Summary
Det primära effektmåttet i kliniska försök för neuromuskulära sjukdomar är allmänt förbättrad muskelfunktion. Därför att bedöma effekten av potentiella terapeutiska föreningar på muskelprestanda pre kliniskt i musmodeller är av stor betydelse. Vi här beskriver flera funktionella tester för att ta itu med detta.
Abstract
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en allvarlig och progressiv muskelförtvining sjukdom för vilken inget botemedel finns. Trots detta har flera potentiella läkemedelspreparat och genterapi metoder utvecklats i kliniska prövningar. Med förbättrad muskelfunktion är den viktigaste ändpunkten i dessa prövningar, har stor vikt lagts vid att upprätta tillförlitlig, reproducerbar, och lätt att utföra funktionstester till pre kliniskt utvärdera muskelfunktion, styrka, kondition och koordination i mdx musmodell för DMD. Både invasiva och icke-invasiva tester finns tillgängliga. Tester som inte förvärrar sjukdomen kan användas för att bestämma den naturliga historia av sjukdomen och effekterna av terapeutiska ingrepp (t ex. Forelimb greppstyrka tester, två olika hängande tester med hjälp av antingen en tråd eller ett rutnät och rotarod igång). Alternativt kan tvingas löpband rinnande användas för att förbättra sjukdomsförloppet och / eller bedömaskyddande effekter av terapeutiska ingrepp på sjukdomspatologi. Vi här beskriver hur du utför dessa vanligaste funktionstester på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt. Med hjälp av dessa protokoll som bygger på standardrutiner möjliggör jämförelser av data mellan olika laboratorier.
Introduction
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är den vanligaste neuromuskulär sjukdom som påverkar 1:5000 nyfödda pojkar. Denna allvarliga och progressiva muskelförtvining sjukdom orsakas av mutationer i DMD-genen som stör den öppna läsramen och förhindra syntes av funktionella dystrofin protein. Muskelfibrer saknar dystrofin är sårbara för ansträngningsutlöst skada. Vid konsumtion av muskelns förnyelseförmåga, och på grund av kronisk inflammation i skadade muskler är fibrer ersätts av bindväv och fett, därefter leder till en förlust av funktion. Generellt DMD patienter förlorar förflyttningar i de nedre extremiteterna tidigt i det andra decenniet. Senare också musklerna i armar och skuldergördel är drabbade och patienter utvecklar ofta thoracolumbar skolios grund av asymmetrisk försvagning av musklerna som stöder ryggmärgen. Assisterad ventilation krävs i allmänhet i de sena tonåren eller i tjugoårsåldern. Andningsvägar och hjärtsvikt blytill döds i den tredje eller fjärde decennium 1.
Även den orsakande genen har upptäckts över 25 år sedan 2, finns det inget botemedel för DMD. Men förbättrad hälsovård och användning av kortikosteroider har ökade livslängden i västvärlden 3. Med hjälp av djurmodeller som MDX musen, stora steg framåt i upptäckten av potentiella terapeutiska strategier har gjorts. MDX-musen är den mest använda DMD musmodell. Den har en punktmutation i exon 23 av den murina DMD-gen och följaktligen saknar dystrofin 4. Under de senaste åren har många föreslagit strategier gått in i kliniska prövningar 5-9. I dessa studier är förbättrad muskelfunktion det primära effektmåttet, som ligger bakom det är viktigt att testa nyttan av föreningar på muskelfunktion hos möss under pre kliniska stadiet av tester.
Liksom DMDpatienter, även de dystrophin negativa muskelfibrer av MDX-möss är känsliga för utöva inducerad skador och deras muskelfunktionen är nedsatt jämfört med C57BL/10ScSnJ vildtyp möss. Denna nedskrivning kan bedömas med olika funktionstester. En del av dessa tester är icke-invasiv och inte stör muskelpatologi (t.ex. frambensgreppstyrka, hängande tester och rotarod igång). Därför kan de användas för att övervaka naturhistoria av sjukdomen eller bestämma effekterna av föreningar på sjukdomsutveckling. För att få en ingående bild av påverkan av föreningar på muskelfunktion i mdx-möss, kan ett funktionellt test regim som inte interfererar med sjukdomsutveckling som består av alla dessa tester användas 10.
