Summary
L'outcome primario negli studi clinici per le malattie neuromuscolari è generalmente migliorata la funzione muscolare. Pertanto, valutando l'effetto di potenziali composti terapeutici sulla performance muscolare pre clinicamente in modelli murini è di grande importanza. Siamo qui descriviamo diversi test funzionali per affrontare questo.
Abstract
Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è un muscolo grave e progressivo deperimento disturbo per il quale nessuna cura disponibile. Tuttavia, diversi potenziali composti farmaceutici e approcci di terapia genica hanno progredito nei test clinici. Con il miglioramento della funzione muscolare è il punto finale più importante in questi studi, molta enfasi è stata posta sulla creazione di affidabile, riproducibile, e facile da eseguire test funzionali di controllare la validità clinicamente valutare la funzione muscolare, la forza, la condizione e il coordinamento nel mdx modello murino di DMD. Entrambi i test invasivi e non invasivi sono disponibili. I test che non esacerbare la malattia possono essere utilizzati per determinare la storia naturale della malattia e gli effetti degli interventi terapeutici (ad es. Prova la forza di presa degli arti anteriori, due differenti prove sospese utilizzando sia un filo o una griglia e rotarod esecuzione). In alternativa, costretto treadmill in esecuzione può essere utilizzato per migliorare la progressione della malattia e / o valutareeffetti protettivi di interventi terapeutici sulla patologia della malattia. Siamo qui descritto come eseguire questi test funzionali più comunemente utilizzati in modo affidabile e riproducibile. L'utilizzo di questi protocolli basati su procedure operative standard permette il confronto dei dati tra diversi laboratori.
Introduction
Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è il disturbo neuromuscolare più comune che colpisce 1/5.000 neonati maschi. Questa malattia atrofia muscolare grave e progressiva è causata da mutazioni nel gene DMD che interrompono la fase di lettura aperta e impediscono la sintesi della proteina distrofina funzionale. Le fibre muscolari prive di distrofina sono vulnerabili ad esercitare danno indotto. Una volta esaurito capacità rigenerativa del muscolo, e causa di infiammazione cronica del muscolo danneggiato, fibre vengono sostituite da tessuto connettivo e grasso, successivamente, portando ad una perdita di funzione. Generalmente, i pazienti DMD perdono deambulazione degli arti inferiori all'inizio del secondo decennio. Più tardi, anche i muscoli delle braccia e del cingolo scapolare sono colpiti e pazienti spesso sviluppano scoliosi toraco-lombare a causa di indebolimento asimmetrica dei muscoli che sostengono la colonna vertebrale. Ventilazione assistita è generalmente richiesto nella tarda adolescenza o vent'anni. Respiratorie e insufficienza cardiaca piomboa morte nella terza o quarta decade 1.
Sebbene il gene-malattia è stato scoperto oltre 25 anni fa 2, non esiste una cura disponibile per la DMD. Tuttavia, una migliore assistenza sanitaria e l'uso di corticosteroidi hanno aumentato l'aspettativa di vita nel mondo occidentale 3. Con l'uso di modelli animali come il topo mdx, importanti passi avanti nella scoperta di potenziali strategie terapeutiche sono state fatte. Il topo mdx è il modello di topo DMD più comunemente usato. Esso ha una mutazione puntiforme nell'esone 23 della DMD gene murino e di conseguenza manca distrofina 4. Negli ultimi due anni, molte strategie proposte sono progredite in studi clinici 5-9. In questi studi, il miglioramento della funzione muscolare è l'endpoint primario, sottolineando l'importanza di testare i benefici dei composti sulla funzione muscolare nei topi durante la fase clinica preliminare di test.
