Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Bioenergetik og oxidativ Burst: Protokoller til isolering og Evaluering af humane leukocytter og blodplader

doi: 10.3791/51301 Published: March 27, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Blod leukocytter og blodplader kan anvendes som en markør for samlede bioenergetic sundhed af en person og så har potentiale til at overvåge patologiske processer og virkningen af ​​behandlinger. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at isolere og måle mitokondriefunktionen og oxidative burst i disse celler.

Abstract

Mitokondriel dysfunktion vides at spille en væsentlig rolle i en række patologiske tilstande, såsom atherosklerose, diabetes, septisk chok, og neurodegenerative sygdomme, men at vurdere ændringer i bioenergetic funktion i patienter er udfordrende. Selv om sygdomme såsom diabetes eller åreforkalkning foreliggende klinisk specifikke organsvækkelse den systemiske komponenter i patologi, såsom hyperglykæmi eller inflammation, kan ændre bioenergetic funktion i cirkulerende leukocytter eller trombocytter. Dette koncept er blevet anerkendt i nogen tid, men dens udbredte anvendelse er begrænset af det store antal af primære celler er nødvendige for bioenergetic analyse. Denne tekniske begrænsning er blevet overvundet ved at kombinere specificiteten af ​​de magnetiske perle isolation teknikker, celleadhæsions teknikker, som tillader celler, der skal fastgøres uden aktivering til mikroplader, og følsomheden af ​​nye teknologier designet til high throughput mikrofonroplate respirometri. Et eksempel på dette udstyr er det ekstracellulære flux analysatoren. Sådanne instrumenter bruger typisk oxygen-og pH-følsomme prober til at måle ændringer i disse parametre i adhærente celler, som kan derefter blive relateret til metabolisme. Her har vi detaljeret metoder til isolering og plettering af monocytter, lymfocytter, neutrofile og blodplader, uden aktivering, fra humant blod og analyse af mitokondrie bioenergetic funktion i disse celler. Derudover viser vi, hvordan den oxidative burst i monocytter og neutrofile kan også måles i de samme prøver. Da disse metoder bruger kun 8-20 ml humant blod, de har potentiale til overvågning af reaktive oxygenformer generering og bioenergetik i et klinisk miljø.

Introduction

Overvågning bioenergetic sundhed immunceller (monocytter, lymfocytter, neutrofile) og blodplader fra blod er blevet anerkendt i nogen tid som et potentielt nyttigt diagnostisk redskab til at vurdere den samlede bioenergetic sundhed af en person. Der er en spirende mængde litteratur tilskrive en række sygdomme som kræft, hjerte-kar-sygdomme og neurodegenerative sygdomme til mitokondriedysfunktion 1,2. Det er klinisk vigtige, idet mitokondriel dysfunktion kan iværksætte en række cellulære begivenheder, der fremmer pro-inflammatoriske signalveje eller føre til celledød. Adskillige undersøgelser har karakteriseret mitokondriefunktion af perifere mononukleære blodceller og blodplader i forhold såsom fibromyalgi, diabetes, septisk chok, og Alzheimers sygdom 3-7. For eksempel en nylig undersøgelse evaluerede bioenergetik blodplader som en markør for mitokondriefunktionen og fandt, at blodplader fra Type 2 Diabetic patienterne havde formindsket mitokondrie iltforbrug 7,8. Fra disse resultater og andre, er det klart, at monocytter, lymfocytter, neutrofiler og blodplader kan tjene som surrogatmarkører af ændringer i bioenergetik under patologiske tilstande, idet de kortlægge den systemiske cirkulation og kan afspejle lokale og globale metaboliske ændringer. At afgøre, om denne fremgangsmåde har prognostisk eller diagnostisk værdi en high throughput analysemetode og en ensartet metode til forberedelse celle er nødvendig.

