Elektrisk celle-substrat Impedans Sensing til kvantificering af endotelproliferation, barrierefunktion, og motilitet

Summary

Denne protokol anmeldelser Electric Cell-substrat Impedans Sensing, en metode til at registrere og analysere impedans spektrum af klæbende celler til kvantificering af cellevedhæftning, proliferation, bevægelighed og cellulære reaktioner på farmakologiske og giftige stimuli. Påvisning af endotelpermeabilitet og vurdering af celle-celle og celle-substrat kontakter fremhæves.

Abstract

Elektrisk celle-substrat Impedans Sensing (ECIS) er en in vitro-impedans målesystem at kvantificere adfærd af celler i vedhængende cellelag. Til dette formål dyrkes celler i særlige kultur kamre på toppen af ​​modsatrettede, cirkulære guld elektroder. Påføres en konstant lille vekselstrøm mellem elektroderne og potentialet tværs måles. De isolerende egenskaber af cellemembranen skaber en modstand mod den elektriske strøm resulterer i en øget elektrisk potentiale mellem elektroderne. Måling cellulær impedans på denne måde tillader automatiseret undersøgelse af cellevedhæftning, vækst og morfologi, funktion og motilitet. Selvom ECIS selve målingen er ligetil og let at lære, den underliggende teori er kompleks og udvælgelse af de rigtige indstillinger og korrekt analyse og fortolkning af data er ikke selvindlysende. Men en klar protokol beskriver de enkelte trin fra den eksperimentelledesign til forberedelse, gennemførelse og analyse af forsøget er ikke tilgængelig. I denne artikel princippet om grundlæggende måling samt mulige anvendelser, er eksperimentelle overvejelser, fordele og begrænsninger ved ECIS systemet diskuteret. En guide stilles til rådighed for studiet af cellevedhæftning, breder og våbenspredning kvantificering af celle adfærd i en sammenflydende lag med hensyn til barriere funktion, celle motilitet, kvaliteten af ​​celle-celle og celle-substrat sammenvoksninger, og kvantificering af sårheling og cellulære reaktioner på vasoaktive stimuli. Repræsentative resultater diskuteres baseret på human mikrovaskulære (MVEC) og menneskelige navlestrengen vene endotelceller (HUVEC), men gælder for alt vedhængende voksende celler.

Introduction

ΩΩΩHere vi præsenterer Electric Cell-substrat Impedans Sensing, der er kendt som ECIS, en særlig metode til at måle og analysere impedans spektrum af adhærente celler i kultur ^1. Formålet med denne protokol er at tilbyde en generelt gældende vejledning for brugen af ​​denne særlige form for impedans baserede cellulære assays og give protokoller for nogle af de vigtigste funktioner fra det konstant voksende antal ansøgninger. Der vil være fokus på studiet af celleproliferation, barriere funktion, celle vejkryds, og celle motilitet.

Siden ECIS og dens tilhørende model til at omdanne impedans spektroskopi data i biologisk relevante parametre blev introduceret i sin nuværende form til det videnskabelige samfund ved Giaever og Keese i 1991 ^2, er det ofte blevet omtalt som et system til måling af TEER (trans -epitel elektrisk modstand), der ikke er korrekte. Forskellene synes marginal i starten, mener vigtige for fortolkningen af ​​data. For klassiske TEER målinger dyrkes celler på gennemtrængelige filtrene til at karakterisere paracellulære transportmekanismer, der er domineret af epiteliale stramme vejkryds eller endotel adherens vejkryds ^3. Sædvanligvis er to elektroder anbragt over og under det filter, der anvendes til at anvende en jævnstrøm (DC) strømmer over cellelaget og to andre elektroder til at måle den resulterende spændingsfald ^4. Den elektriske modstand er beregnet ved hjælp af Ohms lov, som giver en numerisk beskrivelse af kvaliteten af ​​cellen barriere.

ECIS følger dette grundlæggende princip og udvider det. I ECIS systemet dyrkes celler på modsatrettede, cirkulære guld elektroder, der er indlejret i bunden af ​​særlige cellekultur retter. Antallet af elektroder pr dyrkningsbrønd er variabel, afhænger af anvendelsen, og elektroderne har en standard diameter på 250 um, og i nogle tilfælde et større modelektrodeanvendes til at fuldende kredsløbet. ECIS anvender en konstant vekselstrøm (AC) på 1 uA med en given frekvens i stedet for en jævnstrøm. Impedansen er beregnet ud fra de tilsvarende ændringer i spænding (i mV) mellem elektroderne. ECIS giver mulighed for at måle impedans over et område af frekvenser for at studere frekvens afhængige cellulære egenskaber, som har flere fordele i forhold TEER og vil blive forklaret i detaljer i denne artikel. Først måler komplekse impedans tillader adskillelse af samlede impedans i cellebarriere modstand og celle kapacitans. Desuden ved at data på flere frekvenser og anvender en matematisk model, kan man skelne mellem forbindelsesepitop impedans (tæthed af celle-celle-kontakter) og impedans forårsaget af celle-substrat-vekselvirkninger (afstande af basalcelle membranen til underliggende matrix) samt bidrag af cellemembranen kapacitans. For det andet kan celleproliferation og motilitet vurderes, idet cellens er i direkte kontakt med elektroderne. For det tredje, substrat og elektroder er tilstrækkeligt tynde for at tillade lys felt og fasekontrast mikroskopi.

Grundlag for impedansmålinger: Den komplekse impedans

Grundlaget for måling af den elektriske impedans af biologiske objekter (fx celler) er Ohms lov, en grundlæggende elektro-teknisk princip, der beskriver forholdet mellem modstanden (R), (I) og spænding (U) i et elektrisk kredsløb på et givet tidspunkt (t).
Gælder i DC kredsløb: R (t) = U (t) / I (t)

Når du arbejder i AC-system, strøm og spænding ikke kun forskellige i deres amplitude, men også i deres fase (φ). Nu er modstanden er ikke længere tilstrækkeligt til at beskrive disse forbindelser. I stedet for komplekse impedans (Z), eller i de fleste tilfælde størrelsen af ​​den impedans (| Z |) anvendes, indeholder den tidligere beskrevne ohmske modstand plus reaktans (X), der retater fra AC strømme gennem kondensatorer og spoler kørsel faseskiftet mellem spænding og strøm ^5.
Gælder i AC-kredsløb: | Z (f) | = √ ^(R2 + X (f) ²⁾
φ = arctan (X / R)

Når der udføres impedans målinger på intakte celler, på grund af de særlige kendetegn ved deres membran, fungerer celler som en parallel tilslutning af modstand og kondensator. Her modstand repræsenterer modstand strømmen, mens kapacitans (C) beskriver adskillelsen af ​​elektriske bærere på isolerende bi-lag af cellemembranen, der forårsager polarisering af cellen. Derved X er domineret af de kapacitive egenskaber cellemembranen.
X (f) ≈ (2 * Pi * f * C _Cell) ^-1

Da X er frekvensafhængig, variation af den målte frekvens muliggør undersøgelse af forskellige funktionelle og strukturelle egenskaber af cellen. ECIS anordning måler både R og X, muligt at beregneaf | Z |, C og φ.

Kvantificering hele cellelag med impedansspektroskopi Den elektriske ækvivalente kredsløb.

Som tidligere nævnt, når en celle bringes i et elektrisk felt, viser egenskaber af passive elektroniske komponenter. Hvis nu, i stedet for en enkelt celle, et helt cellelag dyrket på toppen af ​​elektroderne, og suppleret med cellekulturmedium undersøges, skal udvides til en hel elektrisk netværk simpel model for modstand og kondensator. I denne såkaldte tilsvarende kredsløb, skal overvejes ^3,6 modstand dyrkningsmediet (R _Med) samt kapacitans (C _elektrisk) og resistens (R _elektrisk) at karakterisere interaktionen elektrode / elektrolyt.

En forenklet, generelt eksempel på sådan et ækvivalent kredsløb for en adhærent voksende cellelag kan findes i figur 1.. Fordelen ved en sådan matematisk enMETODE til at beskrive et biologisk system er, at disse kredse kan forfines ad libitum og tilpasset de specifikke eksperimentelle spørgsmål, fx ved at overveje impedans forårsaget af intra-cellulære organeller eller at skelne påvirkninger af celle-celle (R _junc) og celle-substrat sammenvoksninger (R _Sub) på den samlede impedans ^7,8. Ikke desto mindre er det målet, at modellering bør altid være at bruge den mindste række elementer, der beskriver alle funktioner i det målte impedansspektrum at tillade meningsfulde sammenhænge.

Figur 1. Skematisk af ECIS systemet og repræsentativt tilsvarende kredsløb for en vedhængende voksende celler lag. A) Tværsnit af en ECIS kultur godt. Cellerne vokser på toppen af ​​sensing og modelektrode og enre dækket med dyrkningsmedium. Elektroderne er forbundet til en lock-in forstærker og et AC-signal påføres via en 1 MOhm modstand for at skabe en konstant strømkilde. Stimuli kan tilføjes direkte til dyrkningsmediet på ethvert tidspunkt. B) ECIS måler summen af alle individuelle bidrag til impedans. Modstand dyrkningsmediet (R _Med) samt impedans forårsaget af elektrode / elektrolyt-grænseflade, som er for nemheds præsenteret som en parallel kombination af en modstand (R _elektrisk) og en kondensator (C _elektrisk), og også de elektriske egenskaber af cellemembranen, beskrives af en parallelforbindelse af resistens (R _Cell) og kapacitans (C _Mem), alle har brug for at komme i betragtning. R _Cell variabel, da den er afhængig af cellen permeabilitet mod strømmen. Den tilsvarende kredsløb kan udvides og forfinet ad libitum. Som et eksempel forbindelsesepitop (R _Junc) somsamt subendotel (R _Sub) modstand blev tilføjet til kredsløbet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Impedans parametre og deres biologiske betydning

De to mest direkte parametre afledt fra impedansmålinger er modstand og kapacitans af celler. Modstand repræsenterer kvalitet og funktion af cellen barriere, og derfor tager hensyn til modstand mod para-og trans-cellulær strøm. Kapacitans giver et samlet mål for elektrode dækning. Det karakteristiske træk ved ECIS er, at med hjælp af ækvivalente kredsløb og modellering disse globale parametre giver indsigt i mange flere cellulære egenskaber, herunder celle-celle og celle-substrat sammenvoksninger, som vil blive drøftet senere i denne artikel.

Inden du begynder: Eksperimentel considerationer

Setup Måling - Opsætningen består af flere forskellige dele: ECIS enhed med måling elektronik, PC til dataopsamling, matrix holder til 8 - eller 96-godt-system, ECIS arrays og cellekultur af valg. Vifte Indehaveren skal placeres i en inkubator og forbundet med ECIS enheden uden inkubatoren. Pc'en skal udstyres med ECIS software (1.2.123.0 14 februar 2013), og er forbundet til ECIS enhed.

Array valg - Der er et stadigt voksende udvalg af ECIS arrays, der er designet til mange applikationer. De faste matrixer er 8W1E og 8W10E arrays, som er sammensat af 8 dyrkningsbrønde (angivet med W), der omfatter 1 eller 10 måleelektroder (angivet med E), hhv. En stor counter elektrode fuldender kredsløbet, men dens impedans er hovedsagelig ubetydelig i den egentlige måling ^6. Den standard 8-godt-array holder kan rumme to arrays, hvilket resulterer i et samlet antal på 16 dyrkningsbrønde. Guldet elektroder er 50 nm tykt, afgrænset med en isolerende film og monteret på enten et optisk klart Lexan polycarbonat substrat eller et trykt kredsløbskort (PCB). PCB arrays er mere robuste og omkostningseffektiv. De gennemsigtige slides tillader lys og immunofluorescensmikroskopi. Hvad skal overvejes, er, at 1E vifte øger udsving i modstanden signal forårsaget af celle bevægelser og der er behov til sårheling studier. Desuden tillade enkelt elektroder korrelation af elektriske og optiske signaler. I multi elektrode arrays signalet gennemsnit over flere elektroder, der på grund af den øgede måling område omfatter flere celler i målingen, begrænser bias dataene ved ujævn podning og vækst af cellerne og reducerer sløring af signal på grund af celle bevægelser. Derfor multi elektrode arrays er nyttige til at undersøge celleproliferation og barriere formation. Ved siden afstandard arrays der er særlige arrays til rådighed for anvendelsen af forskydningsspænding ^9, for at studere kemotaxis ^10, celle migration og proliferation samt 96-brønds plader til high throughput screeninger. Konklusionen er, at array, der skal anvendes, er stærkt afhængig af videnskabelig spørgsmål, og celletype og bør udvælges og testes omhyggeligt.

Måling frekvens - Modelleringen af Rb og alfa (se data-analyse) kræver frekvensmålinger multi (MFT). Ellers kan måles impedans over tid på én celletype specifik frekvens (SFT), med den fordel, at data kan indsamles med en højere tidsmæssig opløsning. Den mest følsomme måling frekvens for en specifik celletype kan findes ved frekvens scanninger. Når plotte impedans henholdsvis modstand vs frekvens i en log-log graf, den frekvens, hvor forskellen mellem celle-fri og celle-dækket elektrode største er den frekvens, hvor cellerne blokere than aktuel mest effektivt. I tilfælde af endotelceller (EF) denne frekvens er på omkring 4 kHz.

Podningstæthed - Som i enhver almindelig celle-baserede eksperiment podningstæthed afhænger af den videnskabelige problem. Når man studerer vedhæftning og spredning eller barriere dannelse bør endotelceller seedes med en høj tæthed af 40.000-60.000 celler / cm ² for at garantere et sammenflydende, stabil barriere efter 48 timer. Hvis fokus af forsøget er på proliferation bør endotelceller podes med en lav densitet på ca 2,000-10,000 celler / ^cm2.

Protocol

1.. Fremstilling af Målesystem

1. Forvarm array holder i en inkubator til 37 ° C, før du starter eksperimentet for at forhindre kondens.
2. Fyld vand kiste af kuvøsen med destilleret vand for at undgå udtørring af brøndene.
3. Udfør alle manipulationer på celler og arrays i et lagdelt stinkskab under sterile forhold.

2. Fremstilling af arrays og Podning af celler

BEMÆRK: ECIS arrays skal rengøres og stabiliseret før et eksperiment for at forhindre elektrode afdrift, for at forbedre velhavende godt reproducerbarhed og signal-til-støj-forhold. Derfor er der to muligheder: A) forbehandling af elektroder med L-cystein og B) funktion ECIS stabilisering.

Mulighed A: L-cystein anbefales som den mest konsekvente forbehandling, men kan i nogle særlige tilfælde interagerer med protein coatings på elektroderne. De præsenterede volumener anvendes til standard 8-brønds arrays.

1. Tilsæt 200 ul / brønd 10 mM L-cystein. Cystein renser og modificerer elektrodens overflade giver en høj og reproducerbar elektrode kapacitans.
2. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).
3. Vask to gange 500 ul / brønd med ultrarent vand (type 1). Brug ikke phosphatpuffere, som kan interferere med adsorption af nogle proteiner. Også undgå serumholdige opløsninger før belægning, da guld overflade adsorberer de første makromolekyler bragt i kontakt med.
4. Coat med 200 ul / brønd varm 1% gelatine.
5. Inkuber 30 min ved 37 ° C.
6. Fjern gelatine, men lad ikke overfladen tørre. Dette kan beskadige elektroderne.
7. Vask en gang med ultrarent vand (type 1).
8. Tilsæt 400 gl / brønd komplet celledyrkningsmedium (indeholdende serum, antibiotika og alle vækstfaktorer).
9. Slide array i matrix holder end Sørg for, at array er placeret således, at de ni guld firkantet pads er korrekt kontaktet af fjederbelastede pogo pins og fix justeringsskrue hånd stramt. Vær forsigtig med gennemsigtige arrays kan guldlaget let blive beskadiget.
10. Åbn måling software og trykke på Opsætning efterfulgt af Check i "Indsamlingshjemmel" for at udføre en hurtig impedans måling af hver enkelt godt. De resulterende værdier er målingen baseline og vil automatisk blive gemt i "Kommentarer".
11. Brønden check, vil automatisk bestemme typen af ​​ECIS arrays anvendes. Bekræft de valgte arrays i afsnittet "Well konfiguration".
12. Array diagram lyser grønt for korrekt tilsluttet brønde og rød for tomme eller forkerte tilsluttede brønde. Alligevel altid sørge for, at arrays blev anbragt korrekt i holderen.
    BEMÆRK: Hvis rengøring og belægning var det lykkes 8W1E ECIS arrays har acapacitance på omkring 5 nF og 8W10E arrays af 50 nF, hvilket resulterer i en baseline modstand på omkring 2.000 og 200 Ω hhv.
13. Fjern array fra holderen.
14. Seed celler som en enkelt cellesuspension i 400 ul / brønd komplet celledyrkningsmedium.

Mulighed B: Funktionen af ECIS stabilisering kan bruges som et alternativ eller i kombination med L-cystein behandling, og hvis problemer med elektrode afdrift eller store forskelle i velstående godt modstand og kapacitans forekomme.

1. Udfør cystein behandling (ekstraudstyr) og forbelægning elektroder med protein (ekstraudstyr).
2. Der tilsættes 200 gl / brønd af komplet medium til hver brønd og placere array array holderen.
3. Åbent måling software og trykke på Opsætning efterfulgt af Kontrollér at fastslå array er korrekt tilsluttet og at måle indledende Z, R og C.
4. Stabilisere elektroderne ved at trykke (ca. 3 mA), høj frekvens (64 kHz) puls til at rense elektroderne.
5. Tjek elektroderne igen. Kapacitans bør øges, og modstandsværdier skal være i en sammenlignelig rækkevidde.
6. Hvis kapacitans og modstand værdier er stadig ikke tilfredsstillende, gentages stabilisering.
7. Fjern array fra holderen og pode celler.

3. Opsætning Måling Software og dataopsamling

1. Placer array array holderen som beskrevet ovenfor.
2. Åbent måling software og tryk på knappen Setup i "Indsamlingshjemmel" for at forbinde ECIS software til den ECIS instrument og køre et andet godt Check.
3. Bekræft de valgte arrays i afsnittet "Well konfiguration".
4. Vælg de brønde, der skal måles i "Well CONFIGURATion sektion ".
5. Vælg den målemetode fra "Indsamlingshjemmel" muligheder:
   1. For en tidsserie på en fast frekvens, skal du vælge Enkelt Freq. / Time (SFT), og vælg målingen frekvens fra rullemenuen.
   2. Til måling af elektrode dækning og modellering af Rb og Alpha, vælge flere Freq. / Time (MFT). ECIS Enheden vil måle automatisk på alle tilgængelige frekvenser.
   3. For mikrobevægelse (se dataanalyse) Vælg Rapid Time Collect (RTC) og juster måling frekvens og samplingfrekvens. Her standard tidsmæssige opløsning er én prøve pr sekund (1 Hz), men samplingsfrekvensen kan også øges til at spore hurtige ændringer i impedans op til 25 Hz (for Z-Theta). Vigtigt: i RTC-tilstand kun et enkelt godt måles.
      BEMÆRK: Hvis mikrobevægelse skal måles i flere brønde senere, gå til Hjælp> Vis ekspert værktøjslinje / menupunkter> Acquire> Multi-Well RTC. Angiv Frist (HR) i indsamle data delstrækning ECIS vil nu måle de udvalgte brønde i numerisk rækkefølge. Efter start af målingen vil softwaren bede om at angive antallet af cyklusser. Indtast værdien for hvor ofte målingen skal gentages.
6. For SFT og MFT vælge tidsintervallet (sek) mellem målingerne, eller hvis data skal erhverves så hurtigt som muligt lade denne indstilling markeret.
   BEMÆRK: For at erhverve data ECIS enheden anvender en multiplexer til at skifte fra en brønd til en anden med et minimum SFT erhvervelse på 0,25 sek og 7,5 sek MFT. Betydning intervallet er afhængig af antallet af udvalgte brønde og frekvenser. For målinger på langsomme prolifererende celler eller en simpel registrering af modstand mod tiden, brug intervaller på 600 sekunder eller mere.
7. Tryk på Start, navngive filen og vælge placering til at gemme data.
   BEMÆRK: Filstørrelse bør ikke være en PRoblem, da ECIS data gemmes i en slags almindelig tekst format kaldet *. ABP, som aldrig overstiger flere hundrede MB selv med alle måle-frekvenser og antal brønde valgt.
8. Stop køres ved at trykke på Afslut.

4.. Medium Forandring og cellemodificering

1. Tryk på Pause, vil det stoppe datafangst, men fortsætter med at køre den eksperimentelle ur.
2. Fjern array fra holderen og manipulere det under en laminar strømning bænk (dvs. ændring medium).
3. Placer matrix tilbage i holderen og enten klikke på Kontroller Connection eller Genoptag eksperiment for at fortsætte dataopsamling. Målingen software vil placere et tidspunkt mærke i datasættet.

5.. Akut stimulering under dataopsamling

BEMÆRK: En anden mulighed er at manipulere cellerne under datafangst til at følge øjeblikkelige ændringer. Dette er kun muligt; Når prøverne ikke skal være sterilt i det videre forløb af forsøget.

1. Føj stimulus direkte til brønden og sørg for at blande forsigtig med en 200 gl pipette.
2. Mark tidspunkt manuelt ved at trykke Mark og tilføje en kommentar.

6.. Elektrisk Anskydning

BEMÆRK: At finde de rigtige indstillinger for den anvendte celletype er nøglen til elektrisk sårdannelse. Hvis såret er for kort dette kan resultere i utilstrækkelig fjernelse af celler, hvorimod hvis såret er for lang og / eller ru kan det beskadige elektroderne (især på de transparente arrays). Derfor er der flere korte sårede pulser anbefales. For HUVEC kulturer to 10-20 sek lang sårede pulser af 5 V ved 60 kHz hver er fundet en optimal brug af ECIS 1600R. Generelt anbefales det at bruge høje frekvenser> 20 kHz for at opretholde ensartede høje felter på tværs af celler og til at undgå skader på elektroderne.

1. Udfør såret durning en aktiv ECIS måling.
2. Aktiver Wound / elektroporere Setup, og klik derefter på sår og udfylde (sek), sår (V for 1.600 R) eller strøm (microamperemetret til Z og Z-Theta) og frekvens (Hz). De viste Standardværdierne er baseret på den type array og ECIS enhed.
3. Vælg de brønde til sår i afsnittet "Well konfiguration". Kun de markerede brønde vil blive såret.
4. Aktiveringsforsinkelsestiden Indtil Hour og udfylde forsinkelsestiden for at aktivere forsinkelsen såret funktionen. Denne funktion kan stoppes når som helst ved at trykke på Stop eller anvende et sår manuelt. Kun én forsinkelse kommando kan være aktiv ad gangen.
5. Tryk på Aktiver og klik på OK i pop-up-vinduet for at starte såret.
6. Sørg for, at modstanden signalet falder til offset impedans efter såret, ellers gentage såret.

7.. Dataanalyse

Data repræsentation og eksport.

1. Finish måling eller indlæse data indstilles via Filer -> Åbn.
2. Vælg brønde, der skal vises fra "Well Configuration" vinduet. Koncernens individuelle brønde at præsentere gennemsnittet.
3. Vælg parameter, der skal vises fra den øverste værktøjslinje (Z, R eller C).
4. Vælg diagramtype fra den øverste værktøjslinje (T = tid, F = frekvens, 3D = vandfald blot).
5. Definer graf offset og rækkevidde med skyderne under grafen vindue eller udfylde de eksakte værdier i de tilstødende kontrol.
6. Vælg fra de grundlæggende "tidsserier Options" i afsnittet "Analyze" for at udføre standardafvigelsen, løbende gennemsnit eller normalisering af data.
7. Aktiver Ekspert Toolbar i menuen Hjælp til mere avancerede operationer som Nyuist plot og Fourier transformation.
8. Brug "Display Options" i "Analyze" for at definere raNSÆ af x-og y-akserne og eksport graf.
9. Eksporter valgte data til en Excel-fil via File -> Export Data -> Til Excel (valgt) og bruge en tredjeparts software valg for dybtgående analyse, statistik og repræsentation efter behov.

Modellering af Rb og Alpha.
BEMÆRK: modellering, anbefales det at bruge en celle-fri, medium fyldt godt som reference.

1. Finish MFT måling eller belastning MFT datasæt.
2. Hvis en celle-fri henvisning godt er tilgængelig presse enten Find til automatisk at vælge den referenceværdi eller Set for at markere cellen gratis tidspunkt manuelt fra "Freq. Scan Modeling" i afsnittet "Analyse".
3. Hvis der ikke er cellefri reference importere en referenceværdi fra et andet datasæt. Åbn reference datasæt (sørg for, at den samme array, og mediet blev brugt) og bruge Find eller Set for at vælge den referenceværdi.Derefter navigere til de målte data og tryk får.
4. Hvis der ikke er celle-fri referencedata sat rådighed brug fabriksindstillingerne.
5. Tryk Model at starte beregningerne. Modeling kan tage flere minutter afhængig af størrelsen af ​​datasættet.

Beregning af mikrobevægelse.
BEMÆRK: Denne beregning er ikke en del af målingen software, men kan udføres med enhver signalbehandling software.

1. Finish RTC måling eller indlæse RTC datasæt.
2. Normalisere datasæt ved den gennemsnitlige modstand af hele perioden.
3. Break datasæt i segmenter med en længde på 256 datapunkter og rengøre hver segment af et Hanning vindue.
4. Kør en 256-punkts Fourier transformation og gennemsnit resulterende frekvens spektre til en enkelt-sidet 129-point kraftspektret at minimere tilfældig støj og forbedret biologisk signal.
5. Plot frekvens mod amplitude i en log-log graf og anvendemindste kvadraters lineær tilpasning.
6. Hældningen af ​​den lineære tilpasning er et mål for den samlede støj i signalet, og dermed mikrobevægelse af cellerne.

Representative Results

Opsætning et eksperiment er forholdsvis enkel og selve målingen er fuldautomatisk, men som det ofte er tilfældet, korrekt analyse og fortolkning af data er afgørende. I repræsentativt udsnit af data er fastsat en retningslinje for fortolkningen af ​​de vigtigste parametre, som impedansspektroskopi med ECIS. Dette vil være nyttigt at beslutte, hvilken form for videnskabeligt problem en ECIS måling kan være nyttige og hvilke parametre skal registreres.

En typisk eksperimentel udlæsning kan generelt opdeles i en vækst-fase efter celleinokulering og en plateau-fase, hvor cellerne når konfluens. Hver af disse faser giver information om forskellige cellulære egenskaber. En repræsentativ måling er vist i figur 2 og opdelt i fire underfaser at analysere A) celleadhæsion, spredning og proliferation, B) dannelse af en modning EF barriere C) cellemigrering efter generering af en elektriskal sår, og d) den cellulære respons på stimulering med det vasoaktive middel thrombin. Fasekontrast-og immunfluorescens billeder blev erhvervet direkte fra målingen elektrode i de forskellige underfaser at illustrere sammenhængen mellem elektrode dækning, celle-status, og registreres impedans signal.

Vedhæftning, spreder og spredning

Hver celletype har sin karakteristiske vedhæftning og vækstkurve, der kan manipuleres ved at variere podningstæthed, belægning med ekstracellulære matrix-proteiner eller andre stimuli. Et af de største problemer at studere disse processer er at skelne mellem adhæsion, spredning og proliferation. Wegener et al ^11. Givet en detaljeret beskrivelse af anvendelsen af en kombination af modstand og kapacitans til at skelne mellem disse parametre og i figur 3 bliver det tydeligt, hvordan modstand og kapacitans kan supplere hinanden. Det er vigtigt forundersøgelse af vedhæftning og spredning at forstå indflydelse målehyppigheden, fordi her det elektriske felt forårsager en polarisering af cellemembranen af cellerne i suspension ^8, der tvinger strømmen til at flyde udelukkende omkring cellerne. Når cellerne vedhæfte de begynder at begrænse strømmen ved at sprede over elektrodestrukturerne og kapacitans aftager lineært med den procentdel åbent område på elektroden (fraktioneret område). Derfor kan adhæsion, spredning og proliferation kvantificeres bedst, når der optages kapacitans på en frekvens større end 40 kHz (figur 3B), hvor faldet i kapacitans er direkte proportional med elektroden dækning. Alternativt modstandsdygtighed mod mest følsomme måling frekvens er et direkte mål for differentiering og modning af celler i en sammenflydende barriere (figur 3A). Ud over den fraktionerede område, Wegener et al. Indført to andreparametre til at kvantificere vedhæftning og elektrode dækning: t _1/2 (halv maksimal kapacitans), som er tiden indtil 50% af elektroden er dækket med celler (figur 3B, indsættelse), og hældningen af kapacitans kurve (r, ikke vist) som satsen for cellespredning og proliferation.

Modstand som et mål for barriere kvalitet

Modstand er den del af impedansen, der beskriver barriere kvalitet og funktion bedst, fordi den undlader kapacitive komponenter fra membran elektrode og medium. Her udtrykket barriere kvalitet og ikke gennemtrængelighed, da permeabiliteten per definition kun afhængig af celle-celle-kontakter. Resistens imidlertid bestemmes ved evnen af ​​celler og deres celle-celle-og celle-matrix-interaktioner til at blokere strømmen. Derfor forskellige celletyper (kloner og passager), har deres specifikke modstandsværdier (figur 4A). Selvom modstanden giver et meget clearer idé om cellebarriere bør impedanssignalet altid tages i betragtning.

Modellering af Rb og Alpha

ECIS software rummer en bestemt funktion, evnen til at modellere to parametre, som sondrer imellem celle-celle og celle-matrix-sammenvoksninger (figur 4B og 4. C). Rb (i cm ² x ohm), er resistiviteten af celle-celle-kontakter til strøm og dermed en invers foranstaltning af klassisk permeabilitet. High Rb indebærer lav gennemtrængelighed mod strømmen. Alpha (i cm x ohm ^0.5), er et mål for impedans bidrag fra de celle-elektrode vejkryds. Modellen at kvantificere celle-celle-og celle-matrix-kontakter blev indført 1991 Giaever og Keese og er baseret på den antagelse, at cellerne er cirkulære skiveformede genstande, der har en isolerende membran, svæve over elektroden og er fyldt med elektrolyt ² . Denisoleringsevne af cellemembranen efterlader kun tre veje for den aktuelle: a) mellem ventrale overfladen af ​​cellerne og elektrode, b) mellem celle-celle-kontakter, og c) ved hjælp af cellerne (kun sandsynligt, når en høj målefrekvens anvendes ). En mere detaljeret afledning og forklaring kan findes i papirerne fra Lo et al ^3,12.

Mikrobevægelse

Det har vist sig, at små ændringer i modstanden signal (figur 4A) skyldes subtile, tilfældige celle bevægelser i sammenflydende cellelag samt celler bevæger sig til og fra elektroden i sparsomme kulturer ^2. Dette aspekt af ECIS tid-kursus data beskrevet af Lo og Opp m.fl. ^13,14. Er ofte overset, og ses bedst ved måling med 1E arrays og på det mest følsomme frekvens til at redegøre for para-og subcellulære nuværende-stier. Beregningen af ​​denne celle forårsagede støj (mikrobevægelse) er ikke en del af the standard måling software, men i den nyeste version af Fast Fourier Transformation (FFT) er integreret. Optagelse RTC data med en sampling frekvens på 1 Hz i 1 time ved 4 kHz giver tilstrækkelig opløsning til beregning af EF mikrobevægelse. Denne beregning giver en enkelt værdi, og kan direkte anvendes til statistisk analyse. En udvidet diskussion om brugen af frekvens analyse for mikrobevægelse kan findes andre steder ^15. Alternativt til FFT kan anvendes andre strategier analyse, som variansen af ​​trin. Varians er mere følsom over for små ændringer i mikrobevægelse, men på grund af denne følsomhed sammenligning af de enkelte forsøg bliver vanskelig. Skråningerne af kraftspektret er en mere robust måling af mikrobevægelse (figur 4D). Her i området under kurven kan ses som mængden af ​​mikrobevægelse eller støj cellerne opretter. Derfor, jo stejlere hældning effektspektret mindre arealet under kurvenog mindre mikrobevægelse.

Elektrisk sårhelende assay

At studere migration af celler, der normalt mekaniske sår påført ved at skrabe celler fra kulturen plade med pipettespidser, celle skrabere eller specifikke frimærker og følge deres genindvandring mikroskopisk ^16. Denne fremgangsmåde har den indlysende ulempe, at størrelsen af ​​bunden varierer og er sædvanligvis for stort til at forsømme påvirkning af celleproliferation på sårhelingsprocessen. Den sårede funktion ECIS bruger en høj spænding, frekvens puls højt for at få en cellefri elektrode og derefter følger genindvandringshastighed af naboceller at erstatte dødsceller (figur 5A). En fordel ved denne automatiserede metode over standard, arbejdskraftintensive scratch analyser er, at ECIS producerer en meget reproducerbar sår med en præcis diameter på 250 um, der lukker inden for et par timer, for at studere ren migration. Endvidere elektriske puls gørees ikke fjerne protein belægning og udskilt ekstracellulær matrix. Under forudsætning af, at cellerne remigrate på elektroden fra alle sider, kan migrationsrate nemt beregnes ved at dividere sår radius af tid, der kræves for sårlukning ^17. Som et alternativ til elektrisk sårdannelse nylig såkaldt elektrisk hegn metoden blev indført (ikke vist). Her høje strømpulser forhindre udlæg og migration af celler på elektroderne efter podning. Cellerne vil vokse omkring måleelektrode og begynder at migrere indad, så snart de elektriske impulser er slukket. Fordelen ved det elektriske hegn over elektriske såret er, at elektrodens overflade ikke er blevet ændret af cellevækst eller cellefjernelse, hvilket er vigtigt at måle påvirkninger af forskellige belægninger på cellemigrering.

Cellestimulering

Ud over studiet af cellemigration er impedansspektroskopi perfekt egnet tilmåle virkningerne af lægemidler og toksiner på celler. Figur 5B viser en klassisk stimulering / inhibering eksperiment, hvor thrombin blev anvendt til at fremkalde hyper-permeabilitet i sammenflydende EF barriere ved sammentrækning og gap-dannelsen af celler, der manifesterer sig som et forbigående fald i modstand . Inkubation med Rho-kinase inhibitor Y-27632 meste af thrombin reaktion mindskes ved at sænke basal celle spænding ¹⁸ og blokere stress fiber dannelse ^19. Så Rho kinase blocker blev brugt på forskellige tidspunkter efter thrombin desuden fører til en øjeblikkelig og fuldstændig genopretning af EF-barrieren. Her fordel af en kontinuerlig impedans målesystem til at studere akutte cellulære responser bliver indlysende. I almindelig endpoint assays (f.eks immunfluorescensfarvning eller makromolekyle passage), ville dette akut reaktion på den anvendte blocker være meget vanskeligt, hvis ikke umuligt at påvise og bestemme. Vigtigt at bemærke er, at med jegmpedance målinger permeabiliteten mod ioner er beskrevet og ikke mod makromolekyler. Der henvises til ^20, hvor en fremragende sammenligning mellem ECIS målinger og makromolekyle passage eksperimenter er forudsat Aman et al..

Figur 2. Repræsentativ måling. MVEC blev dyrket på et gelatineovertrukne 8W1E arrays med en lav podningstæthed på 5.000 celler / cm ² og MFT optagelsen blev udført i løbet af 10 dage. Målingen illustrerer de forskellige read-outs af en ECIS eksperiment: A) vedhæftning, spredning og spredning, B) dannelse og modning af en sammenflydende cellebarriere, C) sårheling efter anvendelse af en elektrisk sår d) stimulation med vasoaktive agent thrombin. De to pile indikerer medium forfriskninger, som blev udført i intervaller på 4 dage, og giver en idé om følsomheden af ​​målingerne mod mekaniske stimuli og ændringer i temperatur og pH. Billederne i toppanelet svarer til måling og blev erhvervet direkte fra måleelektrode. Fase-kontrast billede til venstre viser endothelcellerne 24 timer efter podning, begynder at dække elektroden. Immunfluorescens billeder i midten og til højre nuværende F-actin-farvning af sammenflydende endothellaget før og efter stimulering med thrombin (1 U / ml). Thrombin forårsager sammentrækning af endothelceller ved dannelse af såkaldte stress fibre og forbigående åbning af inter-endotel huller (pile og image indlæg), genkendelige i ECIS signal ved et fald i resistens over baseline. Her følsomheden af ​​målingen bliver indlysende og hvordan ændringer i cellelaget korrelerer med impedanssignalet.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Cellebinding og-vækst. MVEC fra samme donor blev podet med tre forskellige tætheder på gelatineovertrukne 8W10E arrays og cellevækst blev registreret på flere frekvenser for 60 timer. A) Resistance værdier for de tre betingelser ved deres optimale frekvens på 4 kHz til at måle barriere formation. Alle tre seeding tætheder etableret en sammenflydende barriere på ca. 1.200 Ω ved afslutningen af målingen. Spredning satser dog (skråninger af kurver) adskiller sig markant B) Måling af kapacitans på 64 kHz giver indsigt om vedhæftning og spredning. Adhæsion er istartdisplayet plateaufase i kapacitans kurve (2-8 timer). Spredning, hvilket er i lineært forhold til elektroden dækning, er repræsenteret ved kurvens hældning og er afsluttet efter 10-30 timer, afhængigt af podningstæthed. Tidspunktet t _1/2 (halv maksimal dækning) kan anvendes til statistisk analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4.. Karakterisering af sammenflydende barriere. To MVEC donorer med forskellige numre passage (passage 3 og 6) blev podet på gelatineovertrukne 8W1E arrays og en MFT måling blev udført i 30 timer for at karakterisere EF barrieren. A) Modstand målinger viser, at yngre donor 1 har en højere modstand på ca. 11.000 Ω i forhold til de ca. 7.500 Ω af den ældre donor 2.. Bc) modellering kapaciteter ECIS er blevet brugt til at finde årsagen til den lavere modstand. Modellering viste en sammenlignelig celle-celle interaktion Rb og indikerede en svækket celle-matrix-vekselvirkning Alpha som en mulig årsag. D) RTC blev udført for at kvantificere mikrobevægelse i sammenflydende cellelag ved Fourier transformation, hvor arealet under kurven er proportional med mikrobevægelse . Analyser af spektre viser mindre mikrobevægelse af den ældre donor 2 og dermed understøtte hvad der allerede kan antages fra modstanden signal (mindre varians). Klik her for at se en større version af dette tal.

5 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/>
Figur 5. Cell migration efter elektrisk såret og virkningerne af thrombin stimulation. Impedans optagelser blev udført ved 4 kHz med maksimal tidsmæssig opløsning. A) MVEC donor 1 blev anvendt i passage 3 og donor 2 i passage 6 på gelatineovertrukne 8W1E arrays og dyrkes til sammenløb. Så en elektrisk sår blev skabt ved anvendelse af to 5 V impulser ved 60 kHz med en varighed på 20 sek hver. Den yngre donor 1 viste bedre sårheling kapacitet baseret på en hurtigere sårlukning (migration, kurvehældninger) og en højere modstand efter sårdannelse sammenlignet med den ældre donor 2. B) HUVEC dyrket på gelatineovertrukne 8W10E arrays. Ved konfluens cellerne er blevet serumudsultet i 1,5 timer ved at erstatte det komplette dyrkningsmedium med basal medium plus 1% humant serumalbumin (HSA). Osalder almindeligt medium med HSA er et kritisk trin, da serumkomponenter blokere thrombin respons. Så snart en stabil modstand plateau blev registreret, thrombin blev tilsat direkte til brøndene, og blandet forsigtigt med en 200 pi pipette. Den maksimale thrombin effekten er synlig efter 30 min, kendetegnet ved et forbigående fald i resistens over for baseline og en ca. 30-50% lavere modstand efter helbredelse. Cellerne blev enten præinkuberet med Rho-kinase blocker Y-27632 i 30 min eller blocker blev tilføjet 20, 30 eller 40 min efter thrombin tilføjelse, som formindsket thrombin kraft straks. Klik her for at se en større version af dette tal .

Discussion

ECIS er et fremragende værktøj til screening af celle egenskaber og adfærd samt til kvantificering af virkningerne af kendte og ukendte stoffer. Derved cellerne holdes under standard dyrkningsbetingelser kan impedans løbende blive overvåget med en høj tidsmæssig opløsning og korreleret til optiske signaler. På den måde kan vælges det optimale tidspunkt for celle manipulationer på basis af morfologiske og funktionelle celle status. Desværre, denne høje måling opløsning kommer med prisen at små ændringer i temperatur, pH eller mekanisk stimulering af celler (medium ændring) vil påvirke impedanssignalet straks.

Anvendelsen af ​​den lille måling strøm til cellerne gør ECIS måling noninvasive, destruktiv og etiket-fri, men som et resultat kan måles kun passive bioelektriske egenskaber (ingen handling potentialer). Et centralt element er, at en række parametre kan være der ived fra en enkelt måling, kombinere oplysninger fra flere klassiske analyser, ligesom gennemtrængelighed eller sårheling assays. Her særlige interessant aspekt er, at matematisk data kan bruges til at udforske ændringer i modstand og kapacitans og henvise dem til forskellige cellulære strukturer (f.eks celle-kontakter eller cellemembran). Vigtigt at bemærke er, at impedansspektroskopi altid giver et gennemsnit signal fra alle celler på sensorelektroden, som ikke giver mulighed for undersøgelser af enkelte celler, og også den matematiske model er kun gyldigt i sammenflydende cellelag. Derfor endotelceller bør holdes i sammenflydende tilstand i mindst én dag før anvendt til modellering for at sikre modne celle-sammenvoksninger og hvilende celler. Ligeledes bør elektriske sår kun anvendes på sammenflydende cellelag ved hjælp af flere korte sårede pulser med høje frekvenser, for at opnå optimal såret effektivitet og forebygge skader af elektroderne.

jove_content "> For at få den maksimale mængde af information fra en ECIS måling som i hvert assay, flere parametre såsom kombinationen af ​​matrix substrat, belægning og podningstæthed for den enkelte celletype skal testes og optimeres før et eksperiment.

En væsentlig begrænsning af ECIS er, at målingen ikke giver direkte oplysninger om det molekylære niveau. Således ECIS målinger er som regel mest informative i begyndelsen af ​​en eksperimentel serie til at hjælpe med at knytte et videnskabeligt problem med cellulære strukturer eller egenskaber, og med betydelige bidrag til dannelsen af ​​et testbare hypotese. Derfor modulære design af ECIS giver et bredt spektrum af applikationer med mulighed for skræddersyede arrays. De seneste array-udvikling tyder på en fremtidig fokus på high throughput impedans screeninger for celledeling og elektrisk såret og forskuddet særlige flow arrays til simulering af in vivo

Yderligere litteratur
Der henvises endvidere til den webside for Anvendt Biofysik (www.biophysics.com) for applikationseksempler, webinars og en detaljeret liste over publikationer, der dækker hele ECIS spektret.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W10E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
L-Cystein	Merck Millipore	102838
Gelatin	Merck Millipore	104070
Bovine Thrombin	Merck Millipore	604980
Albuman (Human Serum Albumin)	Sanquin
Y-27632	Tocris Biosciences	1254
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Pen/Strep	Lonza	17-602E