Summary
DNBS / TNBS индуцированной колит предлагает альтернативу и недорогой метод для изучения патобиологии воспалительного заболевания кишечника. Протокол рассматриваются в настоящем документе излагаются успешное применение DNBS чтобы вызвать колит у мышей и крыс и позволяет тщательно изучить хост-опосредованной кишечные реакции.
Abstract
Воспалительные заболевания кишечника (IBD), в том числе болезни Крона и язвенный колит, уже давно ассоциируется с генетической основе, а в последнее время иммунного ответа к микробным и факторов окружающей среды. Динитробензол кислоту (DNBS)-индуцированной колит позволяет изучать патогенез IBD связанных экологических триггеров, таких как стресс и питание, последствий потенциальных методов лечения, а также механизмов, лежащих воспаление кишечника и повреждения слизистой. В данной работе мы исследовали эффекты биологически активных н-3 и н-6 жирных кислот на толстой слизистой воспалительного ответа на DNBS-индуцированного колита у крыс. Все крыс кормили идентичные диет за исключением различных типов жирных кислот [сафлоровое масло (SO), масло канолы (CO), или рыбий жир (FO)] в течение трех недель перед воздействием Интраректальное DNBS. Контрольные крысы, приведенные интраректального этанола продолжали набирать вес в течение 5-дневного исследования, в то время как, DNBS-обработанных крыс кормили липидов диеты все Losт вес с FO и СО кормили крыс демонстрируя значительную потерю веса на 48 ч и крыс кормили SO на 72 часа. Увеличение веса возобновлена после 72 часов после DNBS, и на 5 дней сообщению DNBS, группа FO имели более высокий вес тела, чем SO или CO группы. Кишечное разделы собраны 5 дней после DNBS обращения показал фокусное язвы, склеп разрушение, истощение кубок клеток и слизистой оболочки проникновение как острых, так и хронических воспалительных клеток, отличающихся по степени тяжести среди диетических групп. ТАК подается группа показала самый серьезный ущерб, за которой следует CO, и FO кормили группы, которые показали самый мягкий степень повреждения тканей. Точно так же, толстой миелопероксидаза (МРО), маркера активности нейтрофилов была значительно выше в SO последующим СО кормили крыс, с FO кормили крыс, имеющих значительно более низкую активность MPO. Эти результаты показывают, использование DNBS-индуцированного колита, как указано в этом протоколе, чтобы определить влияние диеты в патогенезе IBD.
Introduction
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) характеризуется хроническим воспалением рецидивирующего в желудочно-кишечный тракта (ЖКТ), в результате чего симптомы диареи, потеря веса, и боли в животе. Язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD) являются двумя основными формами IBD, и можно отличить по месту нахождения воспаления в желудочно-кишечном тракте. У пациентов UC, воспаление обычно включает в себя прямую кишку и простирается непрерывно до толстой кишки для разной степени влияющих только поверхностное слизистую оболочку. В противоположность этому, компакт-диск может повлиять на любую часть желудочно-кишечного тракта, хотя это преимущественно поражает подвздошной кишки и слепой кишки. CD часто проявляется как трансмуральный воспаление часто связано с гранулем и приводит к сужение (fibrostenotic) и / или (проникающий) fistulizing заболевание. Хотя этиология IBD остается неуловимым, он хорошо принято считать, что IBD является многофакторной, включая взаимодействия между хозяевами иммунную систему, генетической предрасположенности и несет ответственностьSES экологических и микробных факторов.
