Summary
DNBS / TNBS induceret colitis tilbyder et alternativ og billig metode til at studere Patobiologi af inflammatorisk tarmsygdom. Protokollen diskuteret i dette dokument skitserer den vellykkede anvendelse af DNBS at fremkalde colitis hos mus og rotter, og tillader en at grundigt studere værtsmedierede tarm reaktioner.
Abstract
Inflammatoriske tarmsygdomme (IBD), herunder Crohns sygdom og colitis ulcerosa, har længe været forbundet med en genetisk basis, og mere for nylig vært immunresponser på mikrobielle og miljømæssige midler. Dinitrobenzen sulfonsyre (DNBS)-induceret colitis gør det muligt at studere patogenesen af IBD forbundne miljømæssige udløser såsom stress og kost, virkningerne af potentielle behandlingsformer, og de mekanismer, der ligger tarmbetændelse og mucosal skade. I dette papir, undersøgte vi virkningerne af kosten n-3 og n-6 fedtsyrer på colon mucosa-inflammatoriske respons på DNBS-induceret colitis i rotter. Alle rotter blev fodret identiske diæter med undtagelse af forskellige typer fedtsyrer [saflorolie (SO), canolaolie (CO) eller fiskeolie (FO)] i tre uger før eksponering for intrarektal DNBS. Kontrol rotter, der fik intrarektal ethanol fortsat tage på i vægt i løbet af de 5 dages undersøgelse, mens DNBS-behandlede rotter fodret lipid kostvaner alle loston med FO og CO fodrede rotter viser betydelige vægttab med 48 timer og rotter fodret SO ved 72 timer. Vægtøgning genoptaget efter 72 timer efter DNBS, og ved 5 dage efter DNBS, FO-gruppen havde en højere kropsvægt end SO eller CO-grupper. Colon sektioner samlet 5 dage efter DNBS-behandling viste fokal ulceration, krypt ødelæggelse, bæger cellereduktion og slimhinde infiltration af både akutte og kroniske inflammatoriske celler, der afveg i sværhedsgrad blandt kost grupper. Den så træt gruppe viste den mest alvorlige skader efterfulgt af CO, og FO fodret grupper, der viste den mildeste grad af vævsskade. Tilsvarende colon myeloperoxidase (MPO) aktivitet, en markør for neutrofil aktiviteten var signifikant højere i SO efterfulgt af CO fodrede rotter med FO fodret rotter har væsentligt lavere MPO-aktivitet. Disse resultater demonstrere brugen af DNBS-induceret colitis, som skitseret i denne protokol, for at fastslå virkningen af kosten i patogenesen af IBD.
Introduction
Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er kendetegnet ved kronisk tilbagevendende betændelse i mave-tarm (GI) kanal, hvilket resulterer i symptomer på diarre, vægttab og mavesmerter. Colitis ulcerosa (UC) og Crohns sygdom (CD) er de to vigtigste former for IBD og kan skelnes ved placeringen af betændelse i mave-tarmkanalen. I UC patienter, betændelse involverer typisk rektum og strækker contiguously op tyktarmen til en variabel grad påvirker kun den overfladiske slimhinde. I modsætning hertil kan CD påvirke nogen del af mavetarmkanalen, men det overvejende påvirker ileum og coecum. CD ofte manifesterer sig som transmural inflammation ofte forbundet med granulomer og fører til stricturing (fibrostenotic) og / eller penetrerende (fistulizing) sygdom. Selvom ætiologien af IBD fortsat undvigende, det er godt accepteret, at IBD er multifaktoriel, der involverer samspillet mellem værter immunsystemet, genetiske modtagelighed og ansvarses på miljømæssige og mikrobielle faktorer.