De metoder til at måle mitokondriefunktionen i leukocytter og blodplader har tidligere involveret isolering af mitokondrier eller vurdering af cellulære bioenergetik i intakte celler 4,9. Fordelen ved cellulære bioenergetic vurdering ved hjælp af en ekstracellulær flux (XF) Analysatoren at mitokondriefunktionen i celler kan etableres med endogene substrater og respiratoriske parametre såsom proton lækage og maksimal respiratoriskkapacitet kan bestemmes. Vi og andre har brugt denne teknologi til at vise, at bioenergetic profiler i blodplader, kan etableres monocytter og lymfocytter isoleret fra humant blod og sammenlignet blandt celletyper 8. Desuden har begge neutrofile og monocytter besidder en oxidativ burst i hvilken egenskab NAPDH oxidaser aktiveres og forbruge ilt til at danne superoxid. Vigtigere er det, denne vej er en vigtig del af medfødt immunitet og moduleres af systemisk inflammation. For eksempel er det blevet vist, at ændringer i den oxidative burst kapacitet er forbundet med forskellige autoimmune sygdomme, såsom multipel sklerose, arthritis og tilbagevendende infektioner 10,11. I øjeblikket er der ingen høj kapacitet kvantitative analyser rådighed til at måle oxidative burst i kliniske prøver. Dette er vigtigt, da karakterisere den oxidative burst kapacitet af neutrofiler og monocytter kan også tjene som et vigtigt diagnostisk redskab for flere pathologier.

De vigtigste tekniske udfordringer har været lav følsomhed til måling af ilt forbrug ved hjælp af konventionelle polarografiske teknikker og behovet for at bruge vedhæftede celler, når du bruger mere følsomme mikroplade fluorometrisk teknikker. I denne praktiske video beskriver vi den tekniske løsning på disse problemer. Vi detalje metoder til isolering, plating og måling af bioenergetik af monocytter, lymfocytter, neutrofile og blodplader og den oxidative burst af monocytter og neutrofile fra humant blod. Denne metode er velegnet til klinisk vurdering af bioenergetik og oxidativ burst for efterforskerne, der har adgang til en patientpopulation, og evnen til at opnå nye blodprøver.

Protocol

Alle protokoller, der er beskrevet i dette manuskript til blodtapning, isolation og analyse er blevet gennemgået og godkendt af Institutional Review Board ved University of Alabama i Birmingham.

1.. Cell Isolation (modificeret fra Histopaque Sigma-Aldrich protokol nr. 1119 og Miltenyi Biotec microbead Positiv og negativ selektion protokoller)

