Summary
Blod leukocytter og blodplater kan anvendes som en markør for bioenergetisk generelle helsen til et individ, og det samme har potensial til å overvåke patologiske prosesser og virkningen av behandlinger. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å isolere og måle mitokondriefunksjonen og oksidativ brist i disse cellene.
Abstract
Mitokondriell dysfunksjon er kjent for å spille en viktig rolle i en rekke patologiske tilstander, slik som aterosklerose, diabetes, septisk sjokk, og nevrodegenerative sykdommer, men vurdering av forandringer i bioenergetisk funksjon hos pasienter er utfordrende. Selv sykdommer slik som diabetes, eller aterosklerose tilstede klinisk med spesifikk organfunksjon, den systemiske komponenter i patologien, slik som hyperglykemi eller inflammasjon, kan endre bioenergetisk funksjon i sirkulerende leukocytter eller blodplater. Dette konseptet har blitt anerkjent for en stund, men dens utbredte programmet har blitt hemmet av det store antallet primærceller som trengs for bioenergetisk analyse. Denne tekniske begrensning er overvunnet ved å kombinere spesifisiteten av de magnetiske perleisoleringsteknikker, celle adhesjons-teknikker, som tillater cellene å være festet uten aktivering på mikroplater, og følsomheten av ny teknologi utviklet for høy gjennomstrømning microplate respirometri. Et eksempel på dette utstyret er det ekstracellulære flux analysator. Slike instrumenter bruker vanligvis oksygen-og pH-sensitive sonder for å måle hastigheter for forandring av disse parametrene i adherente celler, som deretter kan bli relatert til metabolisme. Her har vi detalj de metoder for isolering og platekledning på monocytter, lymfocytter, neutrofiler og blodplater, uten aktivering, fra humant blod og analysen av mitokondriell bioenergetisk funksjon i disse cellene. I tillegg demonstrerer vi hvor den oksidative sprakk i monocytter og neutrofiler kan også måles i de samme prøver. Siden disse metodene bruker bare 8-20 ml blod fra mennesker de har potensial for overvåking av reaktive oksygen arter generasjon og bioenergi i en klinisk setting.
Introduction
Overvåking av bioenergetisk helsen til immunceller (monocytter, lymfocytter, nøytrofile granulocytter) og blodplater fra blodet har blitt anerkjent for en stund som et potensielt nyttig diagnostisk verktøy for å vurdere den samlede bioenergetisk helsen til et individ. Det er en voksende mengde litteratur tildele en rekke sykdommer så som kreft, kardiovaskulære sykdommer og neurodegenerative sykdommer til mitokondriell dysfunksjon 1,2. Dette er klinisk viktig siden mitokondriell dysfunksjon kan initiere en rekke cellulære hendelser som fremmer pro-inflammatoriske signalveier eller fører til celledød. Flere studier har karakterisert mitokondriell funksjon av perifere mononukleære blodceller og blodplater i forhold, for eksempel fibromyalgi, diabetes, septisk sjokk, og Alzheimers sykdom 3-7. For eksempel, en fersk studie evaluert bioenergi blodplater som en markør for mitokondriefunksjon og funnet at blodplater fra type 2 diabetikeric pasienter hadde redusert mitokondrieoksygenforbruk 7,8. Fra disse funnene og andre, er det klart at monocytter, lymfocytter, nøytrofile og blodplater kan tjene som surrogatmarkører av endringer i bioenergi i henhold patologiske tilstander siden de kartlegge den systemiske sirkulasjonen og kan gjenspeile lokale og globale metabolske endringer. For å finne ut om denne metoden har prognostisk eller diagnostisk verdi en høy gjennomstrømning fremgangsmåte for analyse og en konsistent metode for celle preparat er nødvendig.