Alternativt kan tvingas löpband igång användas för att avsiktligt förvärra sjukdomsförloppet och testa de skyddande kapacitet föreningar 11. Den löpband kan också varaanvänds som effektmått där gångtid tills utmattning mäts 12, eller som ett verktyg för utmattnings MDX möss så att de presterar sämre i en efterföljande funktionstest säkerställer större skillnader i prestanda mellan behandlingsgrupperna 13. När du väljer funktionstester, ska deras effekt på sjukdomsförloppet hållas i minnet, särskilt när man testar dystrofa möss gillar mdxmus 14.
Vi här i detalj beskriva hur du utför de vanligaste funktionstester på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt baserat på tillgängliga standardrutiner från TREAT-NMD nätverk. Klicka här för att besöka TREAT-NMD .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten beskrivs här godkändes av Animal etikkommitté (DEC) i Leiden University Medical Center (LUMC). Möss uppfödd av djuranläggningen i LUMC och förvaras i individuellt ventilerade burar med 12 timmar ljus mörka cykler. De fick ad libitum tillgång till vatten och standardiserad chow.
När du utför någon av de funktionstester som beskrivs nedan, experimentella förhållanden måste noga kontrolleras för att minska variationen. Företrädesvis bör ålder och kön matchade möss användas, såsom prestanda skiljer mellan ålder och kön. Möss som tillhör samma kull bör randomiseras över experimentgrupperna. Djuren ska testas av samma operatör, som är blind för de experimentella grupper. Tester ska utföras på samma tid på dygnet och veckodag, samma rum för att utjämna lukter, ljud, etc. 14 Stor variation mellan enskilda möss och tidpunkter kan observeras för allafunktionstester, alltså 6-8 möss / experimentell grupp bör användas. Funktionstest prestanda kan också i hög grad skiljer sig åt mellan olika inavlade stammar vild typ. Därför bör experiment-och kontroll vildtypsmöss alltid har motsvarande bakgrunder (vid mdx möss använda C57BL/10ScSnJ vildtyp-stam). Alla data som beskrivs här har erhållits med den C57BL/10ScSnJ vildtypstammen, som vi hänvisar till såsom vildtyp här på. De provningar som beskrivs här kan användas i längdriktningen från minst 1-19 månaders ålder i MDX och vildtyp möss. Tester bör inte upprepas mer än en gång i veckan för att hindra möss från att förlora intresse och vilja att utföra uppgiften.
1. Forelimb Grip Strength Test
Använd forelimb greppstyrka test för att mäta styrkan i frambenen. Testet är baserat på en tendens av en mus för att instinktivt förstå ett rutnät när upphängd i svansen 15, och ADAPTEd. från DMD_M2.2.001.pdf .
- Apparat inställd: Fäst ett rutnät till en kraftgivare, som mäter den maximala kraft som musen på nätet under pull. Se till att inställningen är på topp spänningsläge (T-PK) för att dra. Enheterna i kraft kan justeras antingen i uns-i-kraft, gram-för-kraft, pounds-i-kraft, kg-i-kraft, eller Newton.
OBS: Vi föredrar att arbeta med gram som enhet av värden. Flera meter är kommersiellt tillgängliga, men bara axiella givare ger tillförlitliga resultat som spak typ kraftgivare är negativt påverkade av de fysiska lagarna i hävstångseffekten. Antingen en nonflexible rutnät eller triangel kan användas med staplar som är 1-2 mm i diameter. - Före testet, bedöma kroppsvikt hos mus, för att möjliggöra normalisering för kroppsvikt.
- Använd gram som enhet av värden. Återställ mätaren vid starten av varje recording.
- Ta bort musen från sin bur genom att ta tag i svansen och flytta den horisontellt mot gallret.
- Kontrollera att musen griper gallret ordentligt med båda framtassarna.
- Dra musen från gallret, så att dess grepp är trasig, den högsta kraft som anbringas till nätet kommer att visas på givarens skärm, som kan vara antingen manuellt eller automatiskt registreras.
- Ta bara drar i beaktande där musen visar motstånd till försöksledaren. Avvisa åtgärder, i vilka endast en framtassarna eller bakbenen användes och i vilka mus svarvade under draget.
- Låt musen dra gallret tre gånger i rad och sedan lämna tillbaka den i buren för en viloperiod på minst en minut Anm. Mellan serie drar en viloperiod är nödvändig för musen för att återhämta sig och undvika vana bildning.