  1. Centrifuge fuldblod (indsamlet i ACD eller EDTA-rør) ved 500 xg i 15 min i en centrifuge med en swingende-spand rotor (acceleration = 5-6, og ingen bremse).
  2. Fjern det øverste lag, der indeholder blodpladerige plasma (PRP) med en overførsel pipette indtil 1 cm forbliver over cellelag (erythrocyt / buffy coat). Braklægning PRP ved stuetemperatur til forarbejdning senere.
  3. Overfør fibrinlaget til et sterilt 50 ml konisk rør, fortyndes til 24 ml med basal RPMI eller i det mindste 4x start buffy coat volumen.
    Bemærk: Den øverste halvdel af RBC lag kan have at indgå, selvom dette vil resultere i at øge RPMI volumen proportionalt.
  4. Forbered densitetsgradienten hjælp af lav tæthed Ficoll med en vægtfylde på 1,077 (1077) for det øverste lag og høj tæthed Ficoll med en massefylde på 1.119 (1119) til det nederste lag i tre 15 ml koniske rør (3 ml hver). For at udføre dette trin, først tilføje 1077 til hvert rør. Ved hjælp af en 5 ml smal pipette tilsættes 1119 til bunden af ​​røret ved at placere pipettespidsen under 1077 og langsomt frigive reagensen uden opblanding med den øvre gradient. I alt 6 ml densitetsgradient medier bør være til stede på dette tidspunkt med en synlig fase af separation på 3 ml mærket.
  5. Ved hjælp af en automatiseret pipette tilsættes 8 ml fortyndet blod (fra trin 1.3) forsigtigt til hver gradient rør ved hjælp af den energibesparende indstilling til at forhindre forstyrre gradient lag. Det samlede volumen skal være 14 ml ved dette trin.
  6. Centrifugerør ved 700 xg i 30 minutter ved stuetemperatur (acceleration 6, ingen bremse).
    Bemærk: På dette stadium skal tre distinkte celle bands være indlysende (figur 1A). De øverste bånd (mellem 1077 og plasma) indeholder mononukleære celler (multinationale selskaber) og blodplader og den midterste bånd (mellem 1007 og 1119) indeholder polymorfonukleære celler (PMN'er) og nederste bånd (under 1119) indeholder roede blodlegemer.
  7. Saml MNC og PMN separat ved hjælp af sterile glaspipetter uden at forstyrre andre celle bands. Kombiner MNC befolkning fra hvert rør i en steril 50 ml konisk rør. Gentag dette for PMN befolkning så godt.
  8. Tilføj 4 volumener RPMI til hvert rør indeholder MNC og PMN fraktioner henholdsvis at fortynde densitetsgradient.
  9. Centrifugerør ved 700 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
  10. Resuspender MNC cellepellet og PMN cellepelleten i 1 ml RPMI indeholdende 0,5% ultrarent fedtsyrefrit BSA (RPMI-BSA) og overføres til sterile 1,5 ml rør. Pelletere celler under anvendelse af en benchtop picofuge 30sek.
  11. Bortkast supernatanten og resuspender hver cellepellet i 80 pi RPMI-BSA.
  12. Tilsæt 20 ul af magnetisk perle mærkede antiCD14 antistof til rør, der indeholder MNC fraktion til positiv selektion af monocytter. For røret fraktion PMN celle, tilsættes 20 pi magnetisk perle mærkede antiCD15-antistof til positiv selektion af neutrofiler. Inkuber hver celle suspension i 15 min ved 4 º C.
  13. Vask hver celle suspension med 1 ml RPMI-BSA medier og pillefyr som før og resuspender hver pellet i 500 ul RPMI-BSA.
  14. De mærkede celler separeres i magnetfeltet af magnetisk cellesortering (MACS) separatoren. Forbered MACS LS søjler (en for hver celle suspension) ved at placere søjlen MACS separator og vask med 3 ml RPMI-BSA inden tilsætning af cellesuspensionen.
  15. Efter anvendelse cellesuspensioner, vask hver kolonne 3x med 3 ml RPMI-BSA medier (sørg for at lade medierne drain helt mellem hver vask). Saml cellesuspensionen gennemstrømning og kolonne vasker i en steril rør.
  16. For at isolere monocytter og neutrofiler, fjerne søjlen fra magnetfeltet efter den sidste vask og elueres positivt selekterede celler i et sterilt rør med 5 ml RPMI-BSA ved hjælp af kolonne stemplet.
  17. For at isolere lymfocytter pelletere gennemstrømning-vaskefraktion af MNC'er fra trin 1,15 ved 300 xg i 10 min. Bortkast supernatanten og resuspender cellepelleten i 80 pi RPMI-BSA. Tilsæt 20 ul af CD61 og CD235a antistoffer og inkuberes celle suspension i 15 min ved 4 º C. Gentag MACS adskillelse som før og samle strømmen selvom der indeholder lymfocytter.
  18. At bundfælde monocytter, neutrofiler og lymfocytter brøker, centrifuge som før (trin 1.9) og kassér supernatanter. Cellepellets bør resuspenderes i 1 ml ekstracellulære flux medier (XF-DMEM) til tælling. <br /> Bemærk: 8 ml fuldblod bør resultere i 1-5 x 10 6 monocytter / ml og 5-20 x 10 6 lymfocytter og neutrofiler / ml.
  19. At isolere blodplader, centrifuge PRP (trin 1.2) i 8-10 min ved 1.500 xg ved stuetemperatur. Fjern plasma og vaske cellepellet gang med sterile 5 ml PBS suppleret med 1 ug / ml PGI2, repellet og suspenderer endelige pellet i 1 ml PBS-PGI2 puffer.
  20. Bestem blodplader ved turbidimetri når blodplader suspenderes i PBS-PGI2 puffer ved spektrofotometer som beskrevet af Walkowiak et al hjælp af følgende ligning: [6,23 / (2.016 - Abs 800)] - 3,09 x fortyndingsfaktor = # x 10 8. blodplader / ml 12.