Metodene for å måle mitokondrienes funksjon i leukocytter og blodplater har tidligere involvert isolering av mitokondrier eller vurdering av mobilnettet bioenergi i intakte celler 4,9. Fordelen med cellulær bioenergetisk vurdering ved hjelp av et ekstracellulært fluks (XF) analysator er at mitokondriefunksjon i celler kan etableres med endogene substrater og luftveisparametere slik som proton lekkasje og maksimal respiratoriskkapasitet kan bestemmes. Vi og andre har brukt denne teknologien for å vise at bioenergetiske profiler i blodplater, kan monocytter og lymfocytter isolert fra humant blod bli etablert og sammenlignet blant celletyper 8. I tillegg er både neutrofiler og monocytter i besittelse av en oksidativ brist egenskap som NAPDH oksidaser er aktivert og forbruker oksygen for å danne superoksyd. Viktigere, er denne veien en viktig del av medfødt immunitet og er modulert av systemisk inflammasjon. For eksempel har det blitt vist at endringer i oksidativ brist kapasitet er forbundet med en rekke autoimmune sykdommer slik som multippel sklerose, artritt, og tilbakevendende infeksjoner 10,11. For tiden finnes det ikke noen høy gjennomstrømning kvantitative analyser er tilgjengelige for å måle oksidativ brist i kliniske prøver. Dette er viktig siden karakterisere den oksidative burst kapasiteten av nøytrofile og monocytter kan også tjene som et viktig diagnostisk verktøy for flere patholosynergier.
De viktigste tekniske utfordringer vært lav følsomhet for måling av oksygenforbruket ved bruk av konvensjonelle teknikker polarographic og behovet for å bruke festede celler ved bruk av mer følsomme mikro fluorometriske metoder. I denne praktiske video beskrives den tekniske løsning på disse problemer. Vi detalj de metoder for isolering, ving og måling av bioenergetikk av monocytter, lymfocytter, nøytrofile granulocytter og blodplater og den oksidative utbrudd av monocytter og neutrofiler fra menneskeblod. Denne metode er egnet for klinisk vurdering av bioenergetikk og oksidativ brist i undersøkere som har tilgang til en pasientpopulasjon, og evnen til å skaffe frisk blodprøver.
Protocol
Alle protokoller som er beskrevet i dette manuskriptet for blodprøvetaking, isolasjon og analyse har blitt gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board ved University of Alabama i Birmingham.
En. Cell Isolation (Modifisert fra Histopaque Sigma-Aldrich Protokoll nr. 1119 og Miltenyi Biotec microbead Positiv og negativ seleksjon protokoller)
- Sentrifuger helblod (samles i ACD-eller EDTA-rør) ved 500 xg i 15 minutter i en sentrifuge med en svingende spannrotor-(akselerasjon = 5-6, og ingen brems).
- Fjern det øverste laget som inneholder blodplaterikt plasma (PRP) med en overførings pipette til 1 cm holder seg over cellelaget (erytrocytt / buffy coat). Sett av PRP ved romtemperatur i behandlingen senere.
- Overfør buffy coat til et sterilt 50 ml konisk rør, fortynn til 24 ml med RPMI basal eller til minst 4 ganger utgangs buffy coat volum.
Merk: Den øvre halvdelen av RBC laget kan have å være inkludert, selv om dette vil resultere i økt volum RPMI proporsjonalt. - Klargjør densitetsgradient ved hjelp av lav tetthet Ficoll med en spesifikk vekt på 1,077 (1,077) for det øverste laget og høy tetthet Ficoll med en spesifikk vekt på 1,119 (1,119) for det nederste laget i tre 15 ml koniske rør (3 ml hver). For å utføre dette trinnet, først legge 1077 til hvert rør. Ved hjelp av en 5 ml pipette smal legg 1119 til bunnen av røret ved å plassere pipettespissen under 1077 og langsomt frigjøre reagensen uten å blande med den øvre gradient. Totalt 6 ml av densitetsgradient-mediet skal være til stede på dette stadiet med en synlig faseseparasjon av i 3 ml-merket.
- Ved hjelp av en automatisert pipette, tilsett 8 ml av fortynnet blod (fra trinn 1.3) forsiktig til hver gradient rør ved bruk av lav-effektinnstillingen for å forhindre fra å forstyrre gradient lag. Totalvolumet bør være 14 ml ved dette trinnet.
- Sentrifugerør ved 700 xg i 30 min ved romtemperatur (akselererrasjon 6, ingen brems).