Til dato har forskellige modeller af IBD er blevet foreslået, at vise forskellige kliniske, histologiske og immunreaktioner karakteristiske for UC og CD. De mest almindeligt anvendte modeller omfatter genetisk modificerede mus (IL-2, IL-10, SAMP / YIT), infektion induceret modeller (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptivforældre modeller overførsel (CD45 + RB Høj, CD62L + celle transfer i SCID mus) og kemisk induceret colitis modeller (dextrannatriumsulfat (DSS), trinitrobenzensulfonsyre sulfonsyre (TNBS), og dinitrobenzen sulfonsyre (DNBS)). På grund af deres lave omkostninger og hurtigt indsættende sygdom, er kemiske modeller betragtes uvurderlig til studiet af forskellige aspekter af IBD. Hver af de kemiske colitis listen over modeller har fordele samt begrænsninger i nogle aspekter af deres kliniske, immunologiske og histopatologiske relevans for IBD. DSS er en af de mest almindelige kemiske metoder, der anvendes til at inducere colitis i gnavere 1. Administration af 3-10% DSS (MW: 42 kDa) i 7-10 dage i drikkevand af mus kan fremkalde symptomer og tegn på colitis, herunder vægttab, diarré med blod, colonforkortning, slimhinde sårdannelse og neutrofil infiltration. Denne model er især nyttig for drug screening undersøgelser, samt at udforske de mekanismer epitelial regenerering, virkningen af medfødte immunitet på slimhinden homeostase, og den rolle, inflammation i forbindelse med fremme tarm dysplasi og adenokarcinom udvikling. Der er dog nogle ulemper til DSS modellen, herunder variation i koncentrationen af DSS er nødvendig for at fremkalde colitis i forskellige dyrefaciliteter samt inkonsekvent vandoptagelse af mus og derfor inkonsekvent eksponering for DSS, hvilket resulterer i variation i den grad, omfang og fordeling af mucosal skade og ulceration i tyktarmen. Alle disse funktioner fører til heterogenitet af resultater og begrænse muligheden for at sammenligne resultater på tværs af studierne frabout forskellige forskergrupper.
Et alternativ til DSS model er hapten-induceret DNBS eller TNBS modeller af colitis. Denne model anvender rektal instillation af slimhinde sensibiliserende agenter DNBS eller TNBS, fortyndet i varierende koncentrationer af ethanol. Administrationen af ethanol er en forudsætning for at bryde colon slimhindebarrieren at tillade indtrængning af DNBS eller TNBS i lamina propria. DNBS / TNBS vil derefter haptenize de lokaliserede colon-og tarm mikrobielle proteiner til at blive immunogen, der udløser værten medfødte og adaptive immunrespons. I almindelighed er denne model er forbundet med svær og til tider blodig diarré, vægttab og tarmvæggen fortykkelse imidlertid symptomer varierer afhængigt af typen gnaver anvendes, såvel som timing, dosering og graden af eksponering for DNBS eller TNBS anvendes i undersøgelsen. Vigtige forskelle mellem rotter og mus bør bemærkes, med fordelene ved lavere omkostninger for køb og bord, samt Lower kropsmasse for faldende omkostninger pr dyr behandling in vivo. Dette skal ses i forhold til en hurtigere og mere alvorligt forløb af colitis hos mus, hvor de mere skrøbelige og responsive dyr hurtigt kan nå frem til en human endpoint.
Den tarmbetændelse første resultater fra ethanol-induceret ødelæggelse af intestinale epitelceller, hvilket fører til øget epitel permeabilitet, mikrobiel indtrængen i slimhinden haptenization af værtsproteiner, alt dette resulterer i infiltrering af neutrofiler, makrofager og Th1 T-lymfocytter i den beskadigede slimhinde. I forhold til DNBS er TNBS betragtes som et farligt kemikalie grundet dens meget oxidative egenskaber, der kan udgøre en risiko for eksplosion ved kontakt med baser, såsom natrium-og kaliumhydroxid. Derfor DNBS er i øjeblikket betragtes som en foretrukken valg af kemikalie løbet TNBS at fremkalde colitis. Hos gnavere DNBS colitis betragtes som en af de mest bekvemme metoder til at studere følgenfløj IBD forbundet modifikatorer på sygdom:
- Depression og genaktivering af colitis: Det har vist sig, at stress, angst og depression i IBD patienter ofte er forbundet med sygdommen tilbagefald. DNBS colitis er en egnet model til at undersøge den rolle, depression og dens konsekvenser for reaktivering af colitis hos mus. Metoden involverer typisk indledende induktion af colitis ved DNBS efterfulgt af opløsningen af colitis ved at lade musene i 6-8 uger. Musene indgives derefter med depression forårsager, såsom reserpin eller olfaktoriske bulbectomy at fremkalde depression efterfulgt af at teste dem for reaktivering af colitis gennem udfordring med en subcolitic dosis DNBS 2.
- Stress og reaktivering af colitis: Stress er en anden almindelig miljømæssig faktor, som har været knyttet til IBD patogenese. Der er en voksende mængde af beviser, der tyder på en stærk sammenhæng mellem kronisk stress og symptomer på UC og CD i gnavers samt i mennesker og ikke-menneskelige primater 3. DNBS colitis er en god model til at studere stress-associeret reaktivering af colitis hos både mus og rotter. Fremgangsmåden anvendes sædvanligvis på en lignende måde som nævnt ovenfor for depression, undtagen i stedet for depression dyrene udsat for stressfaktorer såsom sonisk og tilbageholdenhed stress 4.