2. Belægning af cellerne

  1. Udarbejdelse af Cell-Tak (celle lim): Tilføj 90 pi celle klæbemiddel til 180 pi DIH 2 0, 540 pi 0,1 N natrium bicarbonat (pH 8,0) for at justere pH til 7,2-7,8 ​​ved anvendelse af 1 N NaOH. Forbered XF plader (24 brønde, V7 mikroplader) ved belægning hver brønd med 30 ul forberedt celle lim.
    Bemærk: Cellen lim skal tilberedes frisk for hver anvendelse.
  2. Inkubér pladen ved 37 º C i 20-30 min og derefter aspirer celle lim og vaske brøndene med PBS to gange (1 ml / brønd).
  3. Udfør en celletælling på isolerede monocytter, lymfocytter, neutrofile og blodplader og bringe til passende volumen ved hjælp af XF-DMEM at tillade en podningstæthed på 250k celler / brønd for monocytter, lymfocytter og neutrofile, og 25 x 10 6 / godt for blodplader. Alternativt at måle oxidative burst svar, neutrofiler kan podet ved 125k celler / brønd. Det endelige seeding volumen for hver celle suspension bør være 200 ul / brønd.
  4. Centrifugeres pladen ved 200 x g i 1 sekund uden bremse. Drej pladen 180 ˚ og centrifuger igen med ingen bremse ved 300 x g.
  5. Bring endelig godt vol.ume til 660 pi med XF-DMEM og inkuberes ved 37 º C i 30 min før XF analyse. Bemærk: mikrofotografier af udpladede celler før og efter analysen kan anvendes til at sikre tilstrækkelig plettering og udelukke celle løsrivelse.

3. Fremstilling af en 24-brønds Ekstracellulære Flux Assay Plate (XF24)

  1. Hydrate XF prober med kalibrator opløsning i mindst 2 timer før assay.
  2. Forbered 10x lagre af 0,5 ug / ml oligomycin, 0,6 uM FCCP og 10 uM antimycin i XF-DMEM og belastning 75 pi stamopløsninger i patron indsprøjtningsåbninger i ovenstående rækkefølge. Hvis oxidative burst målinger er at der opnås, kan injektion af 10x bestand på 100 ng / ml PMA injiceres efter antimycin-A.
  3. Kalibrer hydreret og lastet patron og udfører XF analysen. De nærmere metoder til analyse og fortolkning af ændringer både forbrug og pH-ilt er blevet beskrevet i tidligere udgivelser 9,13,14 og er ikke discussed i detaljer her.
  4. Efter XF assay aspireres alle undtagen de sidste 50 pi XF-DMEM efter assay for at forhindre tab af celler fra pladen, og der tilsættes 50 pi RIPA cellelyse-buffer og udføre et protein assay for normalisering.

Representative Results

For at vurdere de bioenergetik blodceller er fuldblod tappet fra menneskelige forsøgspersoner ved venepunktur i et EDTA eller ACD vacutainer samling rør. Isolering af leukocytter og blodplader efter blodprøvetagning visualiseres i figur 1A, som beskrevet i protokollen. Blodprøver Hele behandles inden 8 timer for indsamling for at undgå celledød og aktivering. Udvidet større end 8 timers opbevaringstid er ikke blevet testet, men kan resultere i ændrede bioenergetik og være mindre repræsentativ for fysiologiske betingelser. Syrecitrat dextrose (ACD-8 ml) og EDTA vacutainerrør er blevet anvendt til celle isoleringer uden nogen effekt på bioenergetic funktionen af ​​isolerede celler. Antikoagulanter er nødvendige, så blodpropper reducere antallet af celler opnået, forstyrre korrekt fasedannelse under Ficoll-gradientcentrifugering og resultere i lidt at ingen blodplader opnået i centrifugeret serum. Alle blod repræsenterer en biologistiCal fare og personlige værnemidler skal gennemføres under hele proceduren selv efter cellepopulationer er isolerede eller cellelysater er genereret. Prøverne skal bortskaffes i overensstemmelse med institutionens normer menneskelige affald.