Merk: På dette stadiet, bør tre forskjellige celle band være tydelig (figur 1A). De øverste band (mellom 1077 og plasma) inneholder mononukleære celler (MNC) og blodplater, og midten bandet (mellom 1007 og 1119) inneholder polymorfnukleære celler (PMN) og nedre band (under 1119) inneholder RBC. - Samle MNC og PMN separat ved hjelp av sterile glass pipetter uten å forstyrre de andre celle band. Kombiner MNC-populasjonen fra hvert rør i en steril 50 ml konisk rør. Gjenta dette for PMN befolkningen også.
- Tilsett 4 volumer av RPMI til hvert rør inneholdende de MNC og PMN-fraksjoner på henholdsvis til å fortynne densitetsgradient.
- Sentrifugerør ved 700 xg i 10 min ved romtemperatur.
- Resuspender cellepelleten MNC og PMN cellepelleten i 1 ml RPMI inneholdende 0,5% ultrarent fettsyre-fri BSA (RPMI-BSA) og overfør til sterilt 1,5 ml rør. Pellet cellene ved hjelp av en stasjonær picofuge for 30sek.
- Kast supernatanten og resuspender hver cellepelleten i 80 pl RPMI-BSA.
- Tilsett 20 pl av magnetiske kuler merket-antiCD14 antistoff til røret som inneholder den MNC fraksjonen for positiv utvelgelse av monocytter. For at røret som inneholder den PMN cellefraksjon, tilsett 20 pl av magnetiske kuler merket-antiCD15 antistoff for positiv utvelgelse av neutrofiler. Inkuber hver cellesuspensjon i 15 min ved 4 ° C.
- Vask hver celle suspensjon med en ml RPMI-BSA media og pellets som før og resuspender hver pellet i 500 mL RPMI-BSA.
- De merkede celler ble separert i det magnetiske feltet for magnetisk aktivert cellesortering (MACS) separator. Forbered MACS LS kolonner (en for hver celle suspensjon) ved å plassere kolonnen på MACS separator og vask med 3 ml RPMI-BSA før du legger cellesuspensjonen.
- Etter påføring cellesuspensjoner, vask hver kolonne 3x med 3 ml RPMI-BSA media (sørg for å la media Drain helt mellom hver vask). Samle cellesuspensjonen gjennomstrømning og kolonnevaskinger i et sterilt rør.
- For å isolere monocytter og neutrofiler, fjerne kolonnen fra det magnetiske felt etter siste vask, og eluere de positivt utvalgte celler inn i et sterilt rør med 5 ml RPMI-BSA stempelet i kolonnen ved hjelp av.
- For å isolere lymfocytter pelletere flow-through-vaskefraksjon av MNCer fra trinn 1,15 ved 300 xg i 10 min. Kast supernatanten og cellepelleten suspenderes i 80 pl RPMI-BSA. Tilsett 20 pl av CD61 og CD235a antistoffer og cellesuspensjonen inkuberes i 15 min ved 4 ° C. Gjenta MACS separasjon som før og samle strømningen selv om de inneholder lymfocyttene.
- Til pellets monocytter, nøytrofile, og lymfocytter fraksjoner, sentrifuge som før (trinn 1,9) og kast supernatanten. Cellepelleter bør resuspendert i 1 ml ekstracellulære flux media (XF-DMEM) for telling. <Br /> Merk: 8 ml helblod skulle resultere i 1-5 x 10 6 monocytter / ml, og 5 til 20 x 10 6 lymfocytter og neutrofiler / ml.
- For å isolere blodplater, sentrifuge PRP (trinn 1.2) i 8-10 minutter ved 1500 xg ved romtemperatur. Fjern plasma og vask cellepelleten en gang med 5 ml sterilt PBS supplert med 1 mg / ml PGI 2, repellet og suspen endelige pellet i 1 ml PBS-PGI 2 buffer.
- Bestem antall blodplater ved turbidimetri når blodplatene suspendert i PBS-buffer ved PGI 2 spektrofotometer som beskrevet av Walkowiak et al ved hjelp av følgende ligning: [6.23 / (2,016 - Abs 800)] - 3,09 x fortynningsfaktor = # x 10 8. blodplater / ml 12.