- Låt sedan musen utföra fyra serier av drag, var och följs av en kort viloperiod. På detta sätt kan mouse har dragit totalt 15x (3 drar x 5 ggr = 15 Pulls).
- Bestäm maximal greppstyrka och normalisera för kroppsvikt genom att ta genomsnittet av de tre högsta värdena av de 15 värden som samlats in.
- Valfritt: Bestäm trötthet genom att beräkna dekrement mellan genomsnittet av de två första och de två sista serie dragningar 1 2 3 = A, 4 5 6 = B, 10 11 12 = C och 13 14 + 15 = D. Formeln: (C + D) / (A + B) ger ett värde på 1 för möss som inte är trött. Detta kan uttryckas i procent, så att en mus utan trötthet har ett värde av 0% och en mus som framben är fullständigt utmattad har ett värde av 100%.
2. Hängande Tester
Med hängande tester, balans, koordination och muskeltillstånd kan bedömas. Dessa tester bygger på kunskapen om att möss är ivriga att förbli hängande på en tråd eller galler till utmattning 16. Det finns två distinkta hängande test i vilken vid starten av testet antingenendast de två frambenen eller alla fyra benen används, med hjälp av en tråd eller rutnät respektive. Den hängande test med tråden och gallret är den längsta hängtiden metod anpassas från DMD_M.2.1.004.pdf och DMD_M.2.1.005.pdf respektive. En fast hängande gräns används av 600 sek. Majoriteten av vildtyp möss kan hänga på 600 sek, medan dystrofa möss inte kan. För att minska tid spenderar utför detta test var en maximal hängande tid satt på plats. Möss som faller utanför tråden eller rutnät dessförinnan ges upp till ytterligare två försök. Detta görs för att återförsäkra att möss är verkligen inte kan hänga och faller inte på grund av klumpighet.
- Hängande test med två delar
- Apparat inställd: Tätt säkra en 2 mm tjock metall tyg hängare till en hylla med tejp och underhålla galgen runt 370; cm ovanför ett lager av strö. Obs: Alternativt kan en 55 cm bred 2 mm tjock metallisk tråd som är tätt säkrade mellan två vertikala stativ användas. Avståndet av 37 cm är tillräckligt för att uppmuntra möss förblir hängande, utan även tillräckligt låg för att förhindra möss från skador när falla ner. Tråden bör inte vibrera eller förskjuta under testet, eftersom detta kan störa funktionen av musen.
- Hantera musen via svansen och föra den nära tråden.
- Låt musen gripa kabeln med de två enda tassarna och sänka bakben på ett sådant sätt att musen hänger endast med de två framtassar på viran (Figur 2B).
- Direkt starta timern när musknappen släpps. Efter frisläppandet, starka möss försöka fånga tråden med alla fyra benen och svansen, som är tillåtet (figur 2C).
- När en mus visar olämpligt beteende (som att balansera på eller medvetet hoppa av tråden som shäger i figurerna 2D och 2E), direkt ta itu med detta genom att ersätta musen på kabeln utan att stoppa timern.
- När en mus faller av tråden, stoppa timern och registrera hängande tid.
- När möss har möjlighet att hänga på 600 sek, ta bort dem från tråden och återlämna dem till buren. Möss som faller innan denna gräns får maximalt ytterligare två försök.
- Notera den maximala hängande tid (dvs. den längsta av försöken) och använda detta för vidare analys.
- Hängande test med fyra armar och ben
- Apparat inställd: Använd antingen en handgjord offentlig locket på en stor bur för en råtta eller kanin för detta test. Placera gallret 25 cm ovanför mjuka sängar att hindra möss från att skada sig på att falla, men också för att avskräcka möss att avsikt hoppa av rutnätet. Tätt säkra rutnätet så att försöksledaren inte behöver manuellt hålla nätet under experimentet som dessa rörelser kanske jagnterfere med musen prestanda.
- Placera musen på nätet så att den griper den med sina fyra tassar.
- Vänd gallret så att musen hänger och direkt starta timern.
- Testet sessionen avslutas för möss som har möjlighet att hänga under en varaktighet av 600 sek. Ge möss som faller utanför nätet tidigare maximalt ytterligare två försök.
- Använd den maximala hängande tid (dvs. Den längsta av försöken) för vidare analys.
3. Rotarod Running
Med rotarodtestet muskelstyrka, kan koordination, balans och kondition bestämmas 17.