Helblod centrifugeres for at adskille blodpladerigt plasma fra fibrinlaget, det hvide lag lige over de pakkede røde blodlegemer, som indeholder leukocytter. Buffy coat påføres densitetsgradienter og centrifugeret til opnåelse af de perifere blod mononukleære celler (monocytter og lymfocytter) og polymorfkernede celler (granulocytter). RBC forurening af de enkelte multinationale og PMN cellefaser er almindelig på dette stadium og bør løses i MACS rensning. De forskellige celletyper fås derefter ved inkubation med magnetiske antistoffer for at opnå rene fraktioner. Monocytter opsamles ved inkubering af PBMC fraktion med CD14, gennemløbet fra than monocytter indeholder lymfocytter, som derefter depleteret for RBC og blodplader. Neutrofilerne opnås ved inkubering af polymorfkernede cellelag med CD15-antistof (figur 1A). Derefter kan blodpladerne pelleteres ved centrifugering af blodpladerigt plasma og vaskes for at fjerne andre plasma-komponenter. Efter disse valg blodpladerne, CD14 +-monocytter, lymfocytter, CD15 + neutrofile kan tælles og belagt på en celle vedhæftning medium-belagt XF analysator plade til bioenergetik og oxidativ burst analyse.

Hvert trin i proceduren skal udføres under sterile forhold og er opmuntret til at forhindre for tidlig aktivering af oxidative burst respons i monocytter og neutrofile. En indikator for mindre end sterile forhold under isolation er tydelig, når neutrofiler, der har lidt at ingen iltforbrug under basale forhold, begynder den ekstracellulære flux assay med forhøjede OCR målinger,gradvist øge eller afvise hele analysen. Vi understreger betydningen af ​​billeddannelse celler ved lysmikroskopi ved 200X eller højere for at sikre, at ingen morfologiske tegn på aktivering har fundet sted forud for analysen. For eksempel normalt neutrofiler vise en afrundet til uregelmæssig form med udtalt cellegrænser som vist i fig 1B. Imidlertid vil disse celler flade mod overfladen af ​​pladen, når den aktiveres og miste deres forskellige cellemorfologi. Vi har tidligere rapporteret de morfologiske ændringer i aktiverede leukocytter og blodplader ved hjælp af denne protokol og der skal træffes yderligere foranstaltninger for at sikre sterile forhold, hvis støde aktivering 8.

En forenklet ordning af protokollen ses i figur 2 som en tidsplan, hvor de primære trin i celleisolering, XF plade forberedelse, og XF-analysen er detaljeret. Isolering består af densitetsgradient separation celletyperfølges ved magnetisk separation. Parallelt med celleisolering processen er nødvendig XF plade forberedelse at undgå forsinkelser i celleudpladning eller begynder XF analysen. Dette er kritisk, fordi betydelige forsinkelser kan føre til celle aktivering og formindsket bioenergetik parametre.

Utilstrækkelige cellekoncentrationer efter isolering er et fælles problem og optimering af hver centrifugering proces er nødvendig for at undgå celle tab. Vellykket isoleringer er blevet udført på så lidt som 6 ml blod, men ændringer kan foretages afhængigt cirkulerende koncentrationer af det ønskede celletype. Hvis densitetsgradienten uretmæssigt er forberedt, kan distinkte cellefaser ikke være synlig og tab af celler kan forekomme (se JOVE instruktionsvideo for en visuel demonstration). Utilstrækkelig blodplader isoleret fra PRP er sjælden, men der er opstået, hvis vaskepuffer ikke indeholder PGI2 eller hvis isoleringen sker under stuetemperatur. Risikoen for blodplader activation er ofte forebygges, hvis blodplader er de sidste celler, der skal isolerede, men hvis blodplader forbliver i vaskebuffer i længere perioder de bioenergetik vil blive berørt. Der har været tilfælde af mindre blodplade befolkningsgrupper, der ikke pellet under 1.500 xg centrifugering og bioenergetik af disse celler er ikke blevet grundigt karakteriseret. Se tabel 2 for en mere komplet fejlfinding vejledning.

De bioenergetic profiler af leukocytter og blodplader kan bestemmes under anvendelse XF analysator, som måler realtid O 2 forbrug i celler på ikke-invasiv. Hver celletype udplades på XF24 plade med fem gentagelser, som vist i figur 3A. Tabel 1 angiver forventede basal og oxidativ burst værdier ved celletype under analysen og de gennemsnitlige koncentrationer protein pr godt. Højere throughput teknologier er tilgængelige, såsom XF96, som giver mulighed forfire donorer, der skal vurderes samtidig som vist i figur 3B. Efter analysen er data eksporteres til en arbejds-station computer til analyse ved hjælp af den passende XF software og Microsoft Excel. OCR-værdier blev normaliseret til totalt proteinindhold i de tilsvarende brønde og udtrykt som pmol / min / mg protein. De repræsentative bioenergetic-oxidativ burst profiler af hver celletype blev for nylig rapporteret af vores gruppe 8. Kan beregnes Yderligere analyse af bioenergetic parametre for analysen (basal ATP-linked, proton lækage, maksimal, nonmitochondrial og oxidativ burst) for individuelle brønde som tidligere vist og beskrevet under 8.