- Neurogen inflammation: En række undersøgelser har beskrevet enten forbigående eller permanente ændringer i den enteriske nervesystem (ENS) struktur og funktion, som det ses i vævsprøver fra dyremodeller og fra patienter med IBD. DNBS er en god model til at udforske virkningerne af betændelse på ENS 5. og at studere både noradrenerge og kolinerge nervebaner 6.
- Skade-reparation mekanismer: Under IBD patogenese, værtsafledte skade mediatorer, såsom reaktive oxygenarter (ROS), nitrogenoxid (NO), intercellulært adhæsionsmolekyle 3 (ICAM-3) og P-selectin har alle vist sig at plægge en rolle i tarmen epithelial forstyrrelser. DNBS er en fremragende model til at studere skader forårsaget af op-regulering af disse mediatorer samt reparation mekanismer, der er reguleret ved hjælp af selektive stoffer eller inhibitorer 7,8.
- Transmural inflammation: Ud over de ovennævnte anvendelser af DNBS modellen kan også anvendes til at studere transmural inflammation af tarmen, en klassisk træk fundet i patienter med CD. Begge DNBS og TNBS-induceret colitis er forbundet med betydelig infiltration af lymfocytter i tyktarmens slimhinde gør disse modeller særlig nyttigt at undersøge T-celle-afhængige immunmekanismer.
I sammenligning med DSS model, fordelene ved DNBS og TNBS-induceret colitis omfatte billige, hurtige udvikling af colitis (normalt kræver 1-3 dage for at vise reproducerbar ulceration og inflammation) og konsekvent karkassens den distale colon. Men ulemperne er et krav om enhøjere niveau af teknisk ekspertise, optimering af DNBS / TNBS dosis og behovet for anæstesi til rektal administration.
I denne metodologiske dokument undersøgte vi virkningerne af varierende koncentrationer af n-6 og n-3 polyumættede fedtsyrer på ændring tyktarmens slimhinde-respons på DNBS-induceret colitis i rotter under anvendelse af vegetabilske olier tidselolie (SO) og canolaolie (CO) og fiskeolie (FO). Det er blevet påvist, at n-6 og n-3 fedtsyrer er vigtige mediatorer af tarm inflammatorisk sygdom gennem deres rolle som acyldele af cellemembran phosopholipids 9. I modsætning til den proinflammatoriske potentiale af n-6 fedtsyrer, n-3 fedtsyrer på tilstrækkeligt højt indtag er potentielt kraftige antiinflammatoriske midler. De anti-inflammatoriske virkninger af n-3-fedtsyrer er medieret direkte gennem udskiftning af arachidonsyre som et eicosanoid substrat inhibering arachidonsyremetabolisme og indirekte gennem ændring af proinflammatory genekspression og celle signalering. N-3 fedtsyrer, giver også anledning til resolvins, en familie af anti-inflammatoriske mediatorer. Højt indtag af n-3-fedtsyrer er forbundet med et fald i produktionen af proinflammatoriske eikosanoider, cytokiner, kemokiner, reaktive ilt arter og ekspression af adhæsionsmolekyler. I dette studie blev rotter fodret ad libitum kost identiske i alle næringsstoffer, undtagen fedtsyrer, med en procent energi fra fedt, 20% SO, 20% CO, eller 18% fiskeolie plus 2% tidselolie (FO) 10-11 . Som en procentdel af den daglige energi, SO diæten 15% linolsyre (LA), med <0,06% α-linolensyre (ALA) og ingen eicosapentaensyre (EPA) eller docosahexaensyre (DHA), CO kost havde 4,2 % LA og 1,9% ALA uden EPA og DHA, og FO kost forudsat 1,4% EPA, 4,9% DHA, 0,32% LA, og 0,12% ALA. Tre uger efter indledningen af lipid kost, blev musene administreret intrarektale DNBS eller 50% ethanol og aflivet 5 dage senere. Den inflammatory respons blev vurderet ved vurdering af vægttab, histologiske skader scoringer og væv myeloperoxidaseaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr fag følger dyrepleje retningslinjer, der er skitseret af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of British Columbia.
Procedurerne i denne protokol vil blive beskrevet for både rotter og mus, mens de repræsentative resultater vil blive præsenteret fra Sprague-Dawley rotter.
1.. Fremstilling af DNBS og intrarektal administration
- Til rektal instillation af DNBS i rotter forberede frisk 15-30 mg DNBS/250 pi 50% ethanol. For mus, forberede 2-6 mg DNBS/100 pi 50% ethanol. Bemærk: Optimer den nøjagtige DNBS koncentrationen skal administreres på hvert anlæg. Sprague-Dawley-rotter og C57BL / 6 mus foretrækkes til induktion af DNBS colitis, kan imidlertid anvendes andre mus og rotter stammer. Mus og rotter behandlet kun med 50% ethanol kan anvendes som kontrolgrupper dog givet virkningerne af ethanol er milde eller fraværende, kan man omit inddragelse af denne gruppe for en undersøgelse 12.
- Vedhæft en 1 ml sprøjte til en 19 G kanyle, der har en polyethylenkateter (PE-90 - rotter eller PE-50 - mus) fastgjort til sin afslutning.
- Let bedøver en rotte eller mus hviler på en varmepude (fx ved at administrere 1,5% isofluran via næse kegle skal dyrene stadig have blink og synke reflekser og vise regelmæssig respiration). Påfør tåre gel til øjnene for at undgå øjnene tørrer ud.
- Anvendelse forsigtigt tryk med fingerspidserne til den bageste ende af dyret for at fjerne enhver afføring, som kan være til stede i den distale colon.
- Sæt forsigtigt kateteret intrarektalt, med kateteret nåede cirka 8 cm proksimalt til anus for rotter, eller 3-4 cm for mus. Indsprøjte en lille mængde af opløsningen under indføring af kateteret for at smøre, giver lettere indføring. Bemærk: Hvis nogen der mærkes modstand, mens du indsætter kateteret, ikke fortsætter med at indsætte, da dette kan føre til perforation aftarmvæggen. Fjern kateteret og forsøge at forsigtigt genindsætte igen smøre tyktarmen som proceduren.
- Injicer langsomt 250 (rotter) eller 100 (mus) pi DNBS, eller et tilsvarende volumen eller 50% ethanol for kontrol. Efter indsprøjtning af DNBS placere dyret med hovedet nedad i 90 sekunder for at undgå tab af DNBS.
- Efter DNBS administration fodre dyrene 8% sucrose vand i 0,2% saltvand for at forhindre dehydrering i den første uge.
- Observere omhyggeligt dyrene, med daglig overvågning for vægttab og tegn på dehydrering eller angst for varigheden af forsøget. Bemærk: Vægttab kan hurtigt nærmer CCAC anbefalingerne for det maksimalt tilladte vægttab. Da dette for det meste stammer fra dehydrering, bør vægttab bruges som en indikator for administration Ringer-løsning til at begrænse dehydrering. Sørg for at rådføre sig med anlægget dyrlæge om sundhedsspørgsmål er relevant.
2. Collecting Væv og vurdering Histologisk Skader i DNBS Udfordret Mus
- På det ønskede tidspunkt efter udfordring med DNBS, aflive dyr ved overdosering med isofluran i et bedøvelsesmiddel kammer suppleret med tilstrækkelig ilt. Observere dyret indtil ingen stigende eller faldende af brystet ses og der er ingen mærkbar hjerteslag. Bekræft dyret er blevet aflivet korrekt ved manglende svar til tå knivspids eller berøring af hornhinden, efterfulgt af cervikal dislokation.
- Åbn bughulen og fjerne hele tyktarmen. Åbn tarmen længderetningen; makroskopiske mucosale sår bør observeret ca 5-6 cm proximalt fra den distale ende af tyktarmen hos rotter (2-3 cm i mus). Bemærk: Efter fjernelse af tyktarmen, vurdere makroskopiske skader score, hvis det ønskes. Saml segmenter af colon fra tilsvarende anatomiske placering fra kontroldyr. Bemærk: De personer scoring vævet for makroskopiske skader scoringer børblive blændet til identiteten af behandlingsgrupperne. Score vævssnit ved hjælp af følgende eller lignende kriterier alvorligheden og omfanget af sårdannelse (0-10), summeres med scorer for fravær eller nærvær af diarré (0 eller 1), adhæsioner (0, 1 eller 2) og maksimal colon vægtykkelse i mm 11.
- Saml 0,5 cm sektioner proksimalt stedet for maksimal makroskopisk skader. Snap fryse en 0,5 cm sektion i flydende nitrogen til senere vurdere myeloperoxidase (MPO) aktivitet (et mål for neutrofil infiltration), og placer den anden sektion i 10% neutral bufferet formalin til histologisk analyse. Bemærk: lynfrosset væv for myeloperoxidase-assayet kan opbevares ved -80 ° C i op til 1 måned.
- Lad væv, der indsamles histologisk analyse i trin 2.3 at fastsætte i formalin natten over, og vask derefter med 70% ethanol. Integrer væv i paraffin og skæres til den ønskede tykkelse (3-5 um), pletten med hemotoxylin og eosin (HE) til histologisk scoring. Har to observatører score mindst tre vævssnit fra hvert dyr under et lysmikroskop at bestemme de histologiske skader scores for hver gruppe. Bemærk: De personer scoring af væv til histologiske skader scoringer bør være blindede til identiteten af behandlingsgrupperne. Score vævssnit ved hjælp af følgende eller lignende kriterier: omfang af inflammatorisk celleinfiltration (0 = fraværende, 3 = transmural), tab af mucosal arkitektur (0 = fraværende, 3 = alvorlig), tilstedeværelse eller fravær af kryptabscesser (0-1) og bægercelle depletion (0-3). Bestem histologiske skader score som summen af disse scorer 11.
3. Udførelse Myeloperoxidase (MPO)-analysen på DNBS Udfordret tarmvæv
- Assay MPO aktivitet i de 0,5 cm colon segmenter opnået i trin 2.3. Homogeniseres væv i MPO homogeniseringsbuffer (0,5% hexadecyltrimethyl-ammonium bromid i 50 mM kaliumphosphatpuffer (pH 6,0)) til opnåelse af en 50 mg kolon segment / ml homogeniseringsbuffer suspension.
- Afmål homogeniserede opløsning i 1 ml portioner og centrifugeres ved 4 ° C i 2 minutter ved 10.000 x g.
- Bland 100 pi af hver alikvot med 2,9 ml 50 mM phosphatpuffer (pH 6,0) indeholdende 0,167 mg / ml o-dianisidinedihydrochloride og 0,0005% hydrogenperoxid i en kuvette.
- Måle hastigheden af absorbans med et spektrofotometer ved 460 nm. Bemærk: MPO aktivitet er defineret som den mængde enzym nedbryder 1 pmol / min H 2 O 2 til H 2 O ved stuetemperatur og er udtrykt i enheder pr mg væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udfordring af rotter (Sprague-Dawley) eller mus (C57BL / 6) med DNBS typisk resulterer i forbigående vægttab og diarré, undertiden med blod til stede i afføringen. Faktorer som genetik, kost og tarm mikrobiota kan dog ændre modtagelighed for DNBS induceret colitis. Derfor dyr indgår i forsøgene skal være fra den samme institution, enten afledt lokalt eller bestilles i fra et dyr leverandør. Alle dyr bør overvåges nøje for graden af vægttab og symptomer på angst lidt i løbet af colitis.
Resultaterne præsenteret i figur 1-4 repræsenterer et eksperiment, hvor virkningen af tre kosten olier: tidselolie, canolaolie og fiskeolie på den resulterende sværhedsgraden af DNBS colitis blev vurderet. Statistiske forskelle blandt grupperne blev bestemt ved anvendelse af ANOVA efterfulgt af Tukey post hoc test, ved hjælp af en dataanalyse software program. AP-værdi på <0,05 blev considered betydelig.
Efter intrarektal udfordring med DNBS (20 mg DNBS/250 ml 50% ethanol) blev signifikant vægttab observeret af 48-timers hos rotter suppleret med FO og CO og med 72 timer hos rotter suppleret med SO (P <0,05). Maksimalt vægttab ses på 48 timer i rotter suppleret med FO og ved 72 timer i rotter suppleret med CO og SO. Vægtøgning genoptaget efter 72 timer, og ved 5 dage efter DNBS, FO og SO grupper viser kropsvægt svarende til basisværdier. Kontrol rotter suppleret med kost og udfordret med intrarektal ethanol fortsætter med at tage på i vægt i løbet af de 5 dages studie periode.
Tarm forårsaget af DNBS kan være udbredt, men området for maksimal skade er generelt lokaliseret i de distale 6 cm af colon hos rotter, og de distale 3 cm i mus. Makroskopisk dette kan observeres colon fortykkelse, mucosal ulceration og lejlighedsvis vedhæftning af distal kolon til tilgrænsende organer, såsom blære. På observeres nærmere histologisk vurdering omfattende epitelial skade i nogle områder, der fører til dannelsen af mavesår, immun celle infiltration (overvejende neutrofiler og lymfocytter), kryptitis, slim udtømning, og ødem. Selv om disse histologiske tegn på inflammation og vævsskade er tydelig i alle tre kosten olie suppleret grupper efter udfordring med DNBS, er den mest alvorlige skader ses i saflorolie, efterfulgt af canolaolie gruppe, hvorimod rotter i olie gruppe fisk demonstrere minimal epithelial skade og begrænset infiltration af inflammatoriske celler ind i slimhinden (figur 2).
Forskelle i histologiske skader kan kvantificeres for at muliggøre en bedre sammenligning mellem grupperne. Kriterier der anvendes til at vurdere histologiske skader omfattede omfanget af inflammatoriske celleinfiltrat, tab af slimhinde arkitektur, bæger celledepletering, og tilstedeværelsen af crypt bylder. Vist i figur 3 er de histologiske skader score for de tre kosten oliekoncerner løbet DNBS colitis. Som det ses i H & E-farvede snit i figur 2 saflorolie suppleret gruppe har den største udstrækning af skaden, efterfulgt af canolaolie gruppe, mens olien gruppe fisk viser den mindste mængde af skader.
Omfanget af inflammatoriske celleinfiltrat, især af neutrofiler, kan undersøges yderligere ved at udføre en myeloperoxidase (MPO) aktivitet analyse. MPO betragtes som en markør for inflammation, da det er et enzym, der findes i granuler af neutrofile granulocytter og andre celler af myeloid herkomst. Vurdering af MPO aktivitet i rotte koloner på dag 5 post-DNBS eksponering afslører en stigning i aktiviteten i alle tre grupper (Figur 4). Observeres største MPO aktivitet i saflorolie, efterfulgt af canolaolie gruppe, mens den laveste MPO aktivitet ses ifiskeolie gruppe, svarende til det histologiske skader scorer vurderes i figur 3.
Figur 1. Ændringer i kropsvægt (% af baseline) efter intrarektal administration af 50% ethanol (kontrol) eller dinitrobenzen sulfonsyre (DNBS) hos voksne Sprague-Dawley (250-500 g) fodret SO, CO, eller FO. Rotterne derefter overvåges for tab af kropsvægt fra dag 1 til dag 5 efter behandling. Den procentvise tab af kropsvægt er plottet mod dage efter DNBS behandling. Værdier er middel ± SEM, n = 5 / gruppe. Når sammenlignet med ikke-DNBS behandlede modstykker rotter fodret med CO og FO havde en signifikant reduktion i deres oprindelige kropsvægt så tidligt som dag 1 indlæg DNBS behandling, mens alle de tre grupper af rotter på dag 3 havde væsentlig vægttab i forhold til baseline vægt (P <0,01). Alle colitis grupper demonstrere vægtøgning efter 72 timer, med vægt vender tilbage til baseline i FO og så træt grupper. Rotter i ethanol kontrolgrupperne demonstrere vægtøgning løbet af de 5 dages studie periode. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Histologisk udseende repræsentative H & E farvet colon vævssnit 5 dage efter intrarektal administration af 50% ethanol (CTL) eller DNBS til voksne hunrotter fodret SO, CO, eller FO. Vævet opsamles i 10% formalin og mulighed for at fastsætte et minimum af 24 timer efterfulgt af vævssektionering og HE farvning. Denvævssnit fra rotter fodret SO og CO demonstrere væsentlige forstyrrelser af epitelial integritet med varierende grad af epitelial skade, krypt droppe ud, sårdannelse og transmural immun celle infiltration, med mere markante ændringer set med SO. I CO fodret mus ses tegn på epitelial regenerering og tilbagelevering. I modsætning hertil rotter fodret med FO opretholdt epithelial integritet og havde begrænset infiltration af inflammatoriske celler begrænset til lamina propria. (M-slimhinde, SM-sub-mucosa og U-ulceration, original forstørrelse 100X, skala bar: 100 mM). Klik her for at se større billede .
Figur 3. Histologisk skade score af colonvæv 5 dage omfter intrarektal administration af 50% ethanol (klar bar) eller DNBS (solid bar) til voksne hunrotter fodret SO, CO, eller FO. Vævssnit scoret af en erfaren efterforsker, blindet for de behandlinger, ved hjælp af et sæt kriterier baseret på histologiske skader. De kriterier, der anvendes til denne undersøgelse indeholder: inflammatorisk celle infiltration (0 = fraværende, 3 = transmural), tab af slimhinde integritet (0 = fraværende, 3 = alvorlig), krypt abscesdannelse (0 = fraværende, 1 = til stede) bæger cellereduktion (0 = fraværende, 3 = høj). Den histologiske skader score bestemmes som en sum af opnåede point ved at score mindst tre vævssnit fra hvert dyr. Resultaterne viser tydeligt en reduceret histologiske skader i FO fodret rotter i forhold til SO og CO fodret rotter. Værdier er middel ± SEM, n = 5 / gruppe. Sammenlignet med de respektive ethanol kontroller er DNBS administration forbundet med en betydelig stigning i skader score (P <0,05); colitis grupper med forskellige symboler er signifikant forskellige (P <;. 0,01) Klik her for at se større billede .
Figur 4.. MPO-aktivitet i colonvæv 5 dage efter intrarektal administration af 50% ethanol (åben stribe) eller DNBS (udfyldt søjle) til voksne hunrotter fodret SO, CO eller FO. Inflammerede colon væv lynfrosset i flydende nitrogen og analyseret for myeloperoxidaseaktivitet , som et indeks for granulocytinfiltration. Colitic rotter fodret FO show reducerede MPO aktivitet sammenlignet med SO og CO Værdier er middel ± SEM, n = 5 / gruppe. Sammenlignet med de respektive ethanol kontroller er DNBS administration forbundet med en betydelig stigning i MPO-aktivitet (p <0,001), colitis grupper med forskellige symboler er significantly forskellige (P <0,05). Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den DNBS model beskrives i denne protokol er en værdifuld, billig og reproducerbar colitis model, der kan anvendes til at undersøge forskellige aspekter af IBD. Når det administreres intrarektalt til rotter eller mus, DNBS inducerer en betydelig grad af inflammation og vævsskade i tyktarmen, der ligner menneskets Crohns sygdom i form af dens forskellige histologiske funktioner, herunder transmural infiltration af polymorfonukleære celler og fremherskende NF-KB-afhængige Th1 aktivering.
Denne model er blevet anvendt til at undersøge forskellige faktorer menes at have indflydelse på IBD såsom stress, depression og kost samt enteriske nervesystem engagement, skade-reparation mekanismer, transmural inflammation og prækliniske behandlinger. Den DNBS modellen er også et egnet alternativ til TNBS-induceret inflammation i mus og rotter og tilbyder et billigere alternativ til andre almindeligt anvendte kemiske modeller af colitis såsom DSS. De skridt, der er skitseret i denne protokol tillader en at kunne udføre denne model.
I overensstemmelse med andre eksperimentelle modeller for colitis 13-16, den aktuelle undersøgelse styrker varierende virkninger af fedt på intestinale mucosale immunresponser, hvor høj indtagelse af EPA og DHA, der forbruges før og efter DNBS eksponering dæmpes, mens højt indtag af ARA med minimal n -3 fedtsyrer forværrer colitis. De gavnlige virkninger af kosten n-3 fedtsyrer observeret i denne undersøgelse skyldes delvis til n-3 fedtsyrer effektivt sænker væv phospholipid ARA både ved at hæmme syntesen af ARA fra LA og ved at erstatte ARA med EPA og DHA. Denne ændring forskyder fedtsyresubstrat rådighed for frigivelse og efterfølgende eicosanoid syntese mod et mindre proinflammatoriske miljø. I modsætning hertil er den højt indtag af n-6 fedtsyrer er forbundet med en høj colon ARA med efterfølgende syntese af proinflammatoriske mediatorer, der forværrer respons slimhindeimmunsystemet. I keeping med vores seneste undersøgelse i Citrobacter rodentium induceret colitis, rotter fodret med rapsolie med mindre ARA end tidselolie, men med n-3 ALA og ingen EPA eller DHA havde en mellemliggende inflammatorisk respons 16.
Der er flere kritiske trin, der kan få indflydelse på en vellykket gennemførelse af DNBS modellen. Forskellige undersøgelser har anvendt forskellige koncentrationer af DNBS spænder 3-6 mg / mus eller 15-30 mg / rotte til at etablere colitis. Derfor er det vigtigt for de enkelte efterforskere til at optimere doseringen af DNBS til deres studier, da optimale doser kan variere fra et dyr facilitet til den anden. Det er også vigtigt at bemærke, at koncentrationen af DNBS vil variere alt efter type og art af dyr, som en efterforsker bruger (Ex: visse stammer kan være mere modtagelige og andre mere modstandsdygtige over for DNBS). Der bør udvises omhu for at sikre, at koncentrationen af DNBS ikke er for høj, da dette kan forårsage hurtig død af dyr resulting fra tarmperforation og sepsis. Et andet afgørende skridt til at bruge denne model er at udvikle passende metode til intrarektal kateteret i den distale colon af dyret. Tilstedeværelsen af afføring i tyktarmen, kan forhindre tilstrækkelig indføring af kateteret under instillation. For at undgå dette, skal du forsigtigt lægge pres på den bageste ende af anus let bedøvede mus for at fjerne enhver afføring i den distale colon / rektum. Det anbefales at indsætte katetret ca 3-4 cm fra anus, selv om det kan udvides til maksimalt 6-8 cm i rotter indtil milt bøjning (en skarp sving mellem tværgående og nedadgående tyktarm) 7.. Det er vigtigt at bemærke, at under instillation procedure smøring af kateteret ved at injicere DNBS / ethanol i små mængder vil gøre det lettere indføring af kateteret. For at undgå retrograd refluks af DNBS ud af anus, er det afgørende at holde dyrene i en head-down position i 90 sekunder eller alternativtmus kan holdes i 15 minutter i Trendelenburg-position (rygleje, hvor fødderne er placeret højere end hovedet af 15-30 °).