На сегодняшний день различные модели IBD были предложены, что отображать различные клинические, гистологические и иммунные реакции, характерные для UC и CD. Наиболее часто используемые модели включают генетически модифицированных мышей (IL-2, IL-10, SAMP / YIT), инфекции, вызванные моделей (Citrobacter rodentium, сальмонелла Typhimurium), усыновители модели перевод (CD45 + РБ Высокие, передачи сотового CD62L + в SCID мышей) и химически индуцированные модели колит (декстран сульфат натрия (DSS), тринитробензолсульфоновой кислота (ТНБ), и Динитробензол сульфокислоты (DNBS)). Благодаря их низкой стоимости и быстрого начала заболевания, химические модели считаются бесценными для изучения различных аспектов IBD. Каждый из химических моделей колит перечисленных имеет свои преимущества, а также недостатки в некоторых аспектах их клинического, иммунологического и гистологической отношение к IBD. DSS является одним из наиболее распространенных методов, используемых химических индуцировать палочкитис у грызунов 1. Введение 3-10% DSS (MW: 42 кДа) в течение 7-10 дней в питьевой воде мышей может вызывать симптомы и признаки колита в том числе потеря веса, понос с кровью, толстой укорочения, слизистой оболочки язв и инфильтрации нейтрофилов. Эта модель особенно полезна для скрининга лекарственных средств исследований, а также изучения механизмов регенерации эпителия, влияние врожденного иммунитета на слизистой гомеостаза, а также роль воспаления в продвижении кишечника дисплазии и развития аденокарциномы. Существуют, однако, некоторые недостатки модели DSS, в том числе изменения в концентрации DSS, необходимой, чтобы вызвать колит в различных объектов животного, а также поглощения противоречивы воды по мышей и, таким образом, несовместимым воздействия DSS, в результате чего изменения в степени, степени и распределение поражения слизистой и язв в толстой кишке. Все эти особенности приводят к неоднородности результатов и ограничить возможность сравнить результаты различных исследований фрOM различные исследовательские группы.
Альтернативой модели DSS является гаптен-индуцированной DNBS или TNBS модели колита. Эта модель использует прямой кишки инстилляцию слизистой сенсибилизации агенты DNBS или TNBS, разбавленного в различных концентрациях этанола. Администрация этанола является необходимым условием, чтобы сломать барьер слизистой оболочки толстой, чтобы позволить проникновение DNBS или TNBS в собственной пластинке. DNBS / TNBS будет haptenize локализованные толстой и кишки микробные белки стать иммуногенны, тем самым вызывая хозяина врожденного и адаптивного иммунного ответа. В общем, эта модель связана с тяжелой и иногда кровавый понос, потеря веса и желудочно-кишечном утолщение стенки однако симптомы варьируются в зависимости от типа используемого грызунов, а также сроков, дозы и степени воздействия на DNBS или TNBS используется в Исследование. Важные различия между крысами и мышами Следует отметить, с преимуществами низкой стоимости на покупку и питание, а также Лоуг массы тела для уменьшения на-животного расходы на лечение в естественных условиях. Это должно быть установлено против более быстрого и тяжелого течения колита у мышей, где более хрупкие и чувствительные животные могут быстро добраться до гуманного конечную точку.
Воспаление кишечника первоначально приводит из этанола, индуцированной повреждением эпителиальных клеток кишечника, что приводит к увеличению проницаемости эпителия, микробного проникновения в слизистую оболочку, haptenization принимающих белков, все это приводит к инфильтрации нейтрофилов, макрофагов и Т-лимфоцитов Th1 в поврежденную слизистую оболочку. По сравнению с DNBS, TNBS рассматривается как опасного химического вещества в связи с его высокой окислительной свойств, которые могут представлять опасность взрыва при контакте с основаниями, такими как натрий и гидроксида калия. Поэтому DNBS в настоящее время рассматривается в качестве предпочтительного выбора химических над TNBS индуцировать колит. У грызунов, DNBS колит рассматривается как один из самых удобных способов для изучения FOLLOкрыло IBD связано модификаторы болезни:
- Депрессия и реактивация колита: Было показано, что стресс, беспокойство и депрессия у пациентов с IBD часто связаны с рецидива заболевания. DNBS колит является подходящей моделью для изучения роли депрессии и ее последствий на реактивации колита у мышей. Метод обычно включает первоначальный индукцию колита по DNBS, а затем постановлением колит, оставив мышей в течение 6-8 недель. Затем мышей вводили с депрессией в результате чего агентов, таких как резерпин или обонятельной bulbectomy, чтобы вызвать депрессию с последующим их тестирования для реактивации колита через вызов с subcolitic дозе DNBS 2.
- Стресс и реактивация колита: Стресс является еще одним распространенным экологический фактор, что было связано с IBD патогенеза. Существует все больше доказательств, что предполагает тесную связь между хроническим стрессом и появления симптомов UC и CD в грызунас, а также у человека и приматов 3. DNBS колит является хорошей моделью для изучения стресса связаны реактивации колита у мышей и крыс. Метод обычно используется таким же образом, как указано выше, за исключением депрессии вместо депрессии, животные подвергаются воздействию стрессовых таких как звуковых и удерживающей стресса 4.
- Нейрогенного воспаления: Ряд исследований описали либо переходные или постоянные изменения в кишечной нервной системы (ENS) структуры и функции, как видно в образцах ткани от животных моделях и от пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника. DNBS является хорошей моделью для изучения влияния воспаления на ENS 5 и изучать как норадренергическую и холинергические нервные пути 6.
- Травма-ремонтные механизмы: Во IBD патогенеза, принимающие полученных травм посредники, такие как активные формы кислорода (АФК), оксида азота (NO), межклеточной адгезии 3 (ICAM-3) и P-селектина все было показано на стр.заложить роль в кишечного эпителия нарушения. DNBS превосходная модель для изучения повреждений, вызванных положительную регуляцию этих посредников, а также механизмов репарации, которые регулируются с помощью селективных препаратов или ингибиторов 7,8.
- Трансмуральное воспаление: В дополнение к упомянутым выше применений DNBS, модель может также применяться для изучения трансмуральный воспаление кишечника, классический функцию у больных с компакт-диска. Оба DNBS и ТНБ-индуцированные колит связаны со значительным инфильтрации лимфоцитов, в слизистой оболочки толстой кишки решений эти модели особенно полезны для изучения Т-клеточные зависимые иммунные механизмы.
По сравнению с моделью DSS, преимущества и DNBS TNBS-индуцированных колита включают низкую стоимость, быстрое развитие колита (обычно требует 1-3 дней, чтобы показать воспроизводимый язвы и воспаления) и последовательного локализованное повреждение дистального отдела толстой кишки. Однако недостатки являются необходимым условием дляболее высокий уровень технических знаний, оптимизации дозы DNBS / TNBS, и потребность в анестезии для ректального введения.
В этой методологической работе изучали эффекты различных концентраций п-6 и омега-3 полиненасыщенных жирных кислот на изменения ответа толстой слизистой к DNBS-индуцированного колита у крыс с помощью растительных масел сафлоровое масло (ТАК) и рапсовое масло (СО) , и рыбий жир (FO). Было показано, что н-6 и омега-3 жирные кислоты являются важными медиаторами воспалительных заболеваний кишечника через их роли в качестве ацильными группами клеточных мембран phosopholipids 9. В отличие от провоспалительного потенциала н-6 жирных кислот, п-3 жирных кислот при достаточно высоким потреблением потенциально сильными противовоспалительными агентами. Противовоспалительные действия п-3 жирных кислот опосредованы непосредственно путем замены арахидоновой кислоты в качестве субстрата эйкозаноидов, ингибирование метаболизма арахидоновой кислоты и косвенно через изменение proinflammatory экспрессии генов и клеточной сигнализации. N-3 жирных кислот также привести к Resolvins, семейство противовоспалительных медиаторов. Высокое потребление п-3 жирных кислот связано со снижением продукции провоспалительных эйкозаноидов, цитокинов, хемокинов, активных форм кислорода и экспрессии молекул адгезии. В этом исследовании крыс кормили вволю диеты одинаковы во всех питательных веществ за исключением жирных кислот, с как процент энергии из жира, 20%, так, 20% CO, 18% или рыбий жир плюс 2% сафлорового масла (FO) 10-11 . В процентах от суточной энергии, SO диета при условии, 15% линолевой кислоты (LA), с <0,06% α-линоленовой кислоты (АЛК) и не эйкозапентаеновой кислоты (EPA) или докозагексаеновой кислоты (DHA), CO диета была 4,2 % LA и 1,9% ALA, не EPA или DHA, и диета FO условии 1,4% EPA, 4,9% DHA, 0,32% LA, и 0,12% ALA. Через три недели после начала диеты липидных мышей вводили Интраректальное DNBS или 50% этанола и умерщвляли через 5 дней. Влиянammatory ответ оценивали по оценке потери веса, оценки гистологических повреждений и тканевой активности миелопероксидазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры, связанные с предметов животных следовать рекомендациям по уходу за животными, изложенные в уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) при Университете Британской Колумбии по.
Процедуры, упомянутые в данном протоколе будут описаны для обеих крыс и мышей, в то время как репрезентативные результаты будут представлены от Sprague-Dawley крыс.
1. Подготовка DNBS и интраректального введения
- Для ректального закапывания DNBS у крыс, недавно готовить 15-30 мг DNBS/250 мкл 50% этанола. Для мышей, готовить 2-6 мг DNBS/100 мкл 50% этанола. Примечание: Оптимизация точную концентрацию DNBS для введения на каждом объекте. Самцов крыс Sprague-Dawley и мыши C57BL / 6, являются предпочтительными для индукции колита DNBS, однако другие мыши и крысы штаммы могут быть использованы. Мыши и крысы, обработанные только с 50%-ным этанолом можно использовать в качестве контрольных групп, однако, данный эффект этанола мягкая или отсутствует, можно Омит включение этой группы для исследования 12.
- Присоединить 1 мл шприц с иглой 19 G, который имеет полиэтиленовый катетер (РЕ-90 - крысы, или PE-50 - мыши), прикрепленный к его концу.
- Слегка обезболить крыса или мышь опираясь на грелку (например, путем введения 1,5% изофлуран через носовой конус, животные все равно должны иметь мигать и глотательные рефлексы и отображения регулярное дыхание). Применить слезоточивый гель для своих глаз, чтобы избежать глаза высыхания.
- Осторожно применять давление с пальцев на заднем конце животного, чтобы удалить любой стул, который может присутствовать в дистальном отделе толстой кишки.
- Аккуратно вставьте катетер интраректально, с катетером, достигнув примерно 8 см проксимальнее ануса для крыс, или 3-4 см для мышей. Введите небольшое количество раствора при вставке катетер для смазки, что облегчает введение. Примечание: Если ощущается сопротивление во время установки катетера, не продолжайте вставить так как это может привести к перфорациикишечной стенки. Снимите катетер и попытаться аккуратно вставьте снова смазки двоеточие как продолжить.
- Медленно введите 250 (крысы) или 100 (мышей) мкл DNBS или равный объем или 50% этанола для элементов управления. После впрыскивания DNBS, поместите животное вниз головой на 90 секунд, чтобы избежать потери DNBS.
- После введения DNBS, кормить животных 8% сахарозы воду в 0,2% физиологическом растворе, чтобы предотвратить обезвоживание в течение первой недели.
- Тщательно наблюдать за животными, с ежедневного мониторинга для похудения и признаков обезвоживания или бедствия в течение всего срока эксперимента. Примечание: Потеря веса может быстро подойти к CCAC рекомендации максимально допустимой потере веса. Так как это в основном происходит от обезвоживания, потеря веса должна быть использована в качестве индикатора для введения раствора Рингера с лактатом ограничить обезвоживание. Пожалуйста, не забудьте проконсультироваться с объектом, ветеринара по вопросам здравоохранения в зависимости от обстоятельств.
2. Колорадоllecting тканей и оценка гистологической Урон в DNBS зараженных мышей
- В нужной точке времени после заражения DNBS, усыпить животных путем передозировки изофлураном в анестезирующего камере с добавлением достаточного количества кислорода. Соблюдайте животное, пока не растет или падает в груди не видно и нет ощутимой сердцебиение. Подтвердите животное было правильно эвтаназии отсутствие ответа до ног крайнем случае или прикосновения к роговице, а затем путем смещения шейных позвонков.
- Откройте брюшную полость и удалить весь толстый кишечник. Открытый кишечник продольно; макроскопические язвы слизистой оболочки должны быть соблюдены примерно 5-6 см проксимально от дистального конца толстой кишки у крыс (2-3 см у мышей). Примечание: После удаления толстой кишки при желании оценить баллы макроскопических повреждений. Сбор сегменты толстой кишки от соответствующих анатомическое расположение от контрольных животных. Примечание: Лица, забивая ткани для оценки макроскопических ущерб долженбыть ослеплены к личности группах лечения. Оценка срезах тканей с использованием следующих или аналогичные критерии: степень и степень изъязвления (0-10), суммируется с баллов за отсутствие или наличие диареи (0 или 1), спаек (0, 1, или 2) и максимальной толстой толщиной стенки в миллиметрах 11.
- Сбор 0,5 см проксимально по отношению к секции участка максимального макроскопического повреждения. Привязать заморозить один 0,5 см раздел в жидком азоте, чтобы позже оценить миелопероксидазу (МПО) деятельности (мера инфильтрации нейтрофилов), и поместить в другую секцию в 10% нейтральном буферном растворе формалина для гистологического анализа. Примечание: замораживали тканей для миелопероксидаза анализ может храниться при -80 ° С в течение 1 месяца.
- Разрешить ткани, собранные для гистологического анализа на этапе 2.3 исправить в формалине в течение ночи, а затем вымыть с 70% этанола. Вставить тканей в парафин и обрезать до нужного толщины (3-5 мкм), пятно с hemotoxylin и эозином (HE) для гистологического скоринга. Есть два наблюдателя набрать хотя бы три срезах тканей от каждого животного под световым микроскопом, чтобы определить баллы гистологические повреждения для каждой группы. Примечание: Лица, забивая ткани для оценки гистологических повреждений должны быть ослеплены к личности группах лечения. Оценка срезах тканей с использованием следующих критериев или аналогичные: Объем инфильтрата воспалительных клеток (0 = отсутствует, 3 = трансмуральный), утрата архитектуры слизистой оболочки (0 = отсутствует, 3 = тяжелой), наличие или отсутствие крипт абсцессов (0-1) , и кубок истощение клеток (0-3). Определите счет гистологического повреждения в виде суммы этих баллов 11.
3. Выполнение миелопероксидазы (MPO) Анализ на DNBS Challenged кишечной ткани
- Анализ МПО активность в см толстой сегментов 0,5, полученных на стадии 2.3. Однородный ткани в MPO буфера гомогенизации (0,5% hexadecyltrimethyl-бромид в 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,0)) с получением 50 мг толстой кишки segmeNT / мл гомогенизации буфера подвески.
- Аликвотировать гомогенизированного раствора в 1 мл порции и центрифуге при 4 ° С в течение 2 мин при 10000 х г.
- Смешайте 100 мкл каждой аликвоты с 2,9 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 6,0), содержащим 0,167 мг / мл о-dianisidinedihydrochloride и 0,0005% пероксида водорода в кювете.
- Измеряют скорость абсорбции с использованием спектрофотометра при 460 нм. Примечание: МРО-активности определяется как количество фермента, разрушающих 1 мкмоль / мин H 2 O 2 в H 2 O при комнатной температуре и выражается в единицах на мг ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вызов крыс (Sprague-Dawley) или мышей (C57BL / 6) с DNBS обычно приводит к временной потере веса и диареи, иногда с настоящее крови в стуле. Тем не менее, такие факторы, как генетика, диеты и кишечной микрофлоры могут изменять восприимчивость к DNBS индуцированного колита. Таким образом, животные включены в экспериментах должно быть от того же учебного заведения, либо получены на месте или заказать в от одного поставщика животных. Все животные должны быть тщательно проверены на соискание ученой степени потери веса и симптомов дистресса пострадали во время колита.
Результаты, представленные на рисунках 1-4 представляют эксперимент, в котором действия трех диетических масел: были оценены сафлоровое масло, масло канолы, и рыба на нефть на полученной тяжести DNBS колита. Статистические различия между группами были определены с использованием ANOVA с последующим тестом постфактум Тьюки, используя программное обеспечение для анализа данных. Значение AP <0,05 ПОСЛУЖИТЬИСТОЧНИКОМ значительным.
После заражения интраректального DNBS (20 мг DNBS/250 мкл 50% этанола), значительная потеря веса наблюдалось на 48-ч у крыс с добавлением FO и СО и 72 ч у крыс с добавлением SO (P <0,05). Максимальная потеря веса рассматривается через 48 часов у крыс с добавлением FO и 72 ч у крыс с добавлением CO и SO. Увеличение веса возобновлена после 72 часов, и на 5 дней сообщению DNBS, FO и так групп показывают, вес тела, похожие на исходных значений. Контрольные крысы дополненные с диетами и возможностями с интраректального этанола продолжают набирать вес в течение 5-дневного периода исследования.
Кишечного повреждения, вызванные DNBS может быть широко распространены, однако, область максимального повреждения, как правило, локализованы в дистальных 6 см толстой кишки у крыс, и дистальные 3 см в мышах. Макроскопически это можно наблюдать, как толстой утолщение стенки, слизистой оболочки язв, и иногда адгезии р-нтолстой кишки др. в соседних органах, таких как мочевой пузырь. На ближе гистологическое оценка, обширные повреждения эпителия, в некоторых областях, приводящих к образованию язв, инфильтрации иммунных клеток (преимущественно нейтрофилов и лимфоцитов), криптит, истощение слизи и отек наблюдается. Хотя эти гистологические признаки воспаления и повреждения ткани очевидны во всех трех пищевых нефти дополнена групп на вызов с DNBS, наиболее серьезное повреждение видно в группе масла сафлора, с последующим группы масла канолы, тогда как крысы в группе рыбьего жира демонстрируют минимальное повреждение эпителиальных и ограниченное инфильтрация воспалительных клеток в слизистой оболочке (рис. 2).
Различия в гистологической повреждения может быть определена количественно, чтобы для лучшего сравнения между группами. Критерии, используемые для оценки гистологических повреждений включены степень инфильтрата воспалительных клеток, утрата архитектуры слизистой оболочки, истощение бокаловидных клеток и присутствие CRYPт абсцессы. Показанный на рисунке 3 являются оценки гистологические повреждения за три диетические группы нефтяных во DNBS колита. Как видно в H & E окрашенных срезов на рисунке 2, масло дополнить группа сафлоровое имеет наибольшую степень повреждения, а затем нефтяной группы рапса, в то время как группа рыбий жир показать наименьшее количество повреждений.
Степень воспалительных клеток инфильтрата, особенно нейтрофилов, может быть дополнительно изучена выполнения миелопероксидаза (МПО) анализа активности. MPO считают маркером воспалительного процесса, так как это фермент, найденный в гранулах нейтрофильных гранулоцитов и других клеток миелоидного происхождения. Оценка МРО-активности у крыс двоеточия в день 5 после DNBS воздействия показывает увеличение активности во всех трех группах (рис. 4). Наибольшее MPO активность наблюдается в группе масла сафлора, с последующим группы масла канолы, а самый низкий MPO активность наблюдается вгруппа рыбий жир, соответствующие оценки гистологических повреждений начисленных на рисунке 3.
Рисунок 1. Изменения в массе тела (в% от исходного уровня) следующие интраректального введения 50% этанола (контроль) или динитробензол сульфоновой кислоты (DNBS) в взрослых самок Sprague-Dawley крыс (250-500 г) кормили SO, CO, или FO. Крыс затем мониторинг за потерю массы тела от 1 дня до дня 5 после лечения. Процент потери массы тела представлено в зависимости от дней после обработки DNBS. Значения средства ± SEM, п = 5 / группа. По сравнению с не-DNBS лечение коллег, у крыс с СО и FO было значительное снижение их первоначального веса тела уже в день 1 обработки после DNBS тогда как на 3-й день все три группы крыс был сигnificant потери веса по сравнению с исходной массы (Р <0,01). Все колит группы демонстрируют увеличение веса после 72 часов, с весом возвращения к исходному уровню в FO и так надоело группы. Крысы в контрольных этанол групп демонстрируют увеличение веса по сравнению с 5-дневного периода исследования. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Гистологическое появление представительных H & E окрашенных срезов ободочной кишки ткани через 5 дней после интраректального введения 50% этанола (CTL) или DNBS до взрослых самок крыс, которых кормили SO, CO, или FO. Ткань собирали в 10% формалине и позволило зафиксировать в течение как минимум из 24 часов с последующим ткани срезов и Его окрашивания.ткани сечения из крыс, которых кормили SO и СО демонстрируют значительное нарушение целостности эпителия с различной степенью повреждения эпителия, склеп выпадают, образование язв и трансмуральный проникновение иммунных клеток, с более выраженными изменениями видны так. У мышей СО кормили, свидетельство регенерации эпителия и реституции видно. В противоположность этому, крыс, которых кормили FO поддерживается целостность эпителия и имели ограниченный инфильтрации воспалительных клеток, приуроченных к собственной пластинки. (М-слизистая, SM-суб-слизистая и U-язв; исходное увеличение 100X; масштабная линейка: 100 мкм). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Оценка Гистологическое повреждение толстой ткани 5 дней восле интраректального введения 50% этанола (ясно, бар) или DNBS (сплошная линия) на взрослых самок крыс кормили SO, CO, или FO. Срезы тканей, забитых опытного следователя, ослепленный на лечение, с помощью набора критериев, основанных на гистологических повреждения. Критерии, используемые для этого исследования включает в себя: воспалительная инфильтрация клеток (0 = отсутствует, 3 = трансмуральный), потеря целостности слизистой оболочки (0 = отсутствует, 3 = тяжелая), склеп формированием абсцесса (0 = отсутствует, 1 = присутствует) истощение кубок клеток (0 = отсутствует, 3 = высокий). Счет гистологическое повреждение определяется как сумма баллов, полученных путем вести счет как минимум трех срезах тканей от каждого животного. Результаты ясно показывают, пониженное гистологическое повреждение в FO кормили крыс по сравнению с SO и СО кормили крыс. Значения средства ± SEM, п = 5 / группа. По сравнению с соответствующим контролем этанол, управление DNBS связан с существенным увеличением счет повреждения (Р <0,05); колит группы с разными символами значительно отличались (Р <;. 0.01) Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
Рисунок 4. МРО-активности в ободочной тканей через 5 дней после интраректального введения 50% этанола (прозрачный бар) или DNBS (сплошная линия) для взрослых самок крыс кормили SO, CO, или FO. Воспаление толстой ткани замораживали в жидком азоте и анализировали на активность миелопероксидазы , в качестве показателя гранулоцитов инфильтрации. Colitic крыс кормили FO-шоу снижается MPO активностью по сравнению с SO и Ко Значения средства ± SEM, п = 5 / группа. По сравнению с соответствующим контролем этанол, управление DNBS связано со значительным увеличением в МРО-активности (р <0,001); колит группы с разными символами являются significantlу отличались (Р <0,05). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNBS модель, описанная в этом протоколе является ценным, недорогой и воспроизводимый колит модель, которая может быть использована для изучения различных аспектов IBD. При введении интраректально в крыс или мышей, DNBS вызывает значительную степень воспаления и повреждения тканей в толстой кишке, напоминающие болезнь человеческого Крона с точки зрения его различных гистологических особенностей, включая трансмуральной инфильтрации полиморфно клеток и преобладающей NF-kB-зависимой активации Th1.
Эта модель была использована для изучения различных факторов думали оказывать воздействие на IBD, такие как стресс, депрессия и рацион, а также участия кишечно нервной системы, механизмы травмы ремонтных, трансмуральной воспаления и доклинических терапии. Модель DNBS также подходящей альтернативой TNBS-индуцированного воспаления у мышей и крыс и предлагает менее дорогой альтернативой другим, обычно используемыми химическими моделей колит, таких как DSS. Действия, описанные в этом рrotocol будет позволяют успешно выполнить эту модель.
В соответствии с другими экспериментальных моделях колита 13-16, настоящее исследование усиливает переменных эффекты диетического жира на слизистой кишечника иммунных реакций, где высокое потребление ЭПК и ДГК, потребляемых до и после воздействия DNBS ослабляет, а высокое потребление ARA с минимальным п -3 жирные кислоты усугубляет колит. Благотворное влияние диетических н-3 жирных кислот, наблюдаемых в этом исследовании, отчасти из-за н-3 жирных кислот эффективно ниже ткани фосфолипидов ARA как ингибирование синтеза ARA из Лос-Анджелеса и, заменив ARA с ЭПК и ДГК. Это изменение сдвигает подложку жирных кислот, доступной для освобождения и последующего эйкозаноидов синтеза к менее провоспалительных среды. В противоположность этому, высокое потребление н-6 жирных кислот связано с высокой толстой ARA с последующим синтезом провоспалительных медиаторов, которые усиливают иммунный ответ слизистой оболочки. В Кипинаг с нашим недавнем исследовании в Citrobacter rodentium индуцированной колит, крыс, которых кормили рапсовое масло с меньшим ARA, чем подсолнечное масло, но с н-3 ALA и без EPA или DHA было промежуточное воспалительную реакцию 16.
Есть несколько важных шагов, которые могут повлиять на успешное осуществление модели DNBS. Различные исследования использовали различные концентрации DNBS, начиная от 3-6 мг / мышь или 15-30 мг / крысу, чтобы установить колит. Таким образом, важно, чтобы отдельные исследователи оптимизировать дозировку DNBS для учебы, так как оптимальные дозы может варьироваться от одного объекта животного к другому. Важно также отметить, что концентрация DNBS будет отличаться в зависимости от типа и вида животных, что исследователь использует (например: некоторые штаммы могут быть более восприимчивы и другие более устойчивы к DNBS). Следует проявлять осторожность, чтобы гарантировать, что концентрация DNBS не слишком высока, так как это может привести к быстрой гибели животных RESUlting от перфорации кишечника и сепсиса. Другим важным шагом к использованию этой модели развивается соответствующий метод для интраректального катетера в дистальной толстой кишке животного. Наличие стуле в толстой кишке может предотвратить адекватную вставку катетера во время закапывания. Чтобы избежать этого, осторожно надавливать на заднем конце анус слегка анестезированных мышей, чтобы удалить любой стул в дистальном отделе толстой кишки / прямой кишки. Рекомендуется вставить катетер примерно 3-4 см от заднего прохода, хотя это не может быть продлен максимум до 6-8 см у крыс до селезеночного изгиба (резкий изгиб между поперечными и нисходящей ободочной кишки) 7. Важно отметить, что во время процедуры инстилляции, смазочные катетер путем введения DNBS / этанол в небольших объемах позволит облегчить введение катетера. Для того чтобы избежать ретроградную рефлюкс DNBS из ануса, очень важно, чтобы держать животных в состоянии на приборной доске в течение 90 сек или, наоборот,мыши могут храниться в течение 15 мин в положении Тренделенбурга (лежачем положении, где ноги находятся выше головы на 15-30 °).
Ткани могут быть собраны в выбранных точках времени в зависимости от интересов следователя и ли исследование фокусируется на острым или хроническим воспалением. Кроме того, ткани также могут быть использованы для изучения кишечных ENS и врожденного и адаптивного иммунитета. Тем не менее, важно обеспечить, чтобы должным образом ткани пробы. Рекомендуется собирать ткани в обильного объема 10%-ного формалина в течение флаконах по 5 мл, в отличие от более мелких флаконах объемом для обеспечения надлежащего фиксацию. Соответствующее фиксация образцов является ключевым для изучения как гистопатологическое повреждения и визуализацию молекул-мишеней в тканях по H & E и иммуноокрашивания соответственно. Гистологическое озвучивание тканей должна быть выполнена опытными людьми, которые ослепленных условиям эксперимента, с использованием фиксированных критериям, установленным тон индивидуальный следователь 11,17. Миелопероксидаза (МПО) служит хорошим маркером воспаления, повреждения тканей и инфильтрации нейтрофилов в желудочно-кишечных тканей 11. Для выполнения анализов MPO, предлагается, чтобы хватать заморозить ткани в жидком азоте и на день анализа, рекомендуется работать с свежеприготовленных буферов и растворов для получения наилучших и наиболее точные результаты. Эта модель также может быть использован для изучения воспалительные клетки, которые проникают в кишечник, механизмы, участвующие в хемотаксиса и трансмиграции воспалительных клеток и различных путей, участвующих в активации и высвобождения других провоспалительных медиаторов, вовлеченных в повреждение ткани, а также медиаторов, вовлеченных в модуляции воспалительная реакция и в восстановлении тканей.
Клинические недостатки в настоящее время видели с использованием иммуносупрессивных препаратов или предназначенные для одного провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α следует поощрять Investigторы в разработке более эффективных терапевтических стратегий для управления пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника. Модели, такие как модели DNBS, позволяет исследователям увеличить наше понимание патогенеза IBD, потенциально выявления новых терапевтических мишеней и разработки / усовершенствования стратегии контроля воспаление за счет использования новых воспалительных путей и новых методов лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана от операционной грантов KJ из естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (NSERC) и болезнь Крона и колит фонда Канады (CCFC). В.М. поддерживается CFRI стипендий и ГБ выпускник студенчества от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR). БАВ является Дети с кишечными и заболеваний печени Фонд (РЕБЕНОК) Председатель детской IBD исследований и Канада заведующая кафедрой в детской гастроэнтерологии и KJ является старшим клиницист Ученый поддержке ребенка и ребенка и (CFRI) Программы клиницист Ученые премии Семья научно-исследовательский институт , Университет Британской Колумбии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Biotechnol, J. . B. iomed , (2012).
- Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression. Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).
- Reber, S. Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).
- Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis. Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).
- Boyer, L., et al. Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis. Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).
- Saunders, P., et al. Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat. Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).
- Cuzzocrea, S., et al. Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat. Gut. 48 (4), 478-488 (2001).
- Cuzzocrea, S., et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).
- Innis, S., Jacobson, K. Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease. Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).
- Innis, S. M., de La Presa Owens, S. Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain. J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).
- Jacobson, K. Mundra H.,Innis S.M. Intestinal responsiveness to experimental colitis in young rats is altered by maternal diet. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 13-20 (2005).
- Sanovic, S., Lamb, D. P., Blennerhassett, M. G. Damage to the enteric nervous system in experimentalcolitis. Am. J. Pathol. 155 (4), 1051-107 (1999).
- Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis. Gut. 31, 539-544 (1990).
- N-3 fatty acid-rich diet prevents early response of interleukin-6 elevation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced enteritis. Int. J. Mol. Med. Andoh, A., Tsujikawa, T., Ishizuka, I., Araki, Y., Sasaki, M., Koyama, S., Fujiyama, Y. 12, 721-725 (2003).
- Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis. Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).
- Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).
- Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).