Den basale iltforbrug sats (OCR) er etableret af de første 3 målinger som vist i figur 4A. Oligomycin (0,5 mg / ml), er en hæmmer af mitokondrie ATP-syntase sprøjtes ind i XF medium til at estimere OCR koblet til ATP syntese og repræsen TED som ATP-forbundet. Den resterende OCR minus nonmitochondrial OCR kan tilskrives proton lækage. Derefter tilsættes FCCP en afkobler at bestemme den maksimale OCR, efterfulgt af antimycin-A, en hæmmer af mitokondrie åndedræt, for at bestemme nonmitochondrial kilder iltforbrug. Reserve kapacitet er et mål for mængden af ​​ATP, der kan produceres under energisk efterspørgsel og kan beregnes som forskellen mellem den maksimale respiration og basal. For at bestemme den oxidative burst kapacitet, phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) en PKC agonist injiceres at øge NADPH-oxidase-aktivitet, og kan måles stigningen i iltforbrug efter PMA-stimulering bruge XF analysatoren. 4B vise, hvordan man beregner de forskellige parametre for mitokondriefunktionen og oxidative burst.

1301/51301fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg "/>
Figur 1.. Isolering af leukocytter og blodplader fra fuldblod. A) Frisk indsamlede prøver er adskilt i deres plasma og cellulære komponenter ved centrifugering og oprenset ved Ficoll-densitetsgradient, og magnetisk cellesortering (MACS) af positive (monocyt-og neutrofiler) eller negativ udvælgelse (lymfocytter), mens blodplader isoleres ved høj hastighed centrifugering af blodpladerige plasma. B) Billeder af de isolerede cellepopulationer engang resuspenderet i XF DMEM og forgyldt ved angivne celletætheder. Klik her for at se en større version af dette tal.

ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg "/>
Figur 2.. Forberedelse af XF24 plader til bioenergetic studier af leukocytter og blodplader. Detaljeret tidsplan for udarbejdelsen af en XF24 assaypladen ved celle isolation og plettering og patron hydrering og injektion port belastning.

Figur 3
Figur 3. Layout af leukocytter og blodplader på XF24 og XF96 analysator plader. A) Leukocytter (125-250k celler / brønd) og blodplader (25 x 10 6 celler / brønd) fra en enkelt donor udplades på XF24 assaypladen blandt baggrund kontroller. 75 pi 10x lagre af oligomycin (0,5 ug / ml), FCCP (0,6 uM), antimycin-A (10 pM) og PMA (100 ng / ml) fortyndet i XF medier er lagt itil de angivne indsprøjtningsåbninger. B) Leukocytter (75-150k celler / brønd) og blodplader (10 x10 6 celler / brønd) fra så mange som fire donorer kan udpladet på XF96 i et samlet volumen på 180 pi XF-DMEM. 20 pi 10x lagre af oligomycin (1,0 ug / ml), er FCCP (0,6 uM), antimycin-A (10 uM), og PMA (100 ng / ml) fortyndet i XF-DMEM indlæst i de angivne indsprøjtningsåbninger.

Figur 4
Figur 4.. Analyse af bioenergetic indeks. A) Repræsentant spor af iltforbrug (OCR) ved mitokondrier og oxidativ burst i monocytter. Basal OCR er etableret (første 3 satser er angivet med tal i cirkler). Derefter sekventielle tilsætninger af oligomycin (O; 0,5 mg / ml), FCCP (F; 0,6 uM) og antimycin-A (A, 10 uM) injiceres at bestemme mitokondrielle og nonmitochondrial respiration ikke-aktiverede celler. Endelig er der tilføjet PMA (100 ng / ml) til at måle oxidativ burst. B) Modulopbygget analyse af mitokondrie funktion og oxidative burst beregnes ved forskellene i satserne som angivet.