Væv kan afhentes på udvalgte tidspunkter, afhængigt af interesser investigator og hvorvidt undersøgelsen fokuserer på akut eller kronisk inflammation. Desuden kan vævene også anvendes til at studere den intestinale ENS og medfødte og adaptive immunsystem. Men det er vigtigt at sikre, at væv er korrekt samplet. Det anbefales at opsamle væv i en rigelig mængde af 10% formalin i en 5 ml hætteglas i modsætning til mindre volumen hætteglas for at sikre korrekt fiksering. Passende fiksering af prøver er en nøgle til at studere både den histopatologiske skader og visualisering af target-molekyler i væv af H & E og immunfarvning, hhv. Histologisk scoring af væv skal udføres af erfarne personer, der er blinde for de eksperimentelle betingelser, ved hjælp af faste kriterier, som than individuel investigator 11,17. Myeloperoxidase (MPO) tjener som en god markør for inflammation, vævsskade og neutrofil infiltration i mave-tarm-væv 11. For at udføre MPO analyser, foreslås det at snap fryse væv i flydende nitrogen og på dagen for analyse, anbefales det at arbejde med frisk tilberedte buffere og løsninger til at opnå de bedste og mest præcise resultater. Denne model kan også anvendes til at undersøge inflammatoriske celler, der infiltrerer tarmen, de mekanismer, der er involveret i kemotaxi og transmigration af inflammatoriske celler og de forskellige veje, der er involveret i aktivering og frigivelsen af andre proinflammatoriske mediatorer involveret i vævsskade samt mediatorer involveret i modulering den inflammatoriske reaktion og vævsreparation.
De kliniske ulemper aktuelt set med brug af immunosuppressive lægemidler eller målrette en proinflammatoriske cytokin, såsom TNF-α bør tilskynde Investigtørerne udvikle bedre terapeutiske strategier til at håndtere patienter med IBD. Modeller, såsom DNBS model giver efterforskerne til at øge vores forståelse af patogenesen af IBD, potentielt at identificere nye terapeutiske mål og udvikle / forbedre strategier til at kontrollere inflammation gennem brug af nye inflammatoriske veje og nye behandlingsformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af driftstilskud til KJ fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (NSERC) og Crohns og Colitis Foundation of Canada (CCFC). VM er understøttet af en CFRI Fellowship og GB en kandidat studentship fra den canadiske Institutes for Health Research (CIHR). BAV er en Børn med tarm-og leversygdomme Foundation (CHILD) formand for Pediatric IBD Forskning og Canada Research Chair i Pediatric Gastroenterology og KJ er en ledende kliniker Scientist støttet af barnet og Børne-og Familie Research Institute (CFRI) Lægens Forskere Award Program , University of British Columbia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Biotechnol, J. . B. iomed , (2012).
- Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression. Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).
- Reber, S. Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).
- Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis. Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).
- Boyer, L., et al. Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis. Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).
- Saunders, P., et al. Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat. Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).
- Cuzzocrea, S., et al. Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat. Gut. 48 (4), 478-488 (2001).
- Cuzzocrea, S., et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).
- Innis, S., Jacobson, K. Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease. Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).
- Innis, S. M., de La Presa Owens, S. Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain. J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).
- Jacobson, K. Mundra H.,Innis S.M. Intestinal responsiveness to experimental colitis in young rats is altered by maternal diet. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 13-20 (2005).
- Sanovic, S., Lamb, D. P., Blennerhassett, M. G. Damage to the enteric nervous system in experimentalcolitis. Am. J. Pathol. 155 (4), 1051-107 (1999).
- Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis. Gut. 31, 539-544 (1990).
- N-3 fatty acid-rich diet prevents early response of interleukin-6 elevation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced enteritis. Int. J. Mol. Med. Andoh, A., Tsujikawa, T., Ishizuka, I., Araki, Y., Sasaki, M., Koyama, S., Fujiyama, Y. 12, 721-725 (2003).
- Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis. Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).
- Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).
- Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).