- Apparat inställd: För detta test, möss måste köra på en roterande rör. Se till att jämn hastighet är satt till 5 varv per minut (rpm), och att hastigheten ökar från 5 till 45 varv per minut i den första 15 sekunder vid start. Efter detta har för att upprätthålla dess hastighet.
- Placera möss på röret av rotarodnär den roterar i en långsam jämn hastighet av 5 rpm. Fem möss kan testas samtidigt.
- Starta körningen när alla möss är placerade. Inom de första 15 sek hastigheten på röret accelererar 5-45 rpm varefter den håller den hastigheten.
- Övervaka körningen. Gångtiden registreras kontinuerligt av programvaran. Gångtid stoppas automatiskt när en mus faller av röret eftersom detta aktiverar tidsfältet placeras under röret. Flytta möss som vänder runt vänd i motsatt riktning på röret medan du kör utan att stanna röret att rotera.
- Avsluta testsessionen för möss som har möjlighet att köra för en löptid på 500 sek. Ge möss maximalt ytterligare två försök så att de kan förbättra sin gångtid, när de faller tidigare.
- Använd den maximala gångtid (dvs. den längsta av försöken) för vidare analys.
4. Löpband Motion
DenLöpbandet kan användas på tre olika sätt som ett verktyg i pre klinisk forskning. För det första kan tvingas löpband rinnande användas för att förvärra sjukdomspatologin som beskrivs i detta protokoll (se även: DMD_M2.1.001.pdf ). För det andra kan den maximala driftsförmåga för möss och effekterna av behandlingarna på detta bedömas (se för metoden att låta mössen springa tills utmattning DMD_M.2.1.003.pdf ). Slutligen kan löpband rinnande användas före en annan funktionstest för att uttömma musen så att den presterar sämre i det andra testet 13. Detta görs genom att utöva möss två eller tre gånger i veckan enligt nedan, direkt följt av en av de funktionstester som beskrivs i protokoll 1-3.
- Apparat inställd: Det finns flera löpband kommersiellt tillgängliga på vilken flera möss kan run samtidigt och för vilken höjd, längd och hastighet kan justeras. Vissa löpband är försedda med ett galler för att leverera lågintensiv chocker att uppmuntra möss att köra. Men MDX möss är känsliga för stress och kan enkelt motiveras på ett vänligare sätt genom ett lätt tryck med handen i körriktningen. Därför är det starkt att INTE använda chock rutnät. Generellt behövs endast stimulering med handen under den första kör session.
- Placera möss på den horisontella löpband.
- Börja löpbandet vid en körhastighet av 12 m / min. Lägre hastigheter (8 m / min) måste användas i gamla möss (> 15 månader), där högre hastigheter lätt leda till utmattning.
- Under den första sessionen, uppmuntra möss att köra genom att försiktigt trycka dem när de är nära slutet av bältet.
- När mössen har kört för en period av 30 minuter, lägg tillbaka dem i deras bur.
- Upprepa detta två gånger i veckan för exempelvis 12 veckor. Låt vila perioder när det behövs. Till exempel, vissa MDX möss måste sluta köra och bör tillåtas att vila i några minuter. Om detta händer, slå av remmen, ge alla möss en viloperiod på två minuter, slå på bältet på under två minuter vid 4 m / min. Efter detta, öka hastigheten till 12 m / min och tillåter mössen för att slutföra protokollet. Det är viktigt att alla möss slutföra hela kör-protokollet.
OBS: Om MDX möss behöver viloperioder, överväga en uppvärmning innan den 30 min övningsprotokoll. Detta värmer upp Sessionen består av: a 2 min acklimatiseringsperiod med en hastighet av 4 m / minut, omedelbart följt av en 8 min uppvärmning vid 8 m / min.
I våra händer 4-16 veckor gamla kvinnliga MDX-möss har möjlighet att slutföra 30 min övningsprotokoll utan att vila. Andra har rapporterat att i åldersmatchade manliga mdx möss 45% av mössen behöver viloperioder för att avsluta övningen. Uppvärmnings protokollet minskars mängden stoppen 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forelimb greppstyrka av vildtyp och MDX-möss ökar i åldern 4-12 veckor och minskar igen i äldre möss. Nedskrivningar gällande kan redan iakttas i unga MDX möss. Representativa data för 9 veckor gamla möss av honkön visas i figurerna 1A och 1 B. Även trötthet inte skiljer mellan stammarna men i den här åldern, MDX-möss är svagare än vildtyp möss. Vi har inga uppgifter ännu om fatigability i äldre MDX och vildtyp möss.
För att få tillförlitliga och reproducerbara resultat, flera utvärderingar måste göras av samma försöksledaren. Vi här beskriver att dra 15 ggr / individ, dock mindre antal drag (så lite som 5 drag) också ge tillförlitliga uppgifter. Noggrann uppmärksamhet bör fästas vid placeringen av tassar på nätet eftersom detta kan till stor del påverka resultaten. Under pull, bör endast de båda framtassarna användas och de måste be placerad snyggt bredvid varandra (Figur 1C). När musen inte uppvisar resistens mot drag bör värdet inte beaktas.
För de två lem och fyra lem hängande tester, speciellt unga (4-16 veckor gamla) vildtypsmöss kan lätt nå den maximala hängande tid av 600 sekunder. I motsats, är resultatet för unga MDX möss nedsatt (de nästan aldrig uppnå maximal hängande tid) och dessutom försämras med åldern, även om båda stammarna lägga all kraft på att utföra dessa hänger tester på sina bästa förmågor (figur 2A och 3A). Större skillnader i hängande gånger mellan MDX och vild typ möss erhålls med tråd. Därför kan till och med små effektstorlekar av föreningar på muskelfunktion detekteras med användning av detta test. Hängande prestanda (eller någon annan typ av prestanda) skiljer sig inom och mellan individer över tiden resulterar i hög standardavvikelse barer. Nonetheless, mdx möss konsekvent presterar sämre än åldersmatchade möss av vildtyp (Figur 2A). Utföra flera bedömningar kan ge mer detaljerad inblick i funktionella förbättringar på behandling än enbart endpoint mätningar. Man bör komma ihåg att i den första sessionen djuren lära sig att utföra ett funktionstest. Denna inlärningskurva, som är närvarande i alla tester, syns tydligt mellan 4-6 veckors ålder. Men eftersom möss växer också snabbt i den här åldersperiod, en distinktion mellan förbättring på grund av inlärning och / eller tillväxt kan inte göras. Könsskillnader i hängande prestanda för de två extremiteterna hang testet har också påträffats. Utförande av kvinnliga mdx möss överstiger män med ~ 100 sek, och prestanda för löpband utmanade kvinnliga mdx möss är nästan jämförbar med den obestridda hanar (jämför figur 2A med 4A). Detta fynd understryker vikten av att använda ålder ennd kön matchade möss för att undvika partiskhet. Vi har preliminära data tyder på att skillnaderna i prestanda i både hängande tester mellan MDX och vildtyp möss ökar i mycket gamla (18 månader) möss.
Vissa möss visar olämpligt beteende för att undvika hängande på tråd ut, balansera på tråden, hoppa av tråden medvetet etc. (figur 2D och 2E), även om majoriteten av möss uppfyller testet och häng med antingen två eller fyra delar ( Figurerna 2B och 2C). Ibland starka möss hoppa av tråden avsiktligt. De hänger innan hoppa med endast de två bakben och svans på tråden och titta ner för att uppskatta avståndet till marken. Olämpligt beteende som ibland ses på nätet under fyra lem hängande Provet består av medvetet hoppa av gallret eller klättra på gallret. Alla olämpliga beteenden kan vara easily stående och bör inte tillåtas. Möss som undviker att hänga på ett av dessa sätt bör vara direkt placeras tillbaka på tråden eller rutnät utan att stoppa timern.
På rotarod, MDX-möss nästan aldrig köra för den maximala gångtid 500 sek, medan en större andel av vildtypsmöss göra (Figur 3B). Med åldern, driftsprestanda av båda stammarna minskar. Vissa möss har möjlighet att spänna fast tätt mot den roterande röret och undvika att köra med "cartwheeling" runt. Detta kan inte rättas till, och är en allvarlig begränsning av testet när flera möss börja göra detta under längre perioder, vilket ökar variationen inom de experimentella grupper. Särskilt för vissa möss som delvis drivs dels Kärrhjulsluster, och under övergången från cartwheeling till att köra höst. Vissa möss vända på det roterande röret medan du kör. Detta beteende bör åtgärdas genom direkt flytta mössen på tuben, medut att stoppa det. Även denna typ av beteende begränsar användbarheten av detta test.
Forcerad löpband kör är en enkel och effektiv övning för att förvärra sjukdomspatologi i obehandlade MDX möss, medan vildtyp möss som genomgår samma protokoll inte påverkas. Generellt möss blir förtrogen med löpbandet efter en inledande träningspass och är villiga att köra, speciellt när flera möss körs samtidigt. Gamla MDX-möss (över 15 månader) har svårt att springa och inte kan klara av samma löphastighet på 12 m / min i 30 minuter som används för unga möss. Därför är en lägre körhastighet på 8 m / min i 30 min rekommenderas så att alla möss för att avsluta hela protokollet. Mdx möss är särskilt sårbara för excentriska sammandragningar, alltså downhill kör kan endast användas för en kort tid.
Alternativt kan andra funktionella tester som de två lem hängande tråd test kan utföras direkt efter att ha kört (Figur 4A). Med hjälp av denna studiedesign, skillnader mellan stammar eller behandlingsarmarna kommer sannolikt att öka som löpband utmanade obehandlade MDX-möss är mindre kapabla att utföra dessa tester än stillasittande mdx möss 13.
Som nämnts tidigare, när man studerar muskelfunktion i mdx-möss, behöver C57BL/10ScSnJ vildtypstammen som skall användas, som är av motsvarande genetisk bakgrund. Vi rekommenderar detta som även mellan inavlade vilda stammar löpband kör prestanda skiljer 18,19. Men även i icke-invasiv funktionella tester, är funktionella prestanda påverkas av genetisk bakgrund. Figur 5 illustrerar detta i tre representativa grafer där prestanda för MDX-möss på en BL/10 bakgrund och på en blandad bakgrund som består av BL/10, BL/6J, DBA2 och 129OLA jämförs. Som förstås de blandade bakgrunds mössprestera bättre i de hängande trådtester och värre på rotarod.
Figur 1. Frambensgreppstyrka, representativa resultat och korrekt placering av tassarna. A. Forelimb greppstyrka normaliserad för kroppsvikt på 9 veckor gammal tik mdx (n = 5) och vildtyp (n = 4) möss. Greppstyrka redan är försvagad hos unga mdx-möss. Asterisker indikerar p <0,05 och data presenteras som medelvärde ± St.Dev. B. Trötthet av samma personer som visas i A, var i genomsnitt mindre än 10% och varierade inte mellan stammar. C. För att få tillförlitliga uppgifter, uppmärksamhet bör ägnas åt placering av tassarna under forelimb greppstyrka analys. Korrekt placering av musen, två framtassar är bredvid varandra, bakben are inte vidröra nätet och musen drar i en rak linje D. Felaktig placering av framtassarna,. musen inte drar i en rak linje. När detta händer, eller när bara en framtassarna eller även bakben används, vänder runt musen under dra eller saknar att visa motstånd, uppgifter ska kasseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Två lem hängande tester, representativa resultat och lämpligt och olämpligt hängande beteende. A. Ett representativt exempel på de två lem hängande testet utförs en gång i veckan i manliga mdx (n = 18, 4-10 veckor, n = 13, 11 och 12 veckor, n = 10, 13 veckor) och ålder och kön matchade möss av vildtyp (n = 6). En inlärningskurva är synlig för båda stammarna i de första veckorna av att testa. Utförande av mdx-möss var sämre jämfört med den hos möss av vildtyp. Data presenteras som medelvärde ± St.Dev. Maximal hängande tidsfristen indikeras av den streckade linjen. B. Den korrekta startposition med detta test är med de två framtassar. C. Beroende på funktionsförmåga hos mus kan också använda bakben och svans. D och E. En liten delmängd av möss, speciellt starka vild typ möss, kan ibland undvika hängande genom att klättra på sidostänger eller balansera på tråden. Vissa möss hoppar avsiktligt bort tråden. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
files/ftp_upload/51303/51303fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Fyra lem hängande och rotarod körprov. A. Fyra lem hängande prestanda utvärderas en gång per vecka i manliga mdx (n = 18, 4-10 veckor, n = 13, 11 och 12 veckor, n = 8, 13 veckor) och vildtyp ( n = 6) möss. Med tiden MDX möss hänger mindre lång än vildtyp möss. B. Rotarod kör gånger inte skiljer sig mellan unga manliga mdx (n = 18, 4-10 veckor, n = 13, 11 och 12 veckor, n = 10, 13 veckor ) och möss av vildtyp (n = 6). Data representeras som medelvärde ± St.Dev.
Figur 4. Effekten av tvångs löpband kör övningsprotokoll på funktionella prestanda och skelettmuskler patologi i honmöss. Muskel patologi var medvetetförvärras genom att låta möss köra på en horisontell löpband tre gånger i veckan på 12 m / min i 30 min för en period av 12 veckor. Direkt efter att ha kört, möss hade att delta i de två lem hängande test. Även om alla möss av vildtyp (n = 5) förblir hängande tills den maximalt tillåtna, alla mdx-möss (n = 6) faller av tråden tidigare (p <0,001, data som presenteras som medelvärde ± St.Dev.). B. Närvaron av membranskada bestämdes genom att utvärdera plasma kreatinkinas (CK)-nivåer som läcker ut ur muskelfibrer genom tårar i membranet. CK var förhöjda i MDX-möss jämfört med vildtyp möss före träning. Löpband träning omedelbart ökade nivåer (p <0,01 indikeras av asterisk, data som presenteras som medelvärde ± St.Dev.) I MDX-möss, medan de fortsatt låg i vildtyp möss. CD. Musklerna MDX möss är mycket sårbara för löpband motion, försämring sjukdomspatologi utsträckning enfter ett par veckor med att köra. Dessa hematoxylin och eosin färgningar av quadriceps av en 16 vecka gamla nonexercised (C) och löpband utövas (D) mdxmus visar att omfattande fibros och nekros utvecklas. Är E. Muskler av möss av vildtyp genomgår samma rinnande protokollet inte påverkas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Effekt av en blandad bakgrund på funktionella prestanda i MDX-möss. Skillnader i genetisk bakgrund påverkar funktionella prestanda. För att illustrera detta, utförande av manliga mdx (BL/10 bakgrund, n = 18, 4-10 veckor, n = 13, 11 och 12 weeks, n = 10, 13 veckor) och mdx (blandad BL/10, BL/6J, DBA2 och 129OLA bakgrund, n = 5) möss jämfördes med tiden. A. Två lem hängande testa prestanda väsentligt skilde sig mellan de två stammarna. B. Fyra lem hängande testresultat var något högre i de blandade bakgrunds MDX möss. C. Rotarod gångtider också något skilde mellan stammarna. Data presenteras som medelvärde ± St.Dev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De funktionstester som presenteras här är reproducerbar, enkel att utföra och som gäller för vildtyp och dystrofa möss oberoende av deras ålder. Testerna ger användbara verktyg för att pre kliniskt utvärdera muskelfunktion, styrka, kondition och koordination. Vid testning av effekterna av en förening på naturhistoria av sjukdomen, de icke-invasiva tester som beskrivs här (frambensgreppstyrka, både hängande tester och rotarodtestet) kan fint kombineras i ett funktionstest regim där dessa tester utförs på varandra följande dagar . Dessa protokoll är inte skadlig för mdx möss och kan användas i en längsgående sätt 10. Det bör hållas i minnet att resultaten av var och en av dessa tester som genereras av olika eller delvis överlappande muskelgrupper i stället för en enskild muskel. Därför, med hjälp av en kombination av flera tester rekommenderas för att få en mer fullständig bild och därmed bättre insikt i funktionaliteten i erfarenhetmentala grupper. Alternativt kan funktionella förbättringar av en enda muskel bedömas med hjälp av muskelfysiologi mått 20.
Liksom beteendetester, även funktionella tester kan visa stora variationer mellan olika möss, eller inom en mus mellan olika bedömningar. För att minska variationen bör alla tester utföras av samma försöksledaren, som är bekant med mössen. Externa variabler som dofter och ljud i rummet, bör tid på dygnet och veckodag som testet utförs hållas så konstant som möjligt. Möss ska vara köns-och åldersmatchade. Vid användning av löpband kör att förvärra sjukdomsförloppet, är det viktigt att använda ett standardiserat protokoll där alla aktiva parametrar (gångtid, hastighet och lutning) hålls konstanta över tiden för alla experimentella grupper, så att alla möss är lika behandlas. Även om majoriteten av möss är angelägna om att delta i de funktionella testerna och de flesta djur visar högnivåer av beredskap, vissa möss (främst stark vildtyp möss) och då undvika att utföra testet och visa undvikande beteende. När detta inte korrigeras för, kan felaktiga slutsatser dras 21. Lyckligtvis är dessa typer av beteenden endast observerats då och då och kan korrigeras för genom att placera musen tillbaka på tråd, galler eller rotarod, eller dra en annan tid på greppstyrka mätaren.
Förbättringar i en funktionstest (t.ex. hängande testet bedöma muskelfunktion) inte nödvändigtvis måste samarbeta inträffa med förbättringar i ett annat test (frambensgreppstyrka bedömer enda muskelstyrka). I MDX-möss, kan förbättringar i muskelfunktion urskiljas tidigare än i muskelstyrka. Detta syns också i DMD patienter som deltar i kliniska studier där kliniskt betydelsefulla förbättringar i 6 min gångtest inte cooccur med förbättringar i muskelstyrka 6,7. Dock kan dettadelvis beroende på den arbetande mekanismen av den testade föreningen och det är möjligt att andra föreningar förbättra styrka och inte fungera. Därför bör resultaten av de tester som tolkas med verkningsmekanismen för föreningen i åtanke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Margriet Hulsker för hennes fotografiska stöd och hjälp för att skapa bilder av möss och granskarna för deras mycket konstruktiva kommentarer. Detta arbete stöddes av ZonMW, TREAT-NMD (kontraktsnummer LSHM-CT-2006 till 036.825) och Duchennes Parent Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
| Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
| Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
| Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
| Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |
References
- Blake, D. J., Weir, A., Newey, S. E., Davies, K. E. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9, 77-93 Forthcoming.
- Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., Moore, K. J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81, 1189-1192 (1984).
- Bowles, D. E., et al. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Mol. Ther. 20, 443-455 (2012).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 Forthcoming.
- Goemans, N. M., et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 364, 1513-1522 (2011).
- Malik, V., et al. Gentamicin-induced readthrough of stop codons in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 67, 771-780 (2010).
- Skuk, D., et al. First test of a "high-density injection" protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscul. Disord. 17, 38-46 (2007).
- van Putten, M., et al. A 3 months mild functional test regime does not affect disease parameters in young mdx mice. Neuromuscul. Disord. 20, 273-280 (2010).
- De Luca, A., et al. Gentamicin treatment in exercised mdx mice: Identification of dystrophin-sensitive pathways and evaluation of efficacy in work-loaded dystrophic muscle. Neurobiol. Dis. 32, 243-253 (2008).
- Radley-Crabb, H., et al. A single 30min treadmill exercise session is suitable for 'proof-of concept studies' in adult mdx mice: A comparison of the early consequences of two different treadmill protocols. Neuromuscul. Disord. , (2011).
- van Putten, M., et al. The effects of low levels of dystrophin on mouse muscle function and pathology. PLoS.One. , (2012).
- Willmann, R., et al. Enhancing translation: Guidelines for standard pre-clinical experiments in mdx mice. Neuromuscul. Disord. 1, 43-49 (2011).
- Connolly, A. M., Keeling, R. M., Mehta, S., Pestronk, A., Sanes, J. R. Three mouse models of muscular dystrophy: the natural history of strength and fatigue in dystrophin-, dystrophin/utrophin-, and laminin alpha2-deficient mice. Neuromuscul. Disord. 11, 703-712 (2001).
- Rafael, J. A., Nitta, Y., Peters, J., Davies, K. E. Testing of SHIRPA, a mouse phenotypic assessment protocol on Dmd(mdx) and Dmd(mdx3cv) dystrophin-deficient mice. Mamm. Genome. 11, 725-728 (2000).
- Chapillon, P., Lalonde, R., Jones, N., Caston, J. Early development of synchronized walking on the rotorod in rats. Effects of training and handling. Behav. Brain Res. 93, 77-81 (1998).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Lerman, I., et al. Genetic variability in forced and voluntary endurance exercise performance in seven inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 92, 2245-2255 (2002).
- Sharp, P. S., Jee, H., Wells, D. J. Physiological characterization of muscle strength with variable levels of dystrophin restoration in mdx mice following local antisense therapy. Mol. Ther. 19, 165-171 (2011).
- Klein, S. M., et al. Noninvasive in vivo assessment of muscle impairment in the mdx mouse model--a comparison of two common wire hanging methods with two different results. J. Neurosci. Methods. 203, 292-297 (2012).