Optimal podningstæthed Gsn. Basal OCR (pmol O 2 / min) Gsn. Oxidativ Burst OCR (pmol O 2 / min) Gsn. protein (pg) / brønd
Monocytter 250k celler / brønd 83,9 (± 13,0) 300,3 (± 58,8) 19,0 (± 2,4)
250k celler / brønd 6,1 (± 2,2) 1411,8 (± 233,3) 20,6 (± 2,7)
Lymfocytter 250k celler / brønd 52,9 (± 7,7) 15 (± 4,1) 13,2 (± 2,1)
Blodplader 25 x 10 6 celler / brønd 199,4 (± 20,3) 24 (± 2,7) 47,5 (± 3,1)

Tabel 1. Normale parametre for XF24 analysen: Den gennemsnitlige basal (Rate 3) og oxidative burst (Rate 7) OCR ikke korrigeret til nonmitochondrial OCR eller protein er vist med celletype forgyldt på de angivne celletætheder. Er vist gennemsnitligt proteinindhold pr samt udføres af en DC Lowry assay. Disse data repræsenterer middelværdier af6-8 raske donorer med parentes indeholdende ± SEM.

Step Problem Mulig årsag Opløsning
1.2 klar plasma blodplader pelleteret under centrifugering formindske centrifugering tid til 10 minutter eller langsom til 400 xg
mælkeagtig plasma overskydende lipider undgå postprandial samling
1.6 ufuldstændige celle bands dannet impRoper gradient forberedelse, kold reagens undgå at forstyrre gradient under pipettering, brug stuetemperatur reagens
klumper i celle bands størkning af blod kan være opstået Indsaml blod ved hjælp antikoagulanter såsom ACD eller EDTA
1.10 ingen cellepellet se trin 1.6 Hvis supernatant tåget se nedenfor
diset supernatant Heavy Ficoll gradient forurening, forurening blodplader Øg centrifugeringshastigheden til 900 xg, dilut med mere RPMI
1,16, 1,17 lavt udbytte af leukocytter tung RBC forurening, ikke nok fuldblod, koagulation Dobbelt antistof og RPMI-BSA mængder, indsamle mere blod, tilføjer antikoagulerende
1.19 blodpladeaggregering PGI 2 udelades, udsættelse for kulde medier, længere tids opbevaring i plasma tilføje PGI 2 til blodplader vaskepuffer brug stuetemperatur reagenser
1.20 lavt antal blodplader tab under primær centrifugering, trombocytaggregation Setrin 1.2 og 1.19
2.3 RBC forurening Gentag MACS separation

Tabel 2. Leukocyt-og trombocyttal fejlfinding isolation. Tabellen viser almindelige problemer under leukocyt-og trombocyttal celleisolering fra fuldblod og løsninger, der kan lede brugerne gennem fejlfinding proces.

Discussion

Denne protokol udgør kompilationen af ​​flere almindeligt anvendte teknikker til blodlegemer isolation på en måde egnet til bioenergetik analyse. De sammenhængende, der præsenteres, er fordelagtige til andre isoleringsmetoder (dvs. FACS-analyse) for deres evne til at isolere et stort antal celler i kontrollerede medier vejrforhold med minimale spændinger placeret på de isolerede celler. Det har den ulempe, at langvarige isolationer selv med minimale afbrydelser. Denne protokol tjener som grundlag for isolering af primære blodceller fra mennesker, der kan ekstrapoleres til kliniske indstillinger og translationel forskning.

MACS separation er en pålidelig celleisolering teknik, der giver mulighed for at isolere celler direkte fra fuldblod, men denne metode kræver større mængder af antistof og er ikke optimal til isolering af alle fire forskellige celletyper som beskrevet i denne metode. Der har bEen ingen beviser for, at den positive udvælgelse af leukocytter ved MACS separation resulterer i aktivering ved hjælp af vores isolation protokol. MACS kolonner fungerer ved binding af mærkede celler i et magnetisk felt under anvendelse af antistoffer konjugeret til 50 nm superparamagnetiske partikler. Mærkede celler elueres derefter fra søjlen. Positive og negative markeringer er implementeret i denne protokol for at sikre hurtig isolation og renhed. Hvis utilstrækkelige celleantal fås fra isolation eller renhed er i spørgsmålet, kan flere antistoffer tilsættes til prøven, som pr sælgers instruktion og anden passage gennem LS kolonne kan resultere i større renhed (tabel 2). Vores laboratorium fundet høj renhed og udpladningseffektivitet brug af den eksisterende protokol ved at analysere de endelige cellesuspensioner ved FACS-analyse 8.

