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Neuroscience

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Published: June 4, 2014 doi: 10.3791/51298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Departments of Neurobiology and Cell Biology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center

Summary

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Abstract

Apesar de curta duração, a mitose é um processo multi-passo complexo e dinâmico fundamental para o desenvolvimento de órgãos, incluindo o cérebro. No córtex cerebral em desenvolvimento, a mitose anormal das células progenitoras neurais pode causar defeitos de tamanho e função do cérebro. Portanto, há uma necessidade crítica de ferramentas para compreender os mecanismos da mitose neural progenitor. Desenvolvimento cortical em roedores é um modelo excelente para estudar este processo. Neural mitose progenitor é comumente examinadas em seções cerebrais fixos. Este protocolo irá descrever em detalhe uma abordagem para geração de imagens ao vivo de mitose em ex vivo fatias cerebrais embrionárias. Vamos descrever os passos críticos para este procedimento, que incluem: extração do cérebro, a incorporação do cérebro, vibratome seccionamento de fatias do cérebro, coloração e cultura de fatias e imagem time-lapse. Nós, então, demonstrar e descrever em detalhes como realizar a análise pós-aquisição da mitose. Nós incluímos os resultados representativos from este ensaio utilizando o corante vital Syto11, ratinhos transgénicos (histona H2B-EGFP e Centrin-EGFP), no útero e electroporação (mCherry α-tubulina). Vamos discutir como este processo pode ser melhor otimizado e como ele pode ser modificado para o estudo da regulação genética da mitose. Imagens ao vivo da mitose em fatias de cérebro é uma abordagem flexível para avaliar o impacto da idade, anatomia e perturbação genética em um ambiente controlado, e para gerar uma grande quantidade de dados com alta resolução temporal e espacial. Assim, este protocolo irá complementar as ferramentas existentes para análise de neural mitose progenitor.

Introduction

O objetivo geral deste protocolo é para descrever como realizar imagens ao vivo de neural mitose progenitor em fatias cerebrais embrionárias. Usando imagens ao vivo de fatias cerebrais em cultura, este protocolo fornece um método simples para analisar vários aspectos da mitose em progenitores neurais em um ambiente muito semelhante a um cenário in vivo. Ele pode ser aplicado aos cérebros de animais e / ou mutantes cérebros que foram manipuladas com eletroporação in utero) 1-5. Esta técnica também é ideal para testar o efeito de agentes farmacológicos na mitose "precursores neurais, por simples adição de um agente para o meio de cultura. Em suma, este artigo fará um protocolo tecnicamente desafiador acessível para aqueles que estudam a neurogênese.

Durante a neurogênese, as populações progenitoras neurais distintas sofrer divisões precisas para gerar neurônios que eventualmente contribuem para as seis camadas corticais do neocórtex adulto 6-8. No início do desenvolvimento cortical, a piscina precursor neural expande como células gliais (NE) divide simetricamente de auto-renovação. Células NE em seguida, converter em células gliais radiais (RGCs). Inicialmente CGR dividir simetricamente para produzir dois novos CGR, no entanto, durante a maior parte da neurogênese, o modo principal 'CGR da divisão é assimétrica. Na divisão assimétrica, um RGC dá origem a um novo e RGC ou um neurónio pós-mitótico, ou um progenitor mais especializado (ou um precursor neural curto (SNP), um glia radial exterior (ORG), ou um intermediário de progenitor (INP) 2,3,7,9. INP, SNPs e orgs pode então gerar neurónios no sub-ventricular, ventricular, e as regiões do córtex basal, respectivamente. Assim, a divisão celular das células progenitoras é um processo fundamental para a geração de neurónios do neocórtex.

Vários estudos apontam para uma correlação entre as características específicas do CGR mitose e o destino das células-filhas. Haydar et al. E Takahashi et al.têm demonstrado que a duração mitótico RGC e aumento do comprimento do ciclo celular como neurogênese receitas, uma descoberta ecoou em acompanhar os estudos 10-13. Um número de estudos têm sugerido que a orientação relativa do fuso mitótico para o ventrículo influencia aspectos da neurogénese e corticogenesis, incluindo os tipos de neurónios gerados e localização de progenitura no cérebro, respectivamente 3,10,14-16. Quer orientação plano de clivagem influencia diretamente o destino da célula é controversa, mas a conclusão é que este mitótico impactos parâmetros neurogênese. Além disso ressaltando a importância da mitose é a observação de que muitos genes envolvidos nos mecanismos da mitose são cruciais para a neurogênese e para o desenvolvimento adequado do cérebro 17-20.

A mitose é um processo dinâmico, no entanto, até o momento a maioria dos estudos que detalham neural mitose progenitor utilizar análise de cortes de tecidos fixos ou de imagem de progenitores neurais através de cultura in vitro de células. Assim, os métodos tradicionais para avaliar a mitose só fornecer um instantâneo desse processo e não conseguem descobrir como as células se comportam em um tecido. Imagens ao vivo de neural mitose progenitor tem se tornado uma ferramenta fundamental para a compreensão da função neural progenitor. Para exemplos veja estas referências 4,8,10,21-25. Vários protocolos pendentes foram publicadas para a preparação e tratamento de imagens de fatias do cérebro 26,27. No entanto até à data, um protocolo detalhado para a imagem e análise de mitose não tem sido descrito, nem demonstrado em vídeo.

Esta técnica oferece várias vantagens significativas sobre análise fixo de seções cerebrais. Análise Time-lapse de fatias do cérebro permite a geração de um número significativamente maior de pontos de dados que podem ser analisados ​​de uma forma flexível. Em primeiro lugar, os dados são recolhidos em pontos de tempo individuais ao longo de vários minutos ou de várias horas. Pode-se analisar pontos de tempo individuais (para criar uma montagem estática) oupode combinar diferentes momentos em filmes. Em segundo lugar, confocal de imagens de fatias permite a geração de dados em diferentes seções Z em fatias de cérebro. Como resultado, as secções individuais pode ser analisado. Em alternativa, as pilhas de secções individuais podem ser combinadas em uma projecção de intensidade máxima. Em terceiro lugar, a análise é feita no contexto de um tecido, revelando como as células se dividem em relação às células e as estruturas vizinhas. Em quarto lugar, é idealmente adequado para a análise de mutantes que mostram alguma evidência de defeitos mitóticas. Juntos, este protocolo vai ajudar a esclarecer as etapas críticas para ajudar os investigadores que pretendam realizar imagens ao vivo de neural mitose progenitor em seus próprios laboratórios.

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Protocol

1. Preparação de Meios (Figura 1, Passo 1)

  1. Fatia Meio de Cultura
    1. 25 ml de meio de cultura fatia é suficiente para preparar pratos de fundo 5 de vidro com 2 fatias por bem.
    2. Num tubo de 50 ml, adicionar 250 mL de uma solução de N2 100x e 500 ul de uma solução 50x B27 sem vitamina A. Adicione DMEM/F12 a um volume de 22,5 ml.
    3. Filtro esterilizar solução e posteriormente adicionar 1,25 ml de soro de cavalo inactivado pelo calor e de 1,25 ml de soro fetal bovino.
    4. Incubar solução em um banho de água a 37 ° C durante o tempo de preparação das fatias.
    5. Adicionar os factores de crescimento (FGF e EGF, concentração final de 10 ng / ml e 20 ng / ml, respectivamente), imediatamente antes do início da cultura. A composição deste meio foi optimizada para promover a sobrevivência de células em cultura e para aumentar a taxa de proliferação de células progenitoras neurais. Isto irá, portanto, maximizar a probabilidade deobservar células mitóticas na fatia.
  2. Solução Dissection HBSS completa
    1. Preparar 500 ml de HBSS completo por adição de 50 ml de HBSS 10x, 1,25 ml de Hepes 1 M (pH 7,4, 2,5 mM de FC), 6 ml de 2,5 M de D-Glucose (FC 30 mM), 2,2 ml de 0,9 M NaHCO3 (FC 4 mM) e autoclavados DiH 2 O para um volume final de 500 ml.
    2. Filtrar a solução de esterilizar e armazenar a 4 ° C, até a recolha de cornos uterinos do ratinho grávida. Esta solução pode ser mantida a 4 ° C por semana.
    3. Mantenha a HBSS em gelo durante o procedimento de dissecção todo.
  3. Solução Incorporação
    1. Para a incorporação de quatro cérebros embrionárias, preparar 30 ml de 3% de agarose de baixa fusão na solução completa HBSS. Num tubo de 50 mL cónico, adicionar 0,9 g de agarose de baixo ponto de fusão e cheio de HBSS a 30 ml.
    2. Misturar a solução com um misturador de vórtice, e derreter no microondas com a posição do tubo ea tampa aberta.
    3. Enquanto no forno de microondas, monitorar a solução para pestouro revent devido à ebulição excessiva. Quando ferver começa, pare o microondas e vortex a solução.
    4. Repita essas etapas até que todo o agarose derreteu.
    5. Armazenar o tubo em banho-maria a 42 ° C.

2. Dissecção do Embriões (Figura 1, Passo 2)

  1. Após a eutanásia cuidado com o mouse grávida, recolher os cornos uterinos e transferi-los para um prato de 10 cm2 Petri contendo frio completo 1x HBSS. A idade do embrião pode variar, dependendo do estudo. Este protocolo tem sido usado com sucesso para a cultura fatias de cérebro de dias embrionárias E12.5 a E17.5. Devido ao seu tamanho, os cérebros mais novas tendem a ser mais difícil de trabalhar com ele.
  2. Recolher os embriões e dissecar os cérebros embrionários, como descrito anteriormente no rato e no ratinho 26,27, até um cérebro embrionário completo, incluindo o cérebro posterior e o cérebro anterior com os dois hemisférios cerebrais é obtido. Estes podem sermantidos à temperatura ambiente até todos os cérebros foram dissecados.
  3. Recolher os embriões e dissecar os cérebros embrionários, como descrito anteriormente no rato e no ratinho 26,27, até um cérebro embrionário completo, incluindo o cérebro posterior e o cérebro anterior com os dois hemisférios cerebrais é obtido. Estes podem ser mantidos à temperatura ambiente até que todos os cérebros foram dissecados.

3. Incorporação dos cérebros embrionários (Figura 1, Passo 3)

  1. Em um balde contendo gelo, criar um buraco no gelo para inserir os moldes de incorporação em.
  2. Verter o meio de agarose a 3% dentro de um molde de plástico e colocá que o molde para o furo preparado no gelo.
  3. Agita-se o meio de agarose, com a ponta de um termómetro digital, até que a temperatura atinja 35 ° C.
  4. Prontamente transferir o cérebro no meio de incorporação.
  5. Passo Crítico: Para remover o excesso de HBSS na interface entre o cérebro eo agarose, com cuidado e secar delicadamente / girar o cérebro repetidamentena solução de incorporação com a pinça.
  6. A almofada de agarose gelificada irá formar na parte inferior do molde em contacto com o gelo. Uma vez que a almofada pode ser sentida com a ponta do fórceps agitando o cérebro, posicionar o cérebro com o lado dorsal para cima. O cérebro não deve afundar até o fundo do molde.

4. Preparação de agarose bloco (Figura 1, Passo 4)

  1. Deixe que a agarose endureça no gelo durante pelo menos 5 min.
  2. Usando uma lâmina de barbear, a secção dos cantos do molde.
  3. Esculpir cuidadosamente um bloco de agarose ao redor do cérebro usando uma lâmina de barbear. Tente minimizar o número de cortes para evitar perturbar o cérebro incorporado.
  4. Certifique-se de que o bloco tem uma maior área de superfície da região caudal do cérebro (versus a região rostral, ver Figura 1, Passo 4) para aumentar a estabilidade do bloco sobre o pedestal de seccionamento.
  5. O último corte deve ser o único no lado caudal do cérebro;este corte irá definir o plano de corte correto com o vibratome.
  6. Fazê-lo através do alinhamento da lâmina perpendicular ao eixo rostro-caudal do cérebro e o bloco de agarose. Deslize para baixo a lâmina caudal ao longo do eixo rostro-caudal e fazer o corte final de cerca de 5 mm da região mais caudal do cérebro.
  7. Definir o bloco de agarose / cérebro de lado e repita a incorporação de outros cérebros.

5. Transferência dos Brains incorporados na Bandeja do Vibratome (Figura 1, Passo 5)

  1. Adicionar uma gota de cola na parte inferior da bandeja de vibratome. Coloque cola de modo a que os blocos de agarose será posicionada dentro do alcance da lâmina vibrante.
  2. Coloque bloco de agarose / cérebro lado o caudal baixo na extremidade de uma espátula, com cerca de 50% do bloco de inflexão sobre a borda da espátula.
  3. Aplicar a face caudal do bloco de agarose para a cola e deslizar a espátula de distância, mantendo-se o bloco de agarose para o fundo do tabuleiro, com a sHoulder de um par de pinças. Não deixe que a espátula contactar directamente a cola.
  4. Deixe a cola solidificar à temperatura ambiente durante 5 min.

6. Seccionamento dos Brains incorporados (Figura 1, Passo 6)

  1. Encha o tabuleiro de vibratome com HBSS.
  2. Definir as posições de largada e chegada da lâmina vibratome.
  3. Gerar 200-250 mM fatias. Com a vibratome VT1000s, use os seguintes parâmetros: velocidade 2-4, freqüência 8.
  4. Retire cuidadosamente as fatias do vibratome como eles são cortados. Transfira as fatias com uma espátula e back-end de pinças em 12 pratos bem cheios de pleno HBSS. Alternativamente alguns pesquisadores têm usado um pincel em vez de pinças ponto-chave:. Durante a transferência, tome cuidado para que as fatias de cérebro permanecer ligado à agarose circundante.

7. Syto11 coloração das fatias (Figura 1, Passo 7)

  1. Diluir Syto11 para uma concentração final de0,5-1 uM em meio de cultura fatia suplementado com factores de crescimento.
  2. No poço de uma placa de 12 poços, incubam fatias de um cérebro em 2,5 ml da solução de coloração, durante 1 hora a 37 ° C.
  3. Lave as fatias em 2,5 ml de meio de cultura sem fatia solução durante 20 min a coloração.

8. Montar as fatias em um prato fundo de vidro (Figura 1, as etapas 8, 9)

  1. Prepare 15 mL de solução de colágeno a incorporação por fatia. Prepara-se uma solução de 1,5 mg / ml de colagénio por mistura de 375 ul de solução de I ml de 3 mg / tipo de colagénio com 75 ul de 10x de DMEM, 9,4 mL de NaOH 1 M, e 290 mL de H 2 O. Guarde no gelo.
  2. Colocar uma gota de 15 ul da solução de colagénio, na parte inferior de um fundo 35 mm Vidro Micropoço lavar. Espalhe-o com a ponta da pipeta para combinar com o tamanho da fatia.
  3. Transfira a fatia na gota de colágeno com uma espátula e pinça ponto-chave:. Montagem em várias fatias diferentespratos rentes aumenta a probabilidade de adquirir fatias adequadas para a imagem latente. Tela através de diferentes fatias e selecionar aquelas que melhor atendam aos critérios descritos abaixo, na seção "Resultados representativos".
  4. Deixe as fatias incubar à TA durante 10 min antes de transferi-los para uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
  5. Após 20 min, adicionar 1,2 ml de meio de cultura fatia no fundo de vidro prato Microwell. Adicionar 600 mL de meio de cada vez e espalhá-lo com uma ponteira.
  6. Capturar uma imagem de baixa ampliação da fatia do cérebro para registrar a nível anatômico e integridade da fatia.

9. Imaging ao vivo das fatias (Figura 1, as etapas 10, 11)

  1. Deixe as fatias de recuperar na incubadora durante pelo menos 1 hora e 30 min a 37 ° C com 5% de CO 2 antes de imagens em tempo real.
  2. Imagem as fatias com o microscópio de escolha, tendo em mente que Syto11 é muito propenso a fotodegradação. Aqui uma inversãoted disco giratório microscópio confocal é usado (Andor XD revolução fiação confocal disco microscópio). Alternativamente um microscópio confocal de varrimento de laser pode ser usado. Os parâmetros a seguir são para o microscópio disco giratório set-up.
  3. Durante a sessão de imagens em tempo real de todo, fatias manter a 37 ° C, 5% de CO 2, numa câmara de incubação humidif ligado ao microscópio.
  4. Células de imagens com uma objectiva 60X de silício de óleo com uma distância de trabalho de 300 mm, e uma abertura numérica de 1,3 (para exemplos, ver as Figuras 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Um objectivo óleo 100X com uma distância de trabalho de 130 um e uma abertura numérica de 1,4 (por exemplo, ver a Figura 4C) também pode ser usado. A resolução da câmera é de 512 x 512.
  5. Imagem as células em um z-pilha 30 um, com o centro da pilha z localizado a cerca de 40 mM ou mais abaixo da superfície da fatia. Tentando imagem mais profundamente no tecido pode causar o objectivo de adicionarpressão mecânica sobre a fatia. Isso pode afetar a integridade da fatia do cérebro. Se pretende fazer reconstruções 3D das células, usar um z-intervalo de não mais do que 2 ^ m.
  6. Ajuste a potência do laser e tempos de exposição para limitar fotodegradação. Usar os tempos de exposição que variam entre 30 e 200 mseg, dependendo da intensidade do sinal Syto11.
  7. Com um palco motorizado, imagem várias posições em várias fatias montado em um prato. Por exemplo, a imagem até 20 posições espalhados por 4 fatias diferentes em um único prato.
  8. Para imagens em tempo real, utilize uma resolução temporal inferior a 5 minutos, para permitir a identificação das diferentes fases da mitose. Usando Syto11 e / ou histona H2B-EGFP, 4-5 horas de imagens ao vivo são suficientes para observar um número significativo de células mitóticas. No entanto, se a imagiologia de baixa densidade marcada células mitóticas (tais como os obtidos no útero por electroporação), em seguida, um parâmetro de tempo de imagem (durante a noite), é apropriado e que funcionall.
    Nota: O uso deste protocolo, que normalmente observamos em média 10 células mitóticas por posição. Como afirmado acima, múltiplos imagiologia fatias montado aumenta a probabilidade de ter uma experiência de sucesso. Com esta abordagem que normalmente identificam células mitóticas em praticamente todos os experimentos realizados com Syto11 ou histona H2B-EGFP.

10. Pós-aquisição Análise da mitose (Figura 2)

Todos os procedimentos desta seção foram otimizados em Fiji (ImageJ), o que é vantajoso, pois é um software livre de código aberto. Outras soluções de software estão disponíveis para executar as mesmas tarefas, como Metamorph, Imaris e Amira.

  1. Identificação de mitótico Figuras em Fiji
    1. Depois de abrir o conjunto de dados para uma posição como um "hyperstack", selecione um z-plano (ver Figura 2A para a localização da barra de rolagem), onde o tecido e as células parecem saudáveis ​​(ver critérios na seção de discussão).Rolar através da dimensão temporal para identificar células que atravessam a anafase, como é o mais fácil de identificar fase mitótica.
    2. Role para trás no tempo para identificar o ponto no tempo em que a célula entra em mitose (condensação DNA). A célula pode se mover através z-aviões, mas a resolução temporal e os parâmetros z-stack descritos anteriormente foram otimizados para permitir este processo.
    3. Numa folha de cálculo, gravar o 4D coordenadas da célula na hyperstack (X, Y, Z e tempo, ver Figura 2A para visualizar a localização destas figuras na interface Fiji) à medida que entra mitose. Conhecendo essas coordenadas impedirá contando a mesma célula várias vezes.
    4. Vá para a frente no tempo e registrar o momento em que a célula progride de uma fase para outra. Documentar a duração de cada fase mitótica de uma dada célula.
    5. Prossiga com outras células, em todo o conjunto de dados completo (várias células dentro e entre as posições).
  2. Reconstruir 3Diônica das células e quantificação de rotação Durante Metaphase (Adaptado de Haydar et al, 2003) (Figura 2B).
    1. Depois de ter identificado várias células mitóticas, use as coordenadas de uma célula e avançar no tempo até o início da metáfase.
    2. Gire todo o "hyperstack" para que a fronteira ventricular é planar (usando o "... Imagem / Transform / Rotate" de comando). Use a ferramenta "ângulo" para determinar o ângulo para se candidatar a esta rotação.
    3. Identificar o plano z onde a célula de interesse é o mais visível. Nesse plano, use a ferramenta "retângulo de seleção" para desenhar uma seleção que inclui toda a célula.
    4. Identificar os z-planos que incluem a célula de interesse. Use o comando "Imagem / Duplicar" para criar um "sub-stack". Na caixa de diálogo, sair "hyperstack Duplicate" marcada. O "Fatias (z)" parâmetro corresponde aos z-aviões, incluindo toda a cell, e os "Quadros (t)" parâmetro corresponde ao ponto no tempo atual.
    5. Se a resolução for pobre, aumentar o tamanho do "sub-stack" usando o "Imagem / Ajustar / tamanho ..." comando.
    6. Gerar uma reconstrução 3D do celular no ponto de tempo atual usando o "projeto Image/Stacks/3D ..." comando. Os parâmetros para este comando são exibidos na Figura 2B. O "espaçamento fatia" corresponde ao intervalo de tempo entre cada uma das imagens z-plano (M). Importante: certifique-se que a dimensão física (mm) da sub-stack foi conservado. Se não, a interpolação dos pixels na dimensão z será incorreto, ea reconstrução 3D vai ser imprecisa.
    7. Usando a barra de rolagem, girar a reconstrução 3D resultante para que a borda da placa metafásica é visível. O número do quadro corresponde ao ângulo beta descrito na Figura 3B, registar esse número. Utilizaçãoa ferramenta "ângulo" e "Analisar / Medida ..." comando, medir o ângulo entre a horizontal e uma linha que atravessa a placa metafásica perpendicularmente (Figura 2B). Isto é o ângulo alfa.
    8. Anote esses ângulos para todos os pontos da célula de interesse tempo metáfase. O ângulo de rotação entre os pontos de tempo (t) e (t-1) é igual ao valor absoluto da diferença entre um ângulo de (t), e este ângulo de (t-1).
  3. Medir a orientação da clivagem Plane
    1. 3D reconstruir uma célula de interesse em um ponto de tempo durante a anáfase seguindo as instruções descritas para a reconstrução 3D de placas de metáfase.
    2. Girar a reconstrução até que as bordas das duas placas formadas pelos cromossomas segregantes são visíveis.
    3. Utilizar a ferramenta para medir o ângulo entre o ângulo horizontal (a borda ventricular) e uma linha paralela às duas placas formadas pelos cromossomas segregantes. Isto é o ângulo do plano de clivagem (Figura 2C).
  4. Geração de Filmes
    1. Como as células movem-se frequentemente em diferentes z-planos, identificar os z-aviões ocupados pelo celular durante a sessão de imagens ao vivo. Gerar uma "projeção de intensidade máxima" desses z-aviões usando a "imagem / Stacks projeto / Z ..." comando. Salve a pilha resultante como um arquivo ". TIF".
    2. Abra este arquivo na versão 1.45 do ImageJ como Fiji não inclui um plugin estável para a geração de ". Mov" ou "AVI". Arquivos.
    3. Use o "Arquivo / Salvar como / ..." comando de ImageJ para gerar um filme em um formato compatível com as suas aplicações a jusante.

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Representative Results

O sucesso deste ensaio e da observação de várias células mitóticas durante uma sessão de imagens ao vivo depende em grande parte tanto a integridade eo nível anatômico da fatia onde as aquisições são feitas. Como se verá adiante, o nível anatômico de uma fatia é um fator importante. Figura 3A mostra rostro-caudal e locais onde temos sido mais bem sucedido medial-lateral. Para discussão adicional sobre este assunto consulte Noctor 26. A integridade da fatia pode variar em diferentes regiões da fatia. Esta pode ser determinada antes do início do lapso de tempo (usando imagens de toda a fatia como no Passo 7.6). Em uma boa região de um cérebro E13.5 as seguintes observações podem ser feitas: muitas células mitóticas serão encontrados na fronteira ventrículo, os núcleos interfásicos será em forma elíptica em vez de redondo, e núcleos interfásicos aparecerá em relação à fronteira colunar ventrículo . Em uma região menos desejável do cérebro, onúcleos vai olhar arredondado e um pouco desorganizado (Compare Figuras 3B e 3C, e veja a Figura 3D para uma imagem de uma fatia bem montado).

Quando são alcançadas as condições ideais, este ensaio irá permitir a identificação qualitativa dos diferentes fases da mitose. Estes podem ser detectados por meio de análise do padrão de DNA (ver Figura 3E para exemplos de apicalmente a divisão das células em cada fase de mitose). Durante profase, a condensação de DNA terá a aparência de ADN de baixa densidade marcada (regiões de ADN-pobre-rico de ADN e no núcleo). Durante a metáfase, os cromossomos formam um plano no equador do corpo celular. Dependendo da orientação do plano, o padrão de ADN é (i) uma linha de espessura (Figura 3E, ver 1) ou (ii) um "roseta", com uma região de ADN-pobre no meio (Figura 3E, ver 2) . Durante a anáfase, quando os cromossomos se separam, eles se parecem com "mãos"; que migram em sentidos opostos. Esta fase pode ser difícil de identificar quando o plano de clivagem está no X - Y plano de aquisição. Durante a telófase, DNA relaxa e adquire uma forma elipsóide como as reformas envelope nuclear. Pontos de tempo individuais podem ser coletadas para visualizar mitose ao longo do tempo (veja a Figura 3F).

Além de obter imagens de mitose de células progenitoras dividem apicalmente, este ensaio pode ser utilizado para a imagem, tais como células de orgs ou INP basalmente divisão, o último dos quais é mais provável representado na Figura 3G. Tais células são identificáveis ​​pela sua localização para a divisão no SVZ camada. No entanto, para realmente marcar essas células é melhor par a análise com a expressão de um marcador fluorescente que rotula o processo de célula ou o destino (ver Figuras 4B-D). INP terá nem um processo de apicais nem basal, orgs terá um processo basal com o seu corpo celular localizado nas camadas exteriores, e CGRs terá uma baprocesso de sal com o seu corpo celular localizado na camada VZ.

A mitose das células progenitoras pode ser visualizado através de métodos alternativos. Figura 4A demonstra o uso da histona H2B-EGFP ratinho transgénico para rotular cromossomas de todas as células em divisão. Isto marca as células em um padrão semelhante ao Syto11. Figura 4B mostra imagens realizada com cérebro no útero eletroporados com EGFP-α-tubulina e histona H2B-mCherry. Como demonstrado, o que permite uma visualizar ambos os microtúbulos e cromossoma, e, adicionalmente, o corpo da célula e processos basal. Figura 4C mostra imagiologia realizada com cérebro de um rato Centrin-EGFP, no útero electroporadas com mCherry-a-tubulina e a histona H2B-EGFP . Como demonstrado, este permite que se cromossomos e centríolos imagem no canal verde eo corpo do fuso mitótico e celular / processo no canal vermelho. Figura 4D mostra imagens realizadas com o cérebros no útero eletroporados com CMV-Cre esparsamente e CALNL-EGFP 28. Esta técnica permite que se escassamente rótulo progenitores divisão, tornando a análise de células em divisão individuais mais fáceis. Ao utilizar eletroporação no entanto, tenha em mente que este método tem como alvo um grupo bastante sincronizada de células de ciclismo 2,12. Isto significa que o tempo de imagens ao vivo em relação à electroporação necessita de ser ajustada, de modo que o grupo de células electroporadas aproxima mitose no início da sessão de imagem. Se não, o sucesso da experiência na identificação de células mitóticas pode ser comprometida em uma sessão de imagens de curto prazo.

Quando são alcançadas as condições ideais, as características fundamentais da mitose pode ser medido quantitativamente incluindo a duração da mitose em geral, a duração das fases individuais, a rotação do plano da metafase e clivagem orientação do plano. Nas condições descritas, temos observado uma duração mitótico global média de 1h30 min nos dias embrionários (E) 13,5 e 14,5. Como descrito anteriormente, a rotação do plano de ADN metafase pode ser medido num ponto de tempo individual ou cumulativamente ao longo da duração de uma metafase inteiro 2,6,9,10. Isto pode ser conseguido utilizando a reconstrução em 3D do plano da metafase de uma célula em cada ponto de tempo e a medição de ângulos de DNA em relação ao ventrículo. Nós temos aplicado com sucesso o método neste artigo a seguir células por pelo menos 3 horas.

Figura 1
Figura 1. Representação esquemática dos passos no protocolo. Tempo necessário para cada etapa é indicado em cada uma das etapas. Detalhes para cada uma dessas etapas são descritos na seção "protocolo". Por favor, note que o Passo 7 pode ser contornado quando imagiologia fatias de oiembriões pedra H2B-EGFP, ou fatias de cérebros que foram electroporadas com os plasmídeos que expressam os marcadores para a mitose.

Figura 2
Análise pós-aquisição Figura 2. De time-lapse conjuntos de dados de microscopia de vídeo em Fiji (ImageJ). A) Localização das diferentes ferramentas utilizadas para a análise em Fiji. B) diferentes etapas envolvidas na reconstrução 3D de uma célula em metáfase. Detalhes para cada uma dessas etapas são descritos na seção "protocolo". C) Medição de clivagem orientação do plano de reconstrução 3D de células em anáfase. Por favor, note que os números em B Passo 6 e C mostram a seqüência seguida para medir o ângulo. D) Os dados representativos, mostrando a repartiçãon de duração da metafase em um grupo de células mitóticas observada na fronteira ventricular em fatias de cérebro de E13.5 (n = 35). E) Os dados representativos mostram a rotação cumulativa de placas na metafase em células mitóticas E13.5 na fronteira do ventrículo . Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3
Figura 3. Exemplos de dados representativos da análise de imagens ao vivo. A) ao longo do eixo dorso-ventral, mitose é mais facilmente trabalhada na região dorsal de fatias do cérebro, porque o processo basal das CGR é mais curta e, assim, menos susceptíveis de ser cortados por vibratome. Ao longo do eixo rostro-caudal, fatias nas regiões caudais do córtex dorsal darresultados mais consistentes em nossas mãos Exemplos. B e C) são mostrados de uma boa região (B) e uma região ruim (C) para a imagem latente. Em uma boa região, os núcleos são de forma elíptica (regiões circulados) e muitas células mitóticas são observados na fronteira do ventrículo antes de lapso de tempo de imagem (setas). Em uma região ruim, muito poucas células mitóticas são observados na fronteira do ventrículo (seta simples) e os núcleos são redondos (regiões circulado) D) Exemplo de uma boa fatia observados com um microscópio de baixa ampliação antes de viver de imagem.. E) Exemplos de Syto11 rotulado células em diferentes fases da mitose, como observado F) Montagem de uma região na fronteira do ventrículo onde dois progenitores neurais percorrer as diferentes fases da mitose, marcada em cores diferentes (tempo, hh:. mm). G) Montagem de uma região em destaque na (B) em que um progenitor neural divide em distância da fronteira ventricular. Em montagens (D) e (E), cells foram pseudo colorido usando o Photoshop para destacar as diferentes fases de mitose. (As barras de escala: B, C, F: 10 mM, D: 1 milímetro, E, G: 5 mm).

Figura 4
Figura 4. Exemplos de instrumentos alternativos para visualizar a mitose de células progenitoras neurais. A) Montagem de uma região na fronteira do ventrículo em uma fatia do cérebro de um embrião transgênico histona H2B-EGFP em E13.5. Um progenitor é observada como ela prossegue através das diferentes fases da mitose. B) Montagem de um VZ em E14.5 na fatia de um cérebro que foi electroporado em E13.5 com vectores que expressam EGFP-a-tubulina e H2B-mCherry. EGFP-a-tubulina permite a visualização da dinâmica dos microtúbulos durante a mitose (B 1-B 2) C) Montagem de uma região ventricular numan E15.5 cérebro de um embrião transgénico Centrin-EGFP que foi electroporado em E14.5 com plasmídeos que expressam mCherry-a-tubulina e H2B-EGFP. Centrin-EGFP permite a visualização de centríolos dinâmica durante a mitose (C 1 e C 2). D) Montagem de uma região mostrando o IZ de uma fatia E14.5 cérebro onde as células foram escassamente rotulada pela eletroporação em E13.5 com um baixo concentração de um plasmídeo de expressão de Cre e uma concentração normal de um plasmídeo expressando EGFP após recombinação Cre 28. A célula dividindo nesta montagem tem a morfologia de um RGosvz com um processo longo basal (setas rosa) e nenhum processo apical 9. O objectivo usado para imagens em tempo real de (A) e (B) é um objectivo exemplos 60X óleo de silicone, óleo de 100X objectivo, por exemplo, (C), e objectiva 10X ar, por exemplo, D. A resolução temporal utilizada para a imagem (A) , (B), (C) e (D) foram exemplos de 4 min, 4 min, 30 seg e 5 min, respectivamente. VZ: Ventricular Zum, IZ: Zona intermediária, RGosvz: zona subventricular exterior radial de células glia-like. (Barras de escala: A: 15 mm, B, C, D: 5 mm, C 1, C 2: 2,5 mm) Clique aqui para ver a imagem ampliada.

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Discussion

A principal vantagem do protocolo já descrito é que proporciona uma resolução temporal dinâmico de mitose de células progenitoras neurais. Normalmente, os ensaios para visualizar mitose no cérebro em desenvolvimento são realizadas através de imunofluorescência de cortes de tecidos fixos. Mas esta abordagem apenas fornece um instantâneo da mitose em um ponto do tempo.

Existem vários passos que são mais críticos para imagiologia de mitose em fatias de cérebro de: 1) As fatias de cérebro deve permanecer ligado à agarose, para preservar a integridade das secções do cérebro durante a transferência e a montagem. 2) Para a geração de imagem e de fatias, o controlo dos níveis de rostro-caudal é importante. Fatias de cérebro caudal são tipicamente melhores, porque nestas fatias, os processos basais do RGC será mantida intacta, o que é mais saudável para as células. 3) Para imagens ao vivo, o uso de um microscópio confocal de disco giratório com um objetivo 60X é melhor tanto para alta resolução e para evitar a fotodegradação de splos, o que pode ocorrer com corante Syto11. 4) Para imagens ao vivo, os parâmetros temporais de aquisição são críticos. Dependendo do material utilizado microscópio, lapso de tempo pode ser realizado variando de cada min a cada 10 min. Mais de 10 min é tipicamente muito tempo para atingir a dinâmica de alta resolução de mitose.

Este protocolo tem certas limitações. A experiência é realizada com o tecido ex vivo. É concebível que as observações feitas em fatias de cérebro podem ser diferentes in vivo. Assim, ao fazer comparações entre os experimentos realizados em dias diferentes ou utilizando diferentes amostras, os seguintes parâmetros devem ser mantidos constantes: utilização de níveis semelhantes rostro-caudal e dorso-lateral, conteúdo de mídia, o uso de microscópio e os parâmetros de aquisição. Além disso, é possível fototoxicidade com imagem latente a longo prazo. Portanto vários experimentos devem ser realizadas antes de fazer conclusões. Além disso, podia-se Syto11 potenteei ra me nt influenciar os acontecimentos de mitose, especialmente em um fundo mutante. Portanto, recomenda-se que, quando se faz a conclusões sobre a mitose com base em Syto11, eles também confirmar os resultados utilizando ensaios independentes, como por exemplo marcadores descritos na Figura 4.

Tal como descrito no protocolo, a mitose pode ser trabalhada após marcação cromossomas e o citoesqueleto de várias maneiras. Outros corantes SYTO pode ser usado para visualizar a mitose em outros canais fluorescentes. Em vez de utilizar a coloração Syto11 para visualizar o ADN, as fatias pode ser gerado a partir de linhas transgénicas fluorescentes. Por exemplo, tal como demonstrado, linhas transgénicas histona H2B-EGFP pode ser usado 29. Utilização de histona H2B-EGFP é particularmente útil e recomendado para confirmar qualquer fenótipo observado com o tratamento Syto11. Além disso, também pode ser útil para a superação de desafios associados à fotodegradação com Syto11. A utilização de outras linhas de transgénicos, tais como Centrin-EGFP 30, podeser usado para visualizar centríolos, os componentes de centrossomas. Embora estes sozinho não seria suficiente para a visualização de mitose, eles funcionam bem em combinação com outros marcadores de cromossomas ou microtúbulos. Tais marcadores podem ser introduzidos por electroporação in utero 4,5,10,31,32. Como demonstrado, a expressão de proteínas de fusão no dia anterior à dissecção podem ser úteis para esta abordagem. Em nossa experiência, expressando construções sob um promotor CAG muitas vezes pode render expressão robusta dentro de um dia. Por exemplo, introduzimos α-tubulina e histona H2B-EGFP em cérebros embrionárias usando essa abordagem.

Uma vez que esta técnica é dominada há modificações adicionais que podem ser feitas para experiências futuras. No útero electroporação também pode ser utilizado para manipular a expressão génica. Por exemplo, a introdução de shRNA ou cDNAs podem ser úteis para determinar o impacto de perda de função ou a sobre-expressão de um gene de interesse sobre prog neuralenitor mitose 33. Além disso, as fatias podem ser tratadas com drogas químicas ou pequenas moléculas para medir o impacto da inibição das vias ou moléculas de sinalização sobre a mitose 34,35.

No nosso procedimento descrevemos imagiologia confocal realizada utilizando um disco giratório. A principal vantagem de um microscópio confocal de disco giratório é a velocidade de aquisição. Isso permite que a imagem de várias posições de diferentes fatias de cérebro em uma sessão de imagens ao vivo, com uma alta resolução temporal, e uma qualidade de imagem razoável. Outras configurações, tais como um sistema multi-fotão confocal laser scanning microscópio permitir a possibilidade de obtenção de imagens de alta qualidade profundamente no tecido, onde as células gliais radiais são menos susceptíveis de ser cortada ao nível do processo de basal. Isto irá, por conseguinte, aumentar a probabilidade de imagem progenitores neurais saudáveis. No entanto, este é geralmente associada a um sacrifício da velocidade de aquisição. Este, por sua vez, irá limitar o númemero de posições que podem ser visualizados durante uma sessão de imagens em tempo real, bem como a resolução temporal. Imagiologia de mitose também pode ser realizada através de um microscópio de campo largo. No entanto, neste caso, é melhor a imagem de baixa densidade de células marcadas, em oposição a histona H2B-EGFP ou Syto11, como o brilho global destes reagentes faria imagem muito mais difícil. Além disso, o protocolo descrito aqui utiliza um microscópio invertido. As principais vantagens de um microscópio invertido é a possibilidade de utilizar os objectivos de óleo de alta resolução e a liberdade de movimento quando o microscópio é acoplado com uma plataforma motorizada. Como conclusão, o pesquisador precisa encontrar um equilíbrio entre as vantagens e desvantagens de um determinado set-up eo propósito de um experimento.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores reconhecem o financiamento do NINDS / NIH, R00-NS064197 e NINDS / NIH, R01NS083897 (tanto para DLS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X N2 Life technologies 17502048 for culture medium
50X B27 without vitamin A Life technologies 12587010 for culture medium
DMEM/F12 Life technologies 11320033 for culture medium
Heat-inactivated horse serum Sigma Aldrich H1138-500ml for culture medium
Heat-inactivated calf serum Sigma Aldrich F4135-500ML for culture medium
FGF R&D Sytems 3139-FB-025 for culture medium
EGF for culture medium
10X HBSS Life technologies 14065-056 for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid Sigma Aldrich H4034 dilute to 1 M (pH 7.4)
2.5 M D-Glucose Sigma Aldrich G8769 for the dissection of the embryos
0.9 M NaHCO3 Life technologies 25080-094 for the dissection of the embryos
Low-melting agarose Fisher BP165-25 for generating slices
Syto11 Life technologies S7573 Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I Life technologies A1048301 for culturing slices
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C for culturing slices
Petri dishes for dissection of the embryos
Digital thermometer to measure the temperature of the agarose
Spatula to transfer brains
Paintbrush alternative to transfer brains
Vibratome Leica VT1000s for generating slices
Dissecting microscope dissecting out embryos
Imaging microscope A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber

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References

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Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live… More

Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex. J. Vis. Exp. (88), e51298, doi:10.3791/51298 (2014).

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