزيوت الغذائية: تم تقييم زيت القرطم، زيت الكانولا، وزيت السمك على شدة الناتجة من DNBS التهاب القولون. تم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات باستخدام اختبار أنوفا تليها آخر مخصص توكي، وذلك باستخدام برنامج حاسوبي تحليل البيانات. كانت قيمة AP من <0.05 considered كبيرة.
بعد التحدي داخل المستقيم مع DNBS (20 ملغ DNBS/250 ميكرولتر من 50٪ من الإيثانول)، لوحظ فقدان وزن كبير من قبل لمدة 48 ساعة في الفئران تستكمل مع FO وأول أكسيد الكربون و72 ساعة في الفئران تستكمل مع SO (P <0.05). ويعتبر فقدان الوزن الأقصى في 48 ساعة في الفئران تستكمل مع FO و72 ساعة في الفئران تستكمل مع أول أكسيد الكربون والكبريت. استأنفت زيادة الوزن بعد 72 ساعة، وبنسبة 5 DNBS أيام آخر، وFO SO إظهار مجموعات الأوزان هيئة مماثلة للقيم الأساسية. الفئران السيطرة تستكمل مع الوجبات الغذائية وتحدى مع الايثانول داخل المستقيم مواصلة اكتساب الوزن خلال فترة الدراسة 5 أيام.
الضرر المعوية التي تسببها DNBS يمكن أن يكون على نطاق واسع، ولكن مجال الضرر القصوى المترجمة عموما إلى القاصي 6 سم من القولون في الفئران، وسم القاصي 3 في الفئران. ظاهريا هذا يمكن ملاحظتها كما القولون سماكة الجدار، وتقرح المخاطية، والتصاق عرضية من حيآل القولون إلى الأجهزة المجاورة، مثل المثانة. ويلاحظ على التقييم النسيجي أقرب، والإصابة الظهارية واسعة في بعض المناطق مما يؤدي إلى ظهور تقرحات، وتسلل خلية المناعة (الخلايا الليمفاوية والعدلات الغالب)، التهاب الخبايا، واستنزاف المخاط، وذمة. على الرغم من هذه العلامات النسيجي للالتهاب وتلف الأنسجة واضحة في جميع الفئات النفط تستكمل الغذائية الثلاثة لدى التحدي مع DNBS، ويعتبر الضرر أشد في المجموعة زيت القرطم، تليها مجموعة زيت الكانولا، بينما الفئران في المجموعة زيت السمك إثبات الحد الأدنى من الإصابة الظهارية وتسلل محدود من الخلايا الالتهابية في الغشاء المخاطي (الشكل 2).
يمكن قياس الاختلافات في الضرر النسيجي للسماح للمقارنة بين أفضل المجموعات. وشملت المعايير المستخدمة لتقييم الضرر النسيجي مدى ارتشاح الخلايا الالتهابية، وفقدان العمارة المخاطية، واستنفاد الخلايا الكأسية، ووجود crypر خراجات. هو مبين في الشكل (3) هي درجات الضرر النسيجي للمجموعات الغذائية النفط خلال ثلاثة DNBS التهاب القولون. كما ينظر في أقسام H & E الملون في الشكل 2، ومجموعة النفط تستكمل القرطم له أقصى حد من الضرر، تليها مجموعة زيت الكانولا، في حين تظهر مجموعة زيت السمك أقل قدر من الضرر.
مدى ارتشاح الخلايا الالتهابية وخاصة العدلات، يمكن فحص عن طريق إجراء المزيد من الميلوبيروكسيداز (MPO) النشاط الفحص. يعتبر MPO علامة على حدوث الالتهابات، كما هو انزيم وجدت في حبيبات من المحببة العدلة والخلايا الأخرى من النسب النخاعي. تقييم النشاط MPO في كولون الفئران في يوم 5 بعد التعرض DNBS يتضح وجود زيادة في النشاط في جميع الفئات الثلاث (الشكل 4). لوحظ أكبر نشاط MPO في المجموعة زيت القرطم، تليها مجموعة زيت الكانولا، في حين ينظر إلى أدنى النشاط في الخطة الرئيسية للعملياتمجموعة زيت السمك، والمقابلة لدرجات الضرر النسيجي المقررة في الشكل 3.
الشكل 1. التغييرات في وزن الجسم (٪ من خط الأساس) التالية الإدارة داخل المستقيم من 50٪ من الإيثانول (السيطرة) أو ثنائي نتروبنزين حامض السلفونيك (DNBS) في الإناث الكبار الفئران سبراغ داولي (250-500 ز) تغذية SO، CO، أو FO. الفئران هي ثم مراقبتها لفقدان وزن الجسم من يوم 1 حتى يوم 5 بعد العلاج. يتم رسم فقدان نسبة من وزن الجسم ضد يوما بعد العلاج DNBS. القيم هي الوسائل ± SEM، ن = 5 / المجموعة. بالمقارنة مع غير DNBS المعالجة نظرائهم، وكان الفئران التي تغذت مع ثاني أكسيد الكربون وFO انخفاضا كبيرا في وزن الجسم الأولية في وقت مبكر من يوم 1 بعد العلاج DNBS بينما في يوم 3 جميع المجموعات الثلاث من الفئران كان سيجnificant فقدان الوزن النسبي لوزن الأساس (P <0.01). جميع الفئات التهاب القولون تثبت زيادة الوزن بعد 72 ساعة، مع الوزن تعود إلى خط الأساس في FO والجماعات تغذية SO. إظهار الفئران في مجموعات المراقبة الإيثانول زيادة الوزن خلال فترة الدراسة 5 أيام. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. المظهر النسيجي من H & E الملون أقسام ممثل الأنسجة القولون بعد 5 أيام الإدارة داخل المستقيم من 50٪ من الإيثانول (CTL) أو DNBS لإناث الفئران الكبار تغذية SO، CO، أو FO. يتم جمع الأنسجة في 10٪ من الفورمالين، وسمحت للإصلاح لمدة لا تقل من 24 ساعة تليها باجتزاء الأنسجة وسعادة تلطيخ. الأقسام الأنسجة من الفئران التي تغذت SO CO وإثبات انقطاع كبير من النزاهة الظهارية مع درجات متفاوتة من الإصابة الظهارية، وانخفاض سرداب بها، تشكيل القرحة وبطريق التسلل الخلايا المناعية، مع التغييرات أكثر وضوحا ينظر مع SO. في الفئران CO فدان، ويعتبر دليلا على تجديد الظهارية والرد. في المقابل، حافظت تغذية الفئران FO سلامة الظهارية، وكان تسلل محدود من الخلايا الالتهابية تقتصر على الصفيحة المخصوصة. (M-الغشاء المخاطي، SM الفرعية الغشاء المخاطي وU-تقرح؛ التكبير 100X الأصلي؛ شريط مقياس: 100 ميكرون). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. درجة الضرر النسيجي للأنسجة القولون 5 أيام فيأي fter الإدارة داخل المستقيم من 50٪ من الإيثانول (شريط واضح) أو DNBS (شريط الصلبة) لإناث الفئران الكبار تغذية SO، CO، أو FO. وسجل أقسام الأنسجة بواسطة محقق من ذوي الخبرة، أعمى للعلاجات، وذلك باستخدام معايير محددة على أساس النسيجية الضرر. المعايير المستخدمة لهذه الدراسة تشمل: التهابات تسلل خلية (0 = غائبة، 3 = بطريق)، وفقدان النزاهة المخاطية (0 = غائبة، 3 = شديد)، وتشكيل الخراج سرداب (0 = غائبة، 1 = الحاضر) استنفاد الخلايا الكأسية (0 = غائبة، 3 = مرتفع). يتم تحديد درجة الضرر النسيجي كمبلغ عشرات الحصول بتسجيله ما لا يقل عن ثلاثة أقسام الأنسجة من كل حيوان. النتائج تدل بوضوح على الضرر النسيجي انخفاض في الفئران FO تغذية بالمقارنة مع SO CO والفئران التي تغذت. القيم هي الوسائل ± SEM، ن = 5 / المجموعة. مقارنة مع الضوابط الايثانول منها، ويرتبط الإدارة DNBS مع زيادة كبيرة في درجة الضرر (P <0.05)؛ التهاب القولون مجموعات مع رموز مختلفة ومختلفة إلى حد كبير (P <؛ 0.01) اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4. النشاط MPO في أنسجة القولون بعد 5 أيام الإدارة داخل المستقيم من 50٪ من الإيثانول (شريط واضح) أو DNBS (شريط الصلبة) لإناث الفئران الكبار تغذية SO، CO، أو FO. والمفاجئة تجميد أنسجة القولون الملتهبة في النيتروجين السائل ويعاير للنشاط الميلوبيروكسيداز ، وذلك في مؤشر محببة التسلل. تغذية الفئران Colitic FO تظهر انخفاض النشاط MPO مقارنة SO والقيم المحدودة هي وسائل ± SEM، ن = 5 / المجموعة. مقارنة مع الضوابط الايثانول منها، ويرتبط الإدارة DNBS مع زيادة كبيرة في النشاط MPO (P <0.001)؛ التهاب القولون مجموعات مع رموز مختلفة هي significantlذ مختلفة (P <0.05). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج DNBS الموصوفة في هذا البروتوكول هو قيمة وغير مكلفة، وقابلة للتكرار نموذج التهاب القولون التي يمكن استخدامها لدراسة مختلف جوانب IBD. عندما تدار intrarectally للفئران أو الفئران، DNBS الحث على درجة كبيرة من الالتهابات وإصابات الأنسجة في القولون، تشبه مرض كرون الإنسان من حيث العديد من المظاهر النسيجية لها بما في ذلك تسلل بطريق خلايا النوى والغالبة تفعيل الاستجابة Th1 NF كيلوبايت تعتمد.
وقد استخدم هذا النموذج لدراسة مختلف العوامل يعتقد أن تؤثر على IBD مثل الإجهاد، والاكتئاب، والنظام الغذائي، فضلا عن تورط الجهاز العصبي المعوي، وآليات إصلاح إصابة، والتهاب بطريق، والعلاجات قبل السريرية. نموذج DNBS هو أيضا بديل مناسب لالتهاب TNBS التي يسببها في الفئران والجرذان ويوفر بديلا أقل تكلفة لنماذج الكيميائية المستخدمة عادة أخرى من التهاب القولون مثل مفاجآت صيف دبي. الخطوات المذكورة في هذه الصفحةسوف rotocol تسمح لأحد لتنفيذ هذا النموذج بنجاح.
بما يتفق مع نماذج تجريبية أخرى من التهاب القولون 13-16، يعزز الدراسة الحالية الآثار متغير من الدهون الغذائية على المخاطية المعوية الاستجابات المناعية حيث تناول كميات كبيرة من EPA و DHA المستهلكة قبل وبعد التعرض DNBS خفف، في حين تناول كميات كبيرة من ARA مع الحد الأدنى من ن -3 الأحماض الدهنية يؤدي إلى تفاقم التهاب القولون. الآثار المفيدة من النظام الغذائي ن 3 الدهنية لوحظ في هذه الدراسة ويرجع ذلك جزئيا إلى n-3 الأحماض الدهنية أقل فعالية الأنسجة فوسفورية ARA سواء عن طريق تثبيط توليف ARA من لوس انجليس وعن طريق استبدال ARA مع وكالة حماية البيئة وهيئة الصحة بدبي. ينقل هذا التغيير الركيزة الأحماض الدهنية المتاحة لاطلاق سراح والتوليف eicosanoid اللاحقة نحو بيئة أقل proinflammatory. في المقابل، يرتبط تناول كميات كبيرة من ن 6 والأحماض الدهنية مع ARA القولون عالية مع التوليف اللاحقة من الوسطاء proinflammatory التي تزيد من حدة الاستجابة المناعية المخاطية. في بالاستمرارغ مع دراستنا الأخيرة في الليمونية rodentium يسببها التهاب القولون، والفئران التي تغذت زيت الكانولا مع ARA أقل من زيت عباد الشمس، ولكن مع n-3 ALA وكالة حماية البيئة لا DHA أو كان استجابة التهابية المتوسطة 16.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤثر على التنفيذ الناجح للنموذج DNBS. وقد استخدمت دراسات مختلفة تركيزات متفاوتة من DNBS تتراوح بين 3-6 ملغم / الماوس أو 15-30 ملغ / الفئران لإقامة التهاب القولون. وبالتالي، فمن المهم للمحققين الفردية لتحسين جرعة من DNBS لدراستهم، لأن الجرعات الأمثل قد تختلف من منشأة حيوان واحد إلى آخر. من المهم أيضا أن نلاحظ أن تركيز DNBS سوف تختلف وفقا لنوع وأنواع من الحيوانات التي محقق يستخدم (مثال: قد تكون بعض السلالات أكثر عرضة وأكثر مقاومة للآخرين DNBS). ينبغي توخي الحذر لضمان أن تركيز DNBS ليست عالية جدا كما يمكن أن يسبب هذا الموت السريع للحيوانات دورة الفتشوبlting من انثقاب الأمعاء وتعفن الدم. خطوة حاسمة أخرى لاستخدام هذا النموذج على تطوير الطريقة المناسبة للداخل المستقيم الإدراج قسطرة في القولون البعيدة من الحيوان. وجود البراز في القولون قد تمنع الإدراج كافية من خلال القسطرة تقطير. لتجنب هذا، وتطبيق الضغط بلطف على نهاية الخلفي من فتحة الشرج من الفئران مخدرة برفق لإزالة أي البراز في القولون البعيدة / المستقيم. فمن المستحسن لادخال القسطرة حوالي 3-4 سم من فتحة الشرج، على الرغم من أنه يجوز تمديدها لمدة أقصاها 6-8 سم في الفئران حتى الثنية الطحال (منعطف حاد بين عرضية والقولون تنازلي) 7. من المهم أن نلاحظ أنه خلال إجراء تقطير، والتشحيم والقسطرة عن طريق حقن DNBS / الإيثانول بكميات صغيرة تسمح الإدراج أسهل للقسطرة. من أجل تجنب ارتداد إلى الوراء من DNBS من فتحة الشرج، فمن الأهمية بمكان أن يعقد الحيوانات في وضع الرأس إلى أسفل لمدة 90 ثانية أو بدلا من ذلك، ويمكن أن تظل الفئران لمدة 15 دقيقة في موقف تراند (موقف ضعيف حيث يتم وضع القدمين أعلى من رأسه 15-30 درجة).
الأنسجة يمكن جمعها في نقاط زمنية مختارة تبعا لمصالح والمحقق ما إذا كان تركيز الدراسة على الالتهاب الحاد أو المزمن. بالإضافة إلى ذلك، الأنسجة يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة ENS المعوية والجهاز المناعي الفطرية والتكيفية. ومع ذلك، فمن الضروري لضمان أن يتم أخذ عينات الأنسجة بشكل صحيح. فمن المستحسن لجمع الأنسجة في حجم وافرة من 10٪ من الفورمالين في 5 مل قارورة مقابل قارورة حجم أصغر لضمان تثبيت المناسبة. التثبيت المناسب للعينات هو مفتاح لدراسة كل من الضرر الأنسجة والتصور من الجزيئات المستهدفة في الأنسجة التي كتبها H & E والمناعية، على التوالي. يجب أن يتم تنفيذ التهديف النسيجي للأنسجة من قبل الأفراد ذوي الخبرة الذين أعمى لظروف تجريبية، وذلك باستخدام معايير ثابتة وضعتها رانه فرد 11،17 المحقق. الميلوبيروكسيداز (MPO) بمثابة علامة جيدة لالتهاب أو إصابة الأنسجة والعدلة التسلل إلى أنسجة الجهاز الهضمي 11. لإجراء فحوصات MPO، يقترح أن يقدح تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل ويوم التحليل، فمن المستحسن للعمل مع الطازجة مخازن والحلول للحصول على أفضل وأدق النتائج. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النموذج لدراسة الخلايا الالتهابية التي تتسلل الأمعاء، والآليات التي تشارك في الكيميائي والتهجير من الخلايا الالتهابية ومختلف مسارات المشاركة في تفعيل وإطلاق وسطاء proinflammatory الأخرى المشاركة في إصابة الأنسجة وكذلك الوسطاء الذين شاركوا في تحوير الاستجابة الالتهابية وإصلاح الأنسجة.
ينبغي أن ينظر إلى عيوب السريرية حاليا باستخدام الأدوية المثبطة للمناعة أو استهداف proinflammatory سايتوكاين واحد مثل TNF-α تشجيع investigators لتطوير استراتيجيات علاجية أفضل لإدارة المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء. النماذج، مثل نموذج DNBS، يسمح للمحققين لزيادة فهمنا للالتسبب في مرض التهاب الأمعاء، ويحتمل أن تحديد أهداف علاجية جديدة وتطوير / تحسين استراتيجيات للسيطرة على الالتهاب عن طريق استخدام مسارات التهابات الرواية وعلاجات جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة العاملة لKJ من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) وكرون والتهاب القولون مؤسسة من كندا (CCFC). ويدعم VM من قبل الزمالة CFRI وGB على studentship خريج من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR). BAV هو الأطفال الذين يعانون من اضطرابات المعوية والكبد مؤسسة (الطفل) رئيسا للأطفال IBD البحوث وكرسي أبحاث كندا في الجهاز الهضمي للأطفال وKJ هو أحد كبار العلماء الطبيب بدعم من الطفل والطفل ومعهد بحوث العائلة (CFRI) برنامج الطبيب جائزة العلماء ، جامعة كولومبيا البريطانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Biotechnol, J. . B. iomed , (2012).
- Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression. Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).
- Reber, S. Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).
- Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis. Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).
- Boyer, L., et al. Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis. Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).
- Saunders, P., et al. Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat. Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).
- Cuzzocrea, S., et al. Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat. Gut. 48 (4), 478-488 (2001).
- Cuzzocrea, S., et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).
- Innis, S., Jacobson, K. Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease. Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).
- Innis, S. M., de La Presa Owens, S. Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain. J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).
- Jacobson, K. Mundra H.,Innis S.M. Intestinal responsiveness to experimental colitis in young rats is altered by maternal diet. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 13-20 (2005).
- Sanovic, S., Lamb, D. P., Blennerhassett, M. G. Damage to the enteric nervous system in experimentalcolitis. Am. J. Pathol. 155 (4), 1051-107 (1999).
- Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis. Gut. 31, 539-544 (1990).
- N-3 fatty acid-rich diet prevents early response of interleukin-6 elevation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced enteritis. Int. J. Mol. Med. Andoh, A., Tsujikawa, T., Ishizuka, I., Araki, Y., Sasaki, M., Koyama, S., Fujiyama, Y. 12, 721-725 (2003).
- Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis. Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).
- Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).
- Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).