2. Plettering av cellene
- Utarbeidelse av Cell-Tak (celle lim): Legg 90 mL celle limet til 180 mL Dih 2 0, 540 mL av 0,1 N natrium bikarbonat (pH 8,0), og justere pH til 7,2 til 7,8 ved anvendelse av 1 N NaOH. Forbered XF plater (24-vel, V7 mikroplater) ved å dekke hver brønn med 30 mL av forberedt celle lim.
Merk: Celle limet bør være forberedt frisk for hver bruk. - Inkuber platen ved 37 ° C i 20-30 minutter og deretter aspirate celle lim og vaskes brønnene med PBS to ganger (1 ml / brønn).
- Utfør et celletall på isolerte monocytter, lymfocytter, nøytrofile granulocytter og blodplater og bringe til passende volum ved hjelp av XF-DMEM å tillate en seeding tetthet av 250K celler / brønn for monocytter, lymfocytter, og nøytrofile, og 25 x 10 6 / godt for blodplater. Alternativt, for å måle oxidative burst respons, neutrofiler kan bli utsådd på 125K celler / brønn. Den endelige seeding volum for hver cellesuspensjon bør være 200 ul / brønn.
- Sentrifuger plate ved 200 xg i 1 sek uten brems. Rotere platen 180 ˚ og sentrifuger på nytt uten å bremse ved 300 x g.
- Ta endelig godt volume til 660 pl med XF-DMEM og inkuber ved 37 ° C i 30 min før XF assay. Merk: Mikrofotografier av belagte celler før og etter analysen kan brukes til å sikre tilfredsstillende plettering og utelukke celle løsgjøring.
Tre. Utarbeidelse av en 24-brønns Ekstracellulær Flux analysen Plate (XF24)
- Hydrat XF sonder med kalibreringsløsning i minst 2 timer før analysen.
- Forbered 10x bestander av 0,5 mikrogram / ml oligomycin, 0,6 mikrometer FCCP, og 10 mikrometer antimycin i XF-DMEM og last 75 mL av stamløsninger inn i kassetten injeksjonsporter i ovennevnte rekkefølge. Hvis oksydative burst målinger skal kunne oppnås, kan injeksjon av 10x lager av 100 ng / ml PMA injiseres etter antimycin-A.
- Kalibrere hydrert og ladd patron og utfører XF analysen. De detaljerte metoder for analyse og tolkning av både oksygenforbruket og pH-endringer har blitt beskrevet i tidligere publikasjoner 9,13,14 og er ikke discussed i detalj her.
- Etter XF assay, Aspirer alle bortsett fra de siste 50 pl av XF-DMEM etter at analysen for å hindre tap av cellene fra platen og tilsett 50 pl RIPA cellelyseringsbuffer og utføre et protein assay for normalisering.
Representative Results
For å vurdere bioenergi blodceller, er fullblod samlet inn fra mennesker ved venepunksjon i en EDTA eller ACD vacutainer samling rør. Isolering av leukocytter og blodplater etter blodprøvetaking er visualisert i figur 1A som beskrevet i protokollen. Fullblodsprøver behandles innen åtte timer av samlingen for å unngå celledød og aktivisering. Langtidslagring ganger større enn åtte timer er ikke testet, men kan resultere i endrede bioenergi og være mindre representative for fysiologiske forhold. Syresitratdekstrose (ACD-8 ml), og EDTA vacutainer-rør er blitt brukt for celle isoleringer med ingen observert effekt på bioenergetisk funksjon av isolerte celler. Antikoagulanter er nødvendige som klumper redusere antall celler som oppnås, forstyrre riktig fasedannelse i løpet av Ficoll-gradientsentrifugering, og resulterer i liten eller ingen blodplater ble oppnådd i sentrifugeres serum. Alt blod representerer en biological fare og riktig personlig verneutstyr må implementeres gjennom hele prosedyren selv etter cellepopulasjoner er isolert eller cellelysater genereres. Prøvene skal disponeres i samsvar med institusjonens menneskelige avfallsstandarder.
Fullblod blir sentrifugert for å separere blodplaterikt plasma fra buffy coat, det hvite lag like over de røde blodlegemer som inneholder leukocytter. Den buffy coat påføres tetthetsgradienter og sentrifugert for å oppnå de perifere mononukleære blodceller (monocytter og lymfocytter) og polymorfonukleære celler (granulocytter). RBC forurensning av de enkelte MNC og PMN-celle fasene er vanlig på dette stadium, og bør løses i MACS rensing. De ulike celletyper blir deretter oppnådd ved inkubering med magnet-antistoffer for å oppnå rene fraksjonene. Monocytter blir oppsamlet ved inkubering av PBMC-fraksjon med CD14, gjennomstrømning fra tMonocytter han inneholder lymfocytter, som deretter tømt for RBC-er og blodplater. Neutrofilene ble oppnådd ved inkubering av polymorfonukleære cellelaget med CD15-antistoff (figur 1A). Deretter kan blodplatene være pelletert ved sentrifugering av blodplaterikt plasma, og vaskes for å fjerne andre plasmakomponenter. Etter disse valgene blodplater, CD14 + monocytter, lymfocytter, CD15 + nøytrofile kan telles og belagt på en celle adhesjon medium-belagt XF analysator plate for bioenergi og oksidativ burst analyse.
Hvert trinn av fremgangsmåten skal utføres i sterile forhold, og er oppfordret til å hindre for tidlig aktivering av oksidativ brist respons hos monocytter og neutrofiler. En indikator på mindre enn sterile forhold under isolasjon er tydelig når nøytrofile, som har liten eller ingen oksygenforbruket under basale forhold, begynner den ekstracellulære flux analysen med forhøyede OCR målinger somgradvis øke eller avta i løpet av analysen. Vi understreker viktigheten av bildebehandling celler ved hjelp av lysmikroskopi på 200X eller større for å sikre at ingen morfologiske tegn på aktivering har skjedd forut for analysen. For eksempel, nøytrofile normalt vise en avrundet til uregelmessig form med utpreget cellegrenser som vist i figur 1B. Imidlertid vil disse cellene flate mot flate av platen når den er aktivert, og mister sine distinkte cellemorfologi. Vi har tidligere rapportert morfologiske endringer av aktiverte leukocytter og blodplater ved hjelp av denne protokollen, og må tas ytterligere tiltak for å sikre sterile forhold hvis møte aktivering åtte.
En forenklet ordningen av protokoll er sett i figur 2 som en tidstabell, der det primære trinn av celleisolasjon, XF plate forberedelse, og XF-analysen er beskrevet. Isolering består av densitetsgradienten separering av celletyper oger etterfulgt av magnetisk separering. Parallelt til cellen isolert prosessen, er XF plate preparatet nødvendig for å unngå forsinkelse i cellen plette eller begynnelsen av XF-analysen. Dette er viktig, fordi vesentlige forsinkelser kan føre til celleaktivering og redusert Bioenergetiske parametere.
Utilstrekkelig cellekonsentrasjoner etter isolering er et vanlig problem, og optimaliseringen av hver sentrifugeprosessen er nødvendig for å unngå celletap. Vellykkede isoleringer er blitt utført på så lite som 6 ml blod, men endringer kan gjøres avhengig av sirkulerende konsentrasjoner av den ønskede celletype. Dersom densitetsgradient er feil stilles, kan forskjellige celle faser ikke være synlig og tap av celler kan skje (se Jove instruksjonsvideo for en visuell demonstrasjon). Utilstrekkelig blodplater isolert fra PRP er sjelden, men har forekommet dersom vaskebuffer ikke inneholder PGI 2 eller dersom isoleringen foregår under romtemperatur. Risikoen for blodplate-enctivation ofte forhindret hvis blodplater er de siste celler som skal isoleres, men hvis blodplater forblir i vaskebuffer i lengre perioder på bioenergetikk påvirkes. Det har vært tilfeller av mindre blodplate bestander som ikke pellet i løpet av 1500 xg sentrifugering, og bioenergi av disse cellene har ikke blitt grundig karakterisert. Se tabell 2 for en mer komplett feilsøking.
De bioenergetiske profiler av leukocytter og blodplater kan bestemmes ved hjelp av XF analysator, som måler sanntids O 2 forbruk i cellene invasivt. Hver celletype er belagt på XF24 plate med fem replikater som vist i figur 3A. Tabell 1 angir forventede basal og oksidativ burst verdier ved celletype i løpet av analysen, og den gjennomsnittlige proteinkonsentrasjoner per brønn. Høyere gjennomstrømning teknologi er tilgjengelig, slik som XF96, som tillaterfire givere som skal måles samtidig, som vist i figur 3B. Etter analysen, blir dataene eksporteres til en work-stasjon datamaskin for analyse ved hjelp av riktig XF programvare og Microsoft Excel. OCR-verdier ble normalisert til totalt protein-innhold i de tilsvarende brønner, og uttrykt som pmol / min / mg protein. De representative bioenergetiske-oksidativ burst profiler av hver celletype ble nylig rapportert av vår gruppe åtte. Videre analyse av bioenergetiske parametere av analysen (basal, ATP-tilknyttede, proton lekkasje, maksimal, nonmitochondrial og oksydativ burst) kan beregnes for individuelle brønner som tidligere er vist og beskrevet under 8.
Det basale oksygenforbrukshastighet (OCR) er etablert av de første tre målingene som vist i figur 4A. Oligomycin (0,5 ug / ml), blir en inhibitor for mitokondriell ATP-syntase injisert i XF medium for å estimere OCR koplet til ATP-syntese og represen ted som ATP-forbundet. Den gjenværende OCR minus nonmitochondrial OCR kan tilskrives proton lekkasje. Deretter FCCP en uncoupler blir tilsatt for å bestemme den maksimale OCR, etterfulgt av antimycin-A, en inhibitor for mitokondriell respirasjon, for å bestemme nonmitochondrial kilder til oksygenforbruk. Reserve kapasitet er et mål på mengden av ATP som kan produseres i henhold til energisk etterspørsel og kan beregnes som forskjellen mellom den maksimale hastighet på respirasjon og basal. For å bestemme den oxidative burst kapasitet, forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) a PKC agonist injiseres for å øke NADPH oksidase-aktivitet, og økningen i oksygenforbruksraten etter PMA stimulering kan måles ved hjelp av XF analysator. Figur 4B viser hvordan du beregner de ulike parametrene for mitokondriefunksjon og oksidativ burst.
1301/51301fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg "/>
Figur 1. Isolering av leukocytter og blodplater fra Whole Blood. A) Ferske prøver er delt inn i deres plasma og cellulære komponenter ved sentrifugering og renset ved Ficoll tettshetsgradient, og Magnetic Aktivert Cell Sorting (MACS) av positive (monocytter og nøytrofile) eller negativ seleksjon (lymfocytter), mens blodplater er isolert med høy hastighet sentrifugering av blodplaterikt plasma. B) Bilder av de isolerte cellepopulasjoner gang resuspendert i XF DMEM og belagt på angitte celletetthet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg "/>
Figur 2. Fremstilling av XF24 plater for bioenergetiske studier av leukocytter og blodplater. Detaljert tidslinje for fremstilling av en XF24 assay-plate etter celle isolering og platekledning og patron hydrering og injeksjonsåpningen lasting.
Figur 3. Layout av leukocytter og blodplater på XF24 og XF96 analysator plater. A) Leukocytter (125-250k celler / brønn) og blodplater (25 x 10 6 celler / brønn) fra en enkelt donor er belagt på XF24 analysen plate blant bakgrunn kontroller. 75 ul av 10 x bestander av oligomycin (0,5 ug / ml), FCCP (0,6 uM), antimycin-A (10 uM), og PMA (100 ng / ml) fortynnet i XF media er lastet inntil de angitte injeksjonsporter. B) Leukocytter (75-150k celler / brønn), og blodplater (10 x10 6-celler / brønn) fra så mange som fire givere kan være belagt på XF96 i et totalvolum på 180 pl XF-DMEM. 20 ul av 10 x bestander av oligomycin (1,0 ug / ml), blir FCCP (0,6 uM), antimycin-A (10 uM), og PMA (100 ng / ml) fortynnet i DMEM XF-lagt i de angitte injeksjonsporter.
Figur 4 Analyse av bioenergetiske indekser.. A) Representative spor av oksygenforbruksraten (OCR) av mitokondrier og oksidativ brist i monocytter. Basal OCR er etablert (første tre priser indikert av tallene i sirkler). Deretter sekvensielle tillegg av oligomycin (o; 0,5 mikrogram / ml), FCCP (F; 0,6 mikrometer) og antimycin-A (A, 10 mM) blir injisert for å bestemme mitokondrielle og nonmitochondrial respirasjon av ikke-aktiverte celler. Til slutt, PMA (100 ng / ml) tilsettes for å måle oksidativ brist. B) Modulært analyse av mitokondriell funksjon og oksydativ burst blir beregnet ved forskjellene i satsene som angitt.
| Optimal Seeding Tetthet | Avg. Basal OCR (pmol O 2 / min) | Avg. Oksidativt Burst OCR (pmol O 2 / min) | Avg. protein (mikrogram) / brønn | |
| Monocytter | 250k celler / brønn | 83,9 (± 13,0) | 300,3 (± 58,8) | 19,0 (± 2,4) |
| 250k celler / brønn | 6,1 (± 2,2) | 1411,8 (± 233,3) | 20,6 (± 2,7) | |
| Lymfocytter | 250k celler / brønn | 52,9 (± 7,7) | 15 (± 4,1) | 13,2 (± 2,1) |
| Blodplater | 25 x 10 6 celler / brønn | 199,4 (± 20.3) | 24 (± 2,7) | 47,5 (± 3,1) |
Tabell 1. Normale parametere for XF24 analysen: Den gjennomsnittlige basal (Rate 3) og oksidativ burst (Rate 7) OCR ikke korrigert til nonmitochondrial OCR eller protein er vist av celletype belagt på de angitte celletettheten. Den gjennomsnittlige proteininnhold per brønn er vist som utføres av en DC-Lowry-analysen. Disse data representerer de gjennomsnittlige verdier av6-8 friske donorer med parentes inneholder ± SEM.
| Trinn | Problem | Mulig årsak | Oppløsning |
| 1.2 | klar plasma | blodplater pelleterte under sentrifugering | redusere sentrifuge tid til 10 min eller treg til 400 xg |
| milky plasma | skytende lipider | unngå postprandial samling | |
| 1.6 | ufullstendige celle band dannet | impRoper gradient forberedelse, kaldt reagens | unngå å forstyrre gradient under pipettering, bruk romtemperatur reagens |
| klumper i celle band | koagulering av blod kan ha skjedd | Samle blod ved hjelp av antikoagulantia som ACD eller EDTA | |
| 1,10 | ingen celle pellet | se trinn 1.6 | Hvis supernatant disig se nedenfor |
| disig supernatant | Heavy Ficoll gradient forurensning, platelet forurensning | Øk sentrifugehastigheten til 900 xg, dilutt med mer RPMI | |
| 1.16, 1.17 | lav avkastning av leukocytter | tung RBC forurensning, ikke nok fullblod, blodpropp | Dobbel antistoff og RPMI-BSA volumer, samle inn mer blod, legge antikoagulerende |
| 1.19 | trombocyttaggregasjon | PGI 2 utelatt, eksponering for kulde media, langvarig lagring i plasma | legge PGI 2 til platevaskebuffer, bruk romtemperatur reagenser |
| 1,20 | lavt antall blodplater | tap under primærsentrifugering, blodplateaggregasjon | Setrinn 1,2 og 1,19 |
| 2.3 | RBC forurensning | Gjenta MACS separasjon |
Tabell 2. Leukocytter og blodplater isolasjon feilsøking. Tabellen viser vanlige problemer som oppstår i løpet av leukocytter og blodplater celle isolasjon fra fullblod og løsninger som kan veilede brukerne gjennom feilsøkingen.
Discussion
Denne protokollen representerer sammenstilling av flere vanlig anvendte teknikker for blodcelleisolasjon på en måte som passer for bioenergetikk analyse. De sammenhengende teknikkene presentert er en fordel for andre isolasjonsmetoder (dvs. FACS-analyse) for deres evne til å isolere et stort antall celler under kontrollerte betingelser media med minimale påkjenninger som legges på de isolerte celler. Det har den ulempen med lange isoleringer selv med minimale avbrudd. Denne protokollen fungerer som grunnlag for isolering av primære blodceller fra mennesker, som kan ekstrapoleres i kliniske innstillinger og translasjonell forskning.
MACS separasjon er en pålitelig celleisolasjon teknikk som gir mulighet for å isolere celler direkte fra helblod, men krever denne metoden større mengder av antistoff og er ikke optimal for isolering av alle fire forskjellige celletyper som er beskrevet i denne fremgangsmåte. Det har been ingen bevis for å vise at positiv utvelgelse av leukocytter ved MACS atskillelse skyldes i aktivering ved hjelp av vår isolasjon protokollen. MACS-kolonner som virker ved lagring av merkede celler i et magnetisk felt ved hjelp av antistoffer konjugert til 50 nm superparamagnetiske partikler. Merkede celler blir deretter eluert fra kolonnen. Positive og negative valgene er implementert i denne protokollen for å sikre rask isolasjon og renhet. Hvis utilstrekkelig celletall er oppnådd fra isolering eller renhet er aktuelle, kan flere antistoffer tilsettes til prøven i henhold til leverandørens instruksjoner og andre passasje gjennom LS kolonnen kan føre til større renhet (tabell 2). Våre laboratorie funnet høy renhet og pletteringseffektiviteten ved bruk av eksisterende protokoll ved å analysere endelige cellesuspensjoner ved FACS-analyse 8..
Ekstracellulære fluks analysatorer har evnen til å overvåke både oksygenforbruket og media surgjøring i sanntid over det av othennes elektroder. Den oksygenforbruk som observert ved oksidativ brist respons hos monocytter og nøytrofiler er NADPH oksidase avhengig som vist ved inhibering med DPI 8.. Vi har sett en tidsavhengig tap i oksidativ burst kapasiteten med langvarig isoleringer eller utvidet XF-analyser. Denne protokollen ble konstruert og utviklet for bruk på XF24 men er også kompatibelt med XF96 på omtrent en tredjedel til en halvdel av cellen XF24 seeding tetthet (Figur 3).
I utformingen av denne protokollen, ble tilslutning til eksisterende protokoller for hver teknikk er nødvendig for optimal ytelse med endringer gjort utelukkende for å styre medie betingelser for bioenergetisk analyse. Etter å mestre teknikker, kan en slik protokoll brukes i et bredt spekter av translasjonsforskning og forskning applikasjoner å måle toksisitet eller effektiviteten av behandlingsstrategier, utforske metabolske karakteristikker av sykdom, og oxidant produksjon av monocytter og neutrophils i inflammatoriske tilstander.
Disclosures
VDU er medlem av Seahorse Biovitenskap Scientific Advisory Board.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke teknisk bidrag på Gloria A Benavides. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), NIDDK diabetiske komplikasjoner Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) stipend DK076169 (subaward VDU), og O'Brien senter P30 DK079337 (VDU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
| CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
| CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
| CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
| Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
| 1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
| Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
| Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
| XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
| DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
| L-Glutamine, 200 mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
| D-Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
| Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| (FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
| DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
| DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
| QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
| Spectrophotometer |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).
- Jin, S. Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis. Autophagy. 2, 80-84 (2006).
- Cordero, M. D., et al. Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease. Arthritis Res. Ther. 12, R17 (2010).
- Japiassu, A. M., et al. Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity. Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).
- Widlansky, M. E., et al. Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes. Transl. Res. 156, 15-25 (2010).
- Shi, C., et al. Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets. Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).
- Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).
- Hultqvist, M., et al. Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).
- Rosa-Borges, A., et al. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report. J. Ped. 77, 331-336 (2001).
- Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation. Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).
- Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).