Ekstracellulære flux analysatorer har evnen til at overvåge både iltforbrug og medier forsuring i realtid via det af othendes elektroder. Forbruget ilt som observeret af oxidative burst respons i monocytter og neutrofile er NADPH oxidase afhængig som vist ved hæmning med DPI 8. Vi har set en tidsafhængig tab i oxidative burst kapacitet med langvarige isolationer eller udvidede XF assays. Denne protokol blev designet og udviklet til brug på XF24 men er også kompatibel med XF96 på cirka en tredjedel til halvdelen af XF24 cellepodning tætheder (figur 3).

I design af denne protokol, blev tilslutning til eksisterende protokoller for hver teknik er nødvendig for optimal ydeevne med lavet udelukkende for at styre medieforhold for bioenergetic analyse ændringer. Efter mastering teknikker, kan en sådan protokol skal anvendes i en bred vifte af translationelle og forskning applikationer til at måle toksicitet eller effektiviteten af ​​behandlingsstrategier, udforske metaboliske karakteristika af sygdom, og oxidant produktion af monocyt og neutrophils i inflammatoriske tilstande.

Disclosures

VDU er medlem af Seahorse Bioscience Scientific Advisory Board.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende det tekniske bidrag af Gloria A Benavides. Dette arbejde blev støttet af American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), NIDDK diabetiske komplikationer Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) tilskud DK076169 (subaward VDU) og O'Brien center P30 DK079337 (skærmarbejde).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-094-833
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-050-501
CD61 MicroBeads, human  for platelets Miltenyi Biotec 130-051-101
CD14 MicroBeads, human  for monocytes Miltenyi Biotec 130-050-201
CD15 MicroBeads, human  for granulocytes Miltenyi Biotec 130-046-601
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes Fisher 02-684-26
RPMI 1640 Gibco 11835-030 with L-glutamine and without phenol red
Prostaglandin I2, sodium salt Cayman 18220
1.5 ml semi-micro cuvettes Phenix Research Products SC-2410
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 Sigma 10771
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 Sigma 11191
Bovine Serum Albumin Fraction V Roche 3117405001 fatty-acid ultra-free
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma P8139
XF24 FluxPak Seahorse Biosciences 100850-001
DMEM Fisher MT90113PB w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate
L-Glutamine, 200 mM (100x) Invitrogen 25030-081
D-Glucose Sigma G7528
Sodium Pyruvate Sigma P8574
Cell-Tak (cell adhesive) BD Biosciences CB-40242
Oligomycin Sigma O4876
Antimycin A Sigma A8674
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma C-2920
DC Protein Assay Reagent A Bio-Rad 500-0113
DC Protein Assay Reagent S Bio-Rad 500-0015
DC Protein Assay Reagent B Bio-Rad 500-0114
Seahorse Seahorse Biosciences
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-090-976 and 24039
Spectrophotometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).
  2. Jin, S. Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis. Autophagy. 2, 80-84 (2006).
  3. Cordero, M. D., et al. Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease. Arthritis Res. Ther. 12, R17 (2010).
  4. Japiassu, A. M., et al. Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity. Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).
  5. Widlansky, M. E., et al. Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes. Transl. Res. 156, 15-25 (2010).
  6. Shi, C., et al. Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets. Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).
  7. Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).
  8. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).
  9. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).
  10. Hultqvist, M., et al. Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).
  11. Rosa-Borges, A., et al. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report. J. Ped. 77, 331-336 (2001).
  12. Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation. Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).
  13. Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).
  14. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).
Bioenergetik og oxidativ Burst: Protokoller til isolering og Evaluering af humane leukocytter og blodplader
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kramer, P. A., Chacko, B. K., Ravi, S., Johnson, M. S., Mitchell, T., Darley-Usmar, V. M. Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets. J. Vis. Exp. (85), e51301, doi:10.3791/51301 (2014).More

Kramer, P. A., Chacko, B. K., Ravi, S., Johnson, M. S., Mitchell, T., Darley-Usmar, V. M. Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets. J. Vis. Exp. (85), e51301, doi:10.3791/51301 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter