Summary
La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.
Abstract
Aunque de corta duración, la mitosis es un proceso de múltiples pasos complejo y dinámico fundamental para el desarrollo de órganos, incluyendo el cerebro. En la corteza cerebral en desarrollo, la mitosis anormal de progenitores neurales puede causar defectos en tamaño y la función del cerebro. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de herramientas para entender los mecanismos de la mitosis progenitora neural. Desarrollo cortical en los roedores es un modelo excelente para el estudio de este proceso. La mitosis progenitoras neurales se examina comúnmente en las secciones del cerebro fijos. Este protocolo se describen en detalle un enfoque para la formación de imágenes en directo de la mitosis en ex vivo rodajas de cerebro de embriones. Vamos a describir los pasos críticos para este procedimiento, que incluyen: la extracción del cerebro, la incrustación de cerebro, vibratome seccionamiento de cortes de cerebro, la tinción y el cultivo de las rebanadas, y time-lapse. A continuación, vamos a demostrar y describir en detalle cómo realizar el análisis posterior a la adquisición de la mitosis. Incluimos resultados representativos frOM este ensayo usando el colorante vital Syto11, ratones transgénicos (histona H2B-EGFP y EGFP-centrin), y en el útero de electroporación (mCherry-α-tubulina). Vamos a discutir cómo se puede optimizar mejor este procedimiento y la forma en que se puede modificar para el estudio de la regulación genética de la mitosis. Imágenes en vivo de la mitosis en rodajas de cerebro es un enfoque flexible para evaluar el impacto de la edad, la anatomía y la perturbación genética en un ambiente controlado, y para generar una gran cantidad de datos con una alta resolución temporal y espacial. De ahí que este protocolo complementa las herramientas existentes para el análisis de la mitosis progenitoras neurales.
Introduction
El objetivo general de este protocolo es describir cómo realizar imágenes en vivo de la mitosis progenitoras neurales en rodajas de cerebro de embriones. El uso de imágenes en vivo de cortes de cerebro en cultivo, este protocolo proporciona un método simple para ensayar múltiples aspectos de la mitosis en células progenitoras neurales en un entorno altamente similar a un entorno in vivo. Se puede aplicar a los cerebros de los animales y / o cerebros mutantes que han sido manipulados con la electroporación en el útero) 1-5. Esta técnica también es ideal para probar el efecto de agentes farmacológicos en la mitosis precursores neuronales ', por la simple adición de un agente al medio de cultivo. En suma, este artículo hará un protocolo técnicamente difícil acceso para los que estudian la neurogénesis.
Durante la neurogénesis, poblaciones progenitoras neuronales distintas someten a divisiones precisas para generar neuronas que finalmente contribuyen a las seis capas corticales del neocórtex 6-8 adultos. Temprano en el desarrollo cortical, la piscina precursor neuronal se expande como células neuroepiteliales (NE) se dividen simétricamente de auto-renovación. Células NE a continuación, se convierten en células gliales radiales (CGR). Inicialmente CGR división simétrica para producir dos nuevos CGR, sin embargo, durante la mayor parte de la neurogénesis, el modo principal CGR 'de la división es asimétrica. En la división asimétrica, 1 RGC da lugar a un nuevo RGC y, o bien una neurona post-mitótico, o un progenitor más especializado (ya sea un precursor neuronal corto (SNP), un glía radial exterior (ORG), o un progenitor intermedio (INP) 2,3,7,9. INP, SNPs, y orgs luego pueden generar neuronas en el sub-ventricular, ventricular, y las regiones basales de la corteza, respectivamente. Por lo tanto, la división celular de los progenitores es un proceso fundamental para la generación de neuronas de la neocórtex.
Numerosos estudios apuntan a una correlación entre los rasgos mitóticas específicas de la CGR y el destino de las células hijas. Haydar et al., Y Takahashi et al.han demostrado que la RGC duración mitótico y aumento de la duración del ciclo celular como neurogénesis continúa, un hallazgo se hizo eco en el seguimiento de los estudios de 10 a 13. Un número de estudios han sugerido que huso mitótico orientación relativa al ventrículo influye en los aspectos de la neurogénesis y corticogenesis, incluyendo tipos de neuronas generadas y ubicación de la progenie en el cerebro, respectivamente 3,10,14-16. Si la orientación plano de clivaje influye directamente en el destino celular es controversial, pero la conclusión es que este mitótico impactos parámetros neurogénesis. Subraya además la importancia de la mitosis es la observación de que muchos genes implicados en la mecánica de la mitosis son cruciales para la neurogénesis y para el desarrollo adecuado del cerebro 17-20.
La mitosis es un proceso dinámico, sin embargo, hasta la fecha la mayoría de los estudios que detallan la mitosis progenitora neural utilizar el análisis de secciones de tejido de imágenes fijas o de progenitores neurales a través de cultivo celular in vitro. Por lo tanto, los métodos convencionales para evaluar la mitosis sólo proporcionan una instantánea de este proceso y no logran descubrir cómo se comportan las células en un tejido. Imágenes en vivo de la mitosis progenitoras neurales se ha convertido en una herramienta fundamental para la comprensión de la función de progenitores neurales. Para ejemplos vea estas referencias 4,8,10,21-25. Varios protocolos pendientes se han publicado para la preparación y obtención de imágenes de cortes de cerebro 26,27. Sin embargo hasta la fecha, un protocolo completo para la formación de imágenes y el análisis de la mitosis no se ha descrito ni demostrado en vídeo.
Esta técnica ofrece varias ventajas significativas sobre análisis fija de secciones de cerebro. Time-lapse análisis de cortes de cerebro permite la generación de un número significativamente mayor de puntos de datos que pueden ser analizados de una manera flexible. En primer lugar, los datos se reunieron en puntos de tiempo individuales en el transcurso de varios minutos o varias horas. Uno puede analizar los puntos temporales individuales (para crear un montaje estático) opueden combinar diferentes puntos de tiempo en películas. En segundo lugar, la imagen confocal de rebanadas permite la generación de los datos en diferentes secciones Z en rodajas de cerebro. Como resultado, las secciones individuales se pueden analizar. Alternativamente, las pilas de secciones individuales se pueden combinar en una proyección de intensidad máxima. En tercer lugar, el análisis se realiza en el contexto de un tejido, que revela cómo las células se dividen con respecto a las células y estructuras vecinas. En cuarto lugar, es ideal para el análisis de mutantes que muestran alguna evidencia de defectos mitótico. Juntos este protocolo ayudará a clarificar los pasos críticos para ayudar a los investigadores que deseen realizar imágenes en vivo de la mitosis progenitoras neurales en sus propios laboratorios.
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Protocol
1. Preparación de Medios (figura 1, paso 1)
- Slice Medio de Cultivo
- 25 ml de medio de cultivo rebanada es suficiente para preparar platos de fondo 5 de vidrio con 2 rebanadas por pocillo.
- En un tubo cónico de 50 ml, añadir 250 l de una solución de N2 100x y 500 l de una solución 50x B27 sin vitamina A. Añadir DMEM/F12 a un volumen de 22,5 ml.
- Filtro de esterilizar la solución y, posteriormente, añadir 1,25 ml de suero de caballo inactivado por calor y 1,25 ml de suero fetal bovino.
- Incubar solución en un baño de agua a 37 ° C durante la duración de la preparación de las rodajas.
- Añadir los factores de crecimiento (FGF y EGF, concentración final de 10 ng / ml y 20 ng / ml, respectivamente) inmediatamente antes del comienzo de la cultura. La composición de este medio ha sido optimizado para promover la supervivencia de las células en cultivo y para aumentar la tasa de proliferación de los progenitores neurales. Esto por lo tanto maximizar la probabilidad aobservar las células mitóticas en el corte.
- Solución Disección HBSS completo
- Preparar 500 ml de HBSS completo mediante la adición de 50 ml de 10x HBSS, 1,25 ml de Hepes 1 M (pH 7,4, 2,5 mM de FC), 6 ml de 2,5 M de D-glucosa (FC 30 mM), 2,2 ml de 0,9 M de NaHCO3 (FC 4 mM) y tratado en autoclave diH 2 O para un volumen final de 500 ml.
- Solución esterilizar Filtrar y almacenar a 4 ° C hasta que la colección de cuernos uterinos del ratón embarazada. Esta solución puede mantenerse a 4 ° C durante semanas.
- Mantenga HBSS en hielo durante todo el procedimiento de disección.
- Incorporación de solución
- Para la incorporación de 4 cerebros embrionarios, preparar 30 ml de 3% de agarosa de bajo punto de fusión de la solución completa HBSS. En un tubo de 50 ml Erlenmeyer y añadir 0,9 g de bajo punto de fusión de agarosa y lleno HBSS a 30 ml.
- Mezclar la solución con un vórtex, y se funden en un horno de microondas con la posición del tubo y la tapa abierta.
- Mientras que en el horno de microondas, controlar la solución a pdesbordamiento Revent debido a la excesiva de ebullición. Cuando hierva se inicia, detenga el microondas y agite la solución.
- Repita estos pasos hasta que toda la agarosa se haya derretido.
- Guarde el tubo en un baño de agua a 42 ° C.
2. Disección de los embriones (Figura 1, Paso 2)
- Después de una cuidadosa eutanasia del ratón embarazada, recoger los cuernos uterinos y transferirlos a una placa de 10 cm 2 de Petri que contiene HBSS frío lleno 1x. La edad del embrión puede variar dependiendo del estudio. Este protocolo ha sido utilizado con éxito para el cultivo de cortes de cerebro de días embrionarias E12.5 a E17.5. Debido a su tamaño, los cerebros más jóvenes tienden a ser más difícil de trabajar.
- Recoger los embriones y diseccionar el cerebro embrionarias como se describió anteriormente en la rata y el ratón 26,27, hasta que se obtiene un cerebro embrionario completo, incluyendo el cerebro posterior y el cerebro anterior con los dos hemisferios cerebrales. Estos pueden sermantenerse a temperatura ambiente hasta que todos los cerebros han sido disecados.
- Recoger los embriones y diseccionar el cerebro embrionarias como se describió anteriormente en la rata y el ratón 26,27, hasta que se obtiene un cerebro embrionario completo, incluyendo el cerebro posterior y el cerebro anterior con los dos hemisferios cerebrales. Estos se pueden mantener a temperatura ambiente hasta que todos los cerebros han sido disecados.
3. Incorporación de los cerebros de embriones (Figura 1, Paso 3)
- En un cubo con hielo, crear un agujero en el hielo para insertar los moldes que encajan en los.
- Verter el medio de agarosa al 3% en un molde de plástico y colocar ese molde en el agujero preparado en el hielo.
- Se agita el medio de agarosa con la punta de un termómetro digital hasta que la temperatura alcanza 35 ° C.
- Transferir rápidamente la zona del cerebro en el medio de inclusión.
- Paso Crítico: Para eliminar el exceso de HBSS en la interfase entre el cerebro y la agarosa, cuidadosamente y secar con cuidado / rotar el cerebro en varias ocasionesen la solución de la incrustación con los fórceps.
- Un amortiguador de agarosa gelificada se forma en la parte inferior del molde en contacto con el hielo. Una vez que el cojín se puede sentir con la punta del fórceps mientras se agita el cerebro, posicionar el cerebro con el lado dorsal hacia arriba. El cerebro no debe hundirse hasta el fondo del molde.
4. Preparación de agarosa Bloquear (Figura 1, Paso 4)
- Deje que la agarosa se endurezca en el hielo durante al menos 5 min.
- Uso de una hoja de afeitar, la sección de las esquinas del molde.
- Tallar cuidadosamente un bloque de agarosa alrededor del cerebro usando una cuchilla de afeitar. Trate de minimizar el número de cortes para evitar perturbar el cerebro incrustado.
- Asegúrese de que el bloque tiene un área de superficie más grande en la región caudal del cerebro (en comparación con la región rostral, ver Figura 1, Paso 4) para aumentar la estabilidad del bloque en el pedestal de seccionamiento.
- El último corte debe ser el uno en el lado caudal del cerebro;este corte definirá el plano de corte correcta con el vibratome.
- Hacerlo mediante la alineación de la cuchilla perpendicular al eje rostro-caudal del cerebro y el bloque de agarosa. Deslice hacia abajo la cuchilla en sentido caudal a lo largo del eje rostro-caudal y hacer el corte final de unos 5 mm de la región más caudal del cerebro.
- Ajuste el bloque de agarosa / cerebro de lado y repita la incrustación de otros cerebros.
5. Transferencia de los cerebros incrustados en la bandeja del Vibratome (figura 1, paso 5)
- Añadir una gota de pegamento en la parte inferior de la bandeja de vibratomo. Coloque pegamento de modo que los bloques de agarosa se colocarán dentro de alcance de la cuchilla que vibra.
- Coloque el lado caudal de bloques de agarosa / cerebro hacia abajo en el borde de la espátula, con aproximadamente 50% de la inflexión bloque sobre el borde de la espátula.
- Aplicar la cara caudal del bloque de agarosa para el pegamento y deslice la espátula de distancia, manteniendo el bloque de agarosa a la parte inferior de la bandeja con la shoulder de un par de pinzas. No deje que la espátula en contacto directamente con el pegamento.
- Deje que el pegamento se solidifica a temperatura ambiente durante 5 min.
6. Seccionamiento de los cerebros Embedded (figura 1, paso 6)
- Llene la bandeja vibratome con HBSS.
- Defina las posiciones inicial y final de la hoja vibratome.
- Generar 200-250 micras rodajas. Con el vibratome VT1000S, utilice los siguientes parámetros: velocidad 2-4, frecuencia 8.
- Retire con cuidado los trozos de la vibratome ya que se cortan. Transfiera las rebanadas con una espátula y el back-end de pinzas en placas de 12 pocillos llenos de plena HBSS. Alternativamente, algunos investigadores han utilizado un pincel en lugar de pinzas Punto clave:. Durante el traslado, tenga cuidado de que siguen siendo los cortes de cerebro asociadas a la agarosa circundante.
7. Syto11 La tinción de las rebanadas (Figura 1, Paso 7)
- Diluir Syto11 a una concentración final de0,5 a 1 mM en el medio de cultivo rebanada complementan con factores de crecimiento.
- En el pocillo de una placa de 12 pocillos, se incuban las rebanadas de un cerebro en 2,5 ml de la solución de tinción durante 1 hora a 37 ° C.
- Lavar las rodajas en 2,5 ml de medio de cultivo de cortes sin manchar solución durante 20 min.
8. Montaje del Slices en un plato de fondo de vidrio (Figura 1, los pasos 8, 9)
- Preparar 15 l de la incrustación de solución de colágeno por porción. Preparar una solución de 1,5 mg / ml de colágeno mediante la mezcla de 375 l de 3 mg de solución de I / ml de colágeno de tipo con 75 l de 10x DMEM, 9,4 l de NaOH 1 M, y 290 l de H 2 O. Almacenar en hielo.
- Coloque una gota 15 l de la solución de colágeno en la parte inferior de una parte inferior de 35 mm de cristal de micropocillos de plato. Corre con una punta de pipeta para que coincida con el tamaño de la porción.
- Transfiera la rebanada en la gota de colágeno con una espátula y pinzas Punto clave:. Montaje varios sectores en diferirplatos rentes aumenta la probabilidad de adquirir rebanadas adecuados para la imagen. Pantalla a través de diferentes sectores y seleccionar las que mejor se adaptan a los criterios descritos a continuación en la sección "Resultados representante".
- Deje que los cortes se incuban a temperatura ambiente durante 10 min antes de transferirlos a una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Después de 20 minutos, añadir 1,2 ml de medio de cultivo rebanada en el fondo del plato de micropocillos Glass. Añadir 600 l de medio a la vez y se extendió con una punta de pipeta.
- Captura de una imagen de bajo aumento de la rebanada de cerebro para registrar el nivel anatómico y la integridad de la rebanada.
9. Imágenes en vivo de las rebanadas (Figura 1, los pasos 10, 11)
- Deje que las rodajas se recuperan en la incubadora por lo menos durante 1 hora y 30 minutos a 37 ° C con 5% de CO 2 antes de imágenes en directo.
- Imagen de las rebanadas con el microscopio de elección, teniendo en cuenta que Syto11 es muy propenso a photobleaching. Aquí una inverted disco giratorio microscopio confocal se utiliza (Andor XD revolución hilado microscopio confocal de disco). Alternativamente, un microscopio confocal de barrido láser puede ser utilizado. Los siguientes parámetros son para el microscopio de disco giratorio de configuración.
- Durante toda la sesión de formación de imágenes en vivo, mantener las rebanadas a 37 ° C, 5% de CO 2 en una cámara de incubación humidificada adjunta al microscopio.
- Celdas de imagen con un objetivo 60X de silicio de aceite con una distancia de trabajo de 300 micras, y una apertura numérica de 1,3 (para ejemplos véase las figuras 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Un objetivo aceite 100X con una distancia de trabajo de 130 micras y una apertura numérica de 1,4 (por ejemplo, véase la Figura 4C) también se puede utilizar. La resolución de la cámara es de 512 x 512.
- Imagen de las células en un z-pila 30 micras, con el centro de la Z-pila situada a unos 40 m por debajo de la superficie de la rebanada. Tratando de imagen más profundamente en el tejido puede causar que el objetivo de añadirpresión mecánica en la rebanada. Esto puede afectar a la integridad de la rebanada de cerebro. Si la planificación para hacer reconstrucciones en 3D de las celdas, utilice un z-intervalo de no más de 2 m.
- Ajuste la potencia del láser y el tiempo de exposición para limitar fotoblanqueo. Utilice tiempos de exposición que van de 30 a 200 mseg, dependiendo de la intensidad de la señal de Syto11.
- Con una plataforma motorizada, imágenes múltiples posiciones a través de múltiples cortes montados en 1 plato. Por ejemplo, la imagen de hasta 20 puestos repartidos en 4 rebanadas diferentes en 1 solo plato.
- Para imágenes en directo, utilice una resolución temporal de menos de 5 minutos para permitir la identificación de las diferentes fases de la mitosis. Usando Syto11 y / o histona H2B-EGFP, 4 - 5 horas de imágenes en vivo son suficientes para observar un número significativo de células mitóticas. Sin embargo, si la etiqueta de formación de imágenes escasamente células mitóticas (tales como los conseguidos mediante electroporación en el útero), a continuación, un parámetro de formación de imágenes más larga (durante la noche) es apropiado y funciona nosll.
Nota: El uso de este protocolo, se suele observar una media de 10 células mitóticas por posición. Como se indicó anteriormente, múltiple de imágenes montado rebanadas aumenta la probabilidad de tener un experimento exitoso. Con este enfoque suele identificar células mitóticas en prácticamente todos los experimentos realizados con Syto11 o histona H2B-EGFP.
10. Post-adquisición Análisis de la mitosis (Figura 2)
Todos los procedimientos de esta sección han sido optimizados en Fiji (ImageJ), que es una ventaja, ya que es un software gratuito de código abierto. Otras soluciones de software están disponibles para realizar las mismas tareas, como Metamorph, Imaris y Amira.
- Identificación de mitótico Figuras en Fiji
- Después de abrir el conjunto de datos para una posición como "HyperStack", seleccione un plano z (ver figura 2A para la ubicación de la barra de desplazamiento), donde el tejido y las células se ven saludables (véanse los criterios en la sección de discusión).Desplazarse a través de la dimensión temporal para identificar las células que van a través de la anafase, como lo es la fase mitótica más fácil de identificar.
- Desplácese hacia atrás en el tiempo para identificar el punto en el tiempo en que la célula entra en mitosis (condensación del ADN). La célula puede moverse a través de Z-planos, pero la resolución temporal y los parámetros de pila Z descritos anteriormente se han optimizado para permitir este proceso.
- En una hoja de cálculo, grabar el 4D coordenadas de la celda en el HyperStack (X, Y, Z y tiempo, véase la Figura 2A para visualizar la ubicación de estas cifras en la interfaz de Fiji) cuando entra en la mitosis. Conociendo estas coordenadas evitará contando la misma célula varias veces.
- Desplácese hacia adelante en el tiempo y registrar el momento en que la célula pasa de una fase a otra. Documentar la duración de cada fase mitótica de una célula dada.
- Proceda con otras células, a través del conjunto de datos completo (células múltiples dentro y fuera de las posiciones).
- 3D Reconstruction de las células y la cuantificación de la rotación durante la metafase (Adaptado de Haydar et al, 2003) (Figura 2B).
- Después de haber identificado varias células mitóticas, utilice las coordenadas de una célula y desplazarse hacia adelante en el tiempo hasta el inicio de la metafase.
- Gire todo el "HyperStack" para que la frontera ventricular es plana (con el comando "Imagen / Transformar / Rotar ..."). Utilice la herramienta de "ángulo" para determinar el ángulo de solicitar esta rotación.
- Identificar el plano z, donde la célula de interés es la más visible. En ese plano, utilice la herramienta "rectángulo de selección" para dibujar una selección que incluye toda la celda.
- Identificar los Z-planos que incluyen la célula de interés. Utilice la opción "Imagen / Duplicar" para crear un "sub-stack". En el cuadro de diálogo, deje "HyperStack Duplicate" marcada. El "Slices (z)" parámetro corresponde a los z-aviones incluyendo toda la cell, y los "Marcos (t)" parámetro se corresponde con el punto de tiempo actual.
- Si la resolución es pobre, aumente el tamaño de la "sub-stack" con la "Imagen / Ajustar / tamaño ..." comando.
- Generar una reconstrucción en 3D de la célula en el instante actual, usando el "proyecto Image/Stacks/3D ..." comando. Los parámetros para este comando se muestran en la Figura 2B. La "separación de la rebanada" corresponde al intervalo entre cada una de las imágenes plano z (M). Importante: asegúrese de que la dimensión física (m) de la sub-pila se ha conservado. Si no, la interpolación de los píxeles en la dimensión Z será incorrecta, y la reconstrucción 3D será inexacta.
- Uso de la barra de desplazamiento, girar la reconstrucción 3D resultante de manera que el borde de la placa de la metafase es visible. El número de la trama corresponde al ángulo beta se describe en la Figura 3B, registrar este número. Usola función "ángulo" y el "Analizar / Medida ..." de comandos, medir el ángulo entre la horizontal y una línea bisectriz la placa de metafase perpendicularmente (Figura 2B). Este es el ángulo alfa.
- Anote estos ángulos para todos los puntos de tiempo en metafase de la célula de interés. El ángulo de rotación entre los puntos de tiempo (t) y (t-1) es igual al valor absoluto de la diferencia entre un ángulo a (t) y este ángulo a (t-1).
- Medición de la orientación de la escisión del avión
- 3D reconstruir una célula de interés en un punto de tiempo durante la anafase siguiendo las instrucciones descritas para la reconstrucción 3D de placas de metafase.
- Girar la reconstrucción hasta que los bordes de las dos placas formadas por los cromosomas segregantes son visibles.
- Utilice la herramienta de ángulo para medir el ángulo entre la horizontal (el borde ventricular) y una línea paralela a las dos placas formadas por los cromosomas segregantes. Este es el ángulo del plano de clivaje (Figura 2C).
- Generación de Películas
- A medida que las células se mueven a menudo a través de diferentes z aviones, identificar los z aviones ocupados por la célula durante la sesión de imágenes en directo. Generar una "proyección de intensidad máxima" de estas z aviones utilizando el "/ Pilas Z proyecto Imagen / ..." comando. Guarde la pila resultante como un archivo ". TIF".
- Abra el archivo en la versión 1.45 de ImageJ como Fiji no incluye un plugin estable para la generación de ". Mov" o ". Avi" archivos.
- Utilice la opción "Archivo / Guardar como / ..." comando de ImageJ para generar una película en un formato compatible con las aplicaciones de aguas abajo.
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Representative Results
El éxito de este ensayo y la observación de múltiples células mitóticas durante una sesión de formación de imágenes en vivo dependen en gran medida de tanto la integridad y nivel anatómico de la rebanada de donde se toman las adquisiciones. Como veremos más adelante, el nivel anatómico de un sector es un factor importante. Figura 3A muestra rostro-caudal y medial-lateral lugares en los que hemos tenido más éxito. Para la discusión adicional de este tema consulte Noctor 26. La integridad de la rebanada puede variar en diferentes regiones de la rebanada. Esto se puede determinar antes del comienzo de la de lapso de tiempo (utilizando imágenes de toda la rebanada que en la Etapa 7.6). En una buena zona de un cerebro E13.5 las siguientes observaciones se pueden hacer: muchas células mitóticas se encontraron en la frontera ventrículo, los núcleos en interfase se forma elíptica en lugar de todo el año, y los núcleos en interfase aparecerán relativa columnar de la frontera ventrículo . En una región menos deseable del cerebro, lanúcleos se verá redondeado y un poco desorganizado (compárense las Figuras 3B y 3C, y ver la figura 3D para una foto de una rebanada bien montada).
Cuando se alcanzan las condiciones ideales, este ensayo permitirá la identificación cualitativa de diferentes fases de la mitosis. Estos pueden ser detectados por el análisis del patrón de ADN (véase la Figura 3E para ejemplos de apicalmente división de las células en cada fase de la mitosis). Durante la profase, la condensación del ADN tendrá la apariencia de ADN escasamente marcado (ADN-ricos y pobres regiones de ADN en el núcleo). Durante la metafase, los cromosomas forman un plano en el ecuador del cuerpo de la célula. Dependiendo de la orientación del plano, el patrón de ADN es ya sea (i) una línea gruesa (Figura 3E, vista 1) o (ii) un "roseta" con una región de ADN-pobres en el medio (Figura 3E, vista 2) . Durante la anafase cuando los cromosomas se separan, se ven como "manos"; que migran en direcciones opuestas. Esta fase puede ser difícil de identificar cuando el plano de clivaje se encuentra en el plano x - Y de adquisición. Durante la telofase, el ADN se relaja y adquiere una forma elipsoide como las reformas de la envoltura nuclear. Puntos de tiempo individuales se pueden recoger para visualizar la mitosis en el tiempo (ver Figura 3F).
Además de formación de imágenes de la mitosis de células progenitoras que se dividen apicalmente, este ensayo se puede utilizar para la imagen basalmente células en división tales como orgs o INP, el último de los cuales es más probable representado en la Figura 3G. Tales células son identificables por su ubicación para la división en la SVZ capa. Sin embargo, para marcar realmente estas células es mejor pareja es el análisis con la expresión de un marcador fluorescente que etiqueta el proceso de la célula o el destino (véanse las figuras 4B-D). INP no tendrá ni un proceso apical ni basales, orgs tendrá un proceso basal con su cuerpo de la célula se encuentra en las capas externas, y CGR tendrá un BAproceso de sal con su cuerpo de la célula situada en la capa de VZ.
La mitosis de células progenitoras se puede visualizar con métodos alternativos. Figura 4A muestra el uso de la histona H2B-EGFP ratón transgénico para etiquetar los cromosomas de todas las células en división. Esto marca las células en un patrón similar al Syto11. Figura 4B representa imágenes realizadas con un cerebro en el útero a electroporación con EGFP-α-tubulina y la histona H2B-mCherry. Como se ha demostrado, esto permite una para visualizar ambas microtúbulos y el cromosoma, y, además, el cuerpo de la célula y el proceso basal. Figura 4C representa de formación de imágenes realizado con cerebro de un ratón Centrin-EGFP, en el útero a electroporación con mCherry-A-tubulina y la histona H2B-EGFP . Como se ha demostrado, éste permite a los cromosomas de imagen y centríolos en el canal verde y el huso mitótico y la célula de cuerpo / proceso en el canal rojo. Figura 4D representa de formación de imágenes realizado con el cerebros en el útero a electroporación con CMV-Cre escasamente y CALNL-EGFP 28. Esta técnica permite a uno escasamente etiqueta progenitores en división, por lo que el análisis de células que se dividen individuales más fácil. Cuando se utiliza la electroporación sin embargo, tener en cuenta que este método se dirige a una cohorte bastante sincronizada del ciclo de las células 2,12. Esto significa que el momento de formación de imágenes en vivo con respecto a la electroporación necesita ser ajustado, de modo que la cohorte de células sometidas a electroporación se acerca la mitosis en el comienzo de la sesión de formación de imágenes. Si no es así, el éxito del experimento en la identificación de las células mitóticas puede verse comprometida en una sesión de imágenes corto plazo.
Cuando se alcanzan las condiciones ideales, las características clave de la mitosis se pueden medir cuantitativamente incluyendo la duración de la mitosis en general, la duración de las fases individuales, la rotación del plano de la metafase y orientación del plano de la escisión. En las condiciones descritas, se ha observado una duración mitótico global promedio de 1 hora30 min en días embrionarias (E) 13,5 y 14,5. Como se ha descrito anteriormente, la rotación del plano de ADN metafase se puede medir en un punto de tiempo individual o acumulativamente sobre la duración de toda una metafase 2,6,9,10. Esto se puede lograr utilizando la reconstrucción 3D del plano de la metafase de una célula en cada punto de tiempo y la medición de ángulos de ADN en relación con el ventrículo. Hemos aplicado con éxito el método en este trabajo para seguir las células durante al menos 3 horas.
Figura 1. Representación esquemática de los pasos en el protocolo. Tiempo necesario para cada paso se indica en cada uno de los pasos. Los detalles de cada una de estas etapas se describen en la sección "protocolo". Por favor, tenga en cuenta que el paso 7 se puede omitir al imaginar rebanadas de hiembriones piedra H2B-EGFP, o rodajas de cerebro que se sometieron a electroporación con plásmidos que expresan marcadores para la mitosis.
Figura 2. Análisis post-adquisición de time-lapse microscopía de conjuntos de datos de vídeo en Fiji (ImageJ). A) Localización de las diferentes herramientas utilizadas para el análisis en Fiji. B) Los diferentes pasos involucrados en la reconstrucción 3D de una célula en metafase. Los detalles de cada una de estas etapas se describen en la sección "protocolo". C) Medida de la orientación del plano de clivaje en 3D reconstruye células en anafase. Por favor, tenga en cuenta que los números en B Paso 6 y C muestran la secuencia seguida para medir el ángulo. D) Los datos representativos que muestran la distribution de la duración de la metafase de un grupo de células mitóticas observado en la frontera ventricular en rodajas de cerebro de E13.5 (n = 35). E) Los datos representativos que muestran la rotación acumulativo de placas de metafase en células mitóticas E13.5 en la frontera del ventrículo . Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Ejemplos de datos representativos a partir del análisis de imágenes en directo. A) A lo largo del eje dorso-ventral, la mitosis se crea una imagen más fácilmente en las regiones dorsales de rodajas de cerebro, porque el proceso basal de CGR es más corto y por lo tanto menos probabilidades de ser cortado por vibrátomo. A lo largo del eje rostro-caudal, rebanadas en las regiones caudales de la corteza dorsal danresultados más consistentes en nuestras manos Ejemplos. B y C) se muestran de una buena zona (B) y una mala zona (C) para la obtención de imágenes. En una buena zona, los núcleos tienen una forma elíptica (regiones con un círculo) y muchas células mitóticas se observan en la frontera del ventrículo antes de time-lapse (flechas). En un mal región, muy pocas células mitóticas se observan en la frontera del ventrículo (flecha simple) y los núcleos son redondos (regiones con un círculo). D) Ejemplo de una buena tajada observado con un microscopio de bajo aumento antes de imágenes en directo. E) Ejemplos de Syto11 etiquetados células en diferentes fases de la mitosis, como se ha señalado F) Montaje de una región en la frontera del ventrículo donde dos progenitores neurales pasan a través de las diferentes fases de la mitosis, marcada en diferentes colores (tiempo, hh:. mm). G) Montaje de una región resaltada en (B) cuando un progenitor neuronal divide en lejos de la frontera ventricular. En montajes (D) y (E), cells fueron seudo color utilizando Photoshop para resaltar las diferentes fases de la mitosis. (Barras de escala: B, C, F: 10 m; D: 1 mm, E, G: 5 m).
Figura 4. Ejemplos de herramientas de alternativas para visualizar la mitosis de células progenitoras neurales. A) Montaje de una región en la frontera del ventrículo en una corte de cerebro de un embrión transgénico histona H2B-EGFP en E13.5. Se observa Uno progenitoras a medida que avanza a través de las diferentes fases de la mitosis. B) Montaje de un VZ en E14.5 en la rebanada de un cerebro que se sometió a electroporación en E13.5 con vectores que expresan EGFP-A-tubulina y H2B-mCherry. EGFP-A-tubulina permite la visualización de la dinámica de microtúbulos durante la mitosis (B-1 B 2) C) Montaje de una región ventricular en unn E15.5 cerebro de un embrión transgénico Centrin-EGFP que fue a electroporación en E14.5 con plásmidos que expresan mCherry-a-tubulina y H2B-EGFP. Centrin-EGFP permite la visualización de la dinámica centríolos durante la mitosis (C 1 y C 2). D) Montaje de una región que muestra el IZ de una rodaja de E14.5 cerebro donde las células fueron etiquetados por la baja densidad de la electroporación en E13.5 mínima concentración de un plásmido que expresa Cre y una concentración estándar de un plásmido que expresa EGFP después de Cre recombinación 28. La célula que se divide en este montaje tiene la morfología de un RGosvz con un proceso largo basal (flechas rosas) y hay un proceso apical 9. El objetivo utilizado para la formación de imágenes en vivo de la (A) y (B) ejemplos es un objetivo 60X de aceite de silicona, aceite de 100X objetivo, por ejemplo, (C), y el objetivo de aire 10 veces, por ejemplo, D. La resolución temporal utilizado para la imagen (A) , (B), (C), y (D) eran ejemplos 4 min, 4 min, 30 seg, y 5 min, respectivamente. VZ: Ventricular Zuno, IZ: intermedio Zone, RGosvz: radial zona subventricular exterior por células glia similares. (Las barras de escala: A: 15 micras, B, C, D: 5 m, C 1, C 2: 2,5 m) Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
La principal ventaja del protocolo que hemos descrito es que proporciona una resolución temporal dinámica de la mitosis de células progenitoras neurales. Por lo general, los ensayos de visualizar la mitosis en el cerebro en desarrollo se realizan utilizando inmunofluorescencia de secciones de tejido fijadas. Pero este enfoque sólo ofrece una instantánea de la mitosis en un punto del tiempo.
Hay varios pasos que son más críticos para obtener imágenes de mitosis en rodajas de cerebro: 1) Los cortes de cerebro deben permanecer unidos a la agarosa, para preservar la integridad de las secciones del cerebro durante el traslado y montaje. 2) Para la generación y obtención de imágenes de cortes, el control de los niveles de rostro-caudal es importante. Rodajas de cerebro de Caudal son típicamente mejor, ya que en estos sectores, los procesos basales de la RGC se mantendrán intactos, lo que es más saludable para las células. 3) En el caso de imágenes en vivo, el uso de un microscopio confocal de disco giratorio con un objetivo 60X es mejor para los dos de alta resolución y evitar photobleaching de sejemplos, que pueden ocurrir con el tinte Syto11. 4) En el caso de imágenes en vivo, los parámetros temporales de adquisición son fundamentales. Dependiendo del equipo de microscopio usado, de lapso de tiempo se puede realizar desde cada minuto a cada 10 min. En más del 10 min es típicamente demasiado tiempo para lograr la dinámica de alta resolución de la mitosis.
Este protocolo tiene ciertas limitaciones. El experimento se realiza con el tejido vivo ex. Es concebible que las observaciones hechas en rodajas de cerebro podrían ser diferente in vivo. Por lo tanto, cuando se hacen comparaciones entre experimentos realizados en días diferentes o utilizando diferentes muestras, los siguientes parámetros deben mantenerse constante: el uso del rostro-caudal y dorso-laterales niveles similares, contenidos de los medios de comunicación, el uso de microscopio y parámetros de adquisición. Además, la fototoxicidad es posible con formación de imágenes a largo plazo. Por lo tanto múltiples experimentos deben llevarse a cabo antes de hacer conclusiones. Además, la propia Syto11 podría potenteially influir en los acontecimientos mitóticas, especialmente en un fondo mutante. Por lo tanto se recomienda que cuando uno hace conclusiones acerca de la mitosis basado en Syto11, que también confirman los hallazgos usando ensayos independientes, tales como marcadores descritos en la Figura 4.
Como se describe en el protocolo, la mitosis se pueden obtener imágenes después de marcar cromosomas y el citoesqueleto de diversas maneras. Otros colorantes SYTO se pueden utilizar para visualizar la mitosis en otros canales fluorescentes. En lugar de usar tinción Syto11 para visualizar el ADN, las rebanadas se pueden generar a partir de las líneas transgénicas fluorescentes. Por ejemplo, como se ha demostrado, la histona H2B-EGFP líneas transgénicas se pueden utilizar 29. El uso de la histona H2B-EGFP es particularmente útil y recomendado para la confirmación de cualquier fenotipo observado con el tratamiento Syto11. Además, también podría ser útil para superar los retos asociados con fotoblanqueo con Syto11. El uso de otras líneas transgénicas, tales como centrin-EGFP 30, puedeser utilizado para visualizar centriolos, los componentes de los centrosomas. Mientras que éstos por sí sola no sería suficiente para la visualización de la mitosis, que funcionan bien en combinación con otros marcadores de cromosomas o los microtúbulos. Tales marcadores pueden ser introducidos por electroporación en el útero 4,5,10,31,32. Como se ha demostrado, la expresión de proteínas de fusión de un día antes de la disección puede ser útil para este enfoque. En nuestra experiencia, expresando construcciones bajo un promotor CAG a menudo puede producir sólida expresión dentro de un día. Por ejemplo hemos introducido α-tubulina y la histona H2B-EGFP en los cerebros de embriones utilizando este enfoque.
Una vez que esta técnica se domina hay modificaciones adicionales que se pueden hacer para futuros experimentos. En electroporación el útero también puede ser utilizado para manipular la expresión génica. Por ejemplo, la introducción de shRNA o ADNc puede ser útil para determinar el impacto de la pérdida de función o la sobre expresión de un gen de interés en PROG neuronalenitor la mitosis 33. Además, las rebanadas se pueden tratar con medicamentos químicos o moléculas pequeñas para medir el impacto de la inhibición de las vías o moléculas de señalización en la mitosis 34,35.
En nuestro procedimiento de formación de imágenes se describe a cabo utilizando un confocal de disco giratorio. La principal ventaja de un microscopio confocal de disco giratorio es la velocidad de adquisición. Esto permite que la obtención de imágenes de múltiples posiciones de diferentes secciones de cerebro en una sesión de imágenes en vivo con una alta resolución temporal, y una calidad de imagen razonable. Otras configuraciones tales como un multi-fotón microscopio confocal de barrido láser ofrecen la posibilidad de adquirir imágenes de alta calidad profundamente en el tejido, donde son menos propensos a ser cortado en el nivel del proceso basales las células gliales radiales. Por lo tanto Esto aumentará la probabilidad de imagen progenitores neurales sanos. Sin embargo, esto se asocia normalmente con un sacrificio de la velocidad de adquisición. Esto a su vez limitar el númeroBER de posiciones que se pueden obtener imágenes durante una sesión de formación de imágenes en vivo, así como la resolución temporal. Formación de imágenes de la mitosis también se puede realizar en una amplia microscopio de campo. Sin embargo, en este caso es mejor imagen escasamente células marcadas, en oposición a la histona H2B-EGFP o Syto11, como el brillo general de estos reactivos de formación de imágenes haría mucho más difícil. También, el protocolo descrito aquí utiliza un microscopio invertido. Las principales ventajas de un microscopio invertido son la posibilidad de utilizar los objetivos derivados de alta resolución y la libertad de movimiento cuando el microscopio se acopla con una platina motorizada. Como conclusión, el investigador tiene que encontrar un equilibrio entre las ventajas y desventajas de un particular, puesta a punto y el propósito de un experimento.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen la financiación de NINDS / NIH, R00-NS064197 y NINDS / NIH, R01NS083897 (tanto para DLS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1 M (pH 7.4) |
| 2.5 M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9 M NaHCO3 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| Low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| Petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| Digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| Spatula | to transfer brains | ||
| Paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| Vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| Dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| Imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
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