Come DMDpazienti, anche le fibre muscolari negative distrofina di topi mdx sono vulnerabili ad esercitare danni indotti e la loro funzione muscolare è compromessa rispetto a C57BL/10ScSnJ wild type topi. Questo deterioramento può essere valutata con una serie di test funzionali. Alcuni di questi test sono invasivi e non interferiscono con la patologia muscolare (ad es forelimb forza di presa, prove appesi e rotarod esecuzione). Pertanto possono essere utilizzati per monitorare la storia naturale della malattia o determinare gli effetti dei composti sulla progressione della malattia. Per ottenere una immagine in profondità l'influenza dei composti sulla funzione muscolare nel topo mdx, un regime test funzionale che non interferisce con la progressione della malattia consiste in tutti questi test può essere utilizzato 10.
In alternativa, costretto treadmill in esecuzione può essere usato per esacerbare intenzionalmente la progressione della malattia e testare le capacità protettive di composti 11. Il tapis roulant può anche essereutilizzato come misura di esito in cui tempo di funzionamento fino ad esaurimento viene misurata 12, o come strumento per fatica topi mdx modo che essi svolgono meno bene in un test funzionale successiva garantire grandi differenze di prestazioni tra i gruppi di trattamento 13. Quando si sceglie test funzionali, il loro effetto sulla progressione della malattia deve essere tenuto presente soprattutto quando il test topi distrofici come il topo mdx 14.
Siamo qui descriviamo in dettaglio come eseguire i test funzionali più comunemente utilizzati in modo affidabile e riproducibile sulla base disponibili procedure operative standard della rete TREAT-NMD. Clicca qui per visitare TREAT-NMD .
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Protocol
Gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dal comitato etico degli animali (DEC) del Leiden University Medical Center (LUMC). I topi sono stati allevati dalla struttura animale della LUMC e tenuti in gabbie a ventilazione individuale con 12 cicli Dark Light hr. Avevano ad libitum accesso ad acqua e cibo standard.
Quando si esegue uno dei test funzionali di seguito descritte, le condizioni sperimentali devono essere rigorosamente controllato per ridurre le variazioni. Preferibilmente, età e sesso topi corrispondenti devono essere utilizzati, come le prestazioni differisce tra età e generi. I topi che appartengono alla stessa cucciolata dovrebbero essere randomizzati sui gruppi sperimentali. Gli animali devono essere testati dallo stesso operatore, che è cieco ai gruppi sperimentali. Le prove devono essere eseguite alla stessa ora del giorno e della settimana, stessa stanza per pareggiare gli odori, rumori, ecc 14 grandi variazioni tra i singoli topi e punti di tempo può essere osservato per tuttiprove funzionali, quindi / dovrebbero essere usati gruppo sperimentale 6-8 topi. Risultati delle prove funzionali può anche variare ampiamente tra i diversi ceppi di tipo selvaggio inbred. Pertanto, topi wild type sperimentali e di controllo devono sempre sono corrispondenti sfondi (in caso di topi mdx utilizzare il C57BL/10ScSnJ ceppo selvatico). Tutti i dati qui descritti sono stati ottenuti con il C57BL/10ScSnJ ceppo selvatico, che ci riferiamo tipo selvatico da qui in avanti. I test qui descritti possono essere utilizzati longitudinalmente da almeno 1-19 mesi di età nei topi mdx tipo e selvatici. Le prove non devono essere ripetuti più di una volta alla settimana per evitare che i topi da perdere interesse e la disponibilità a eseguire l'operazione.
1. Forelimb Grip Forza di prova
Utilizzare il test forelimb forza di presa per misurare la forza delle arti anteriori. Il test si basa sulla tendenza di un mouse per afferrare istintivamente una griglia volta sospeso per la coda 15, e adapted da DMD_M2.2.001.pdf .
- Apparecchiatura costituita: Attaccare una griglia ad un trasduttore di forza, che misura la forza massima esercitata dal mouse sulla griglia durante la trazione. Verificare che l'impostazione sia in modalità tensione di picco (T-PK) per tirare. Le unità di forza possono essere regolate sia in once-di-forza, grammi-di-forza, chili-di-force, kg-di-forza, o Newton.
Nota: Noi preferiamo lavorare con grammi come unità di valori. Più contatori sono disponibili in commercio, ma solo trasduttori assiali danno risultati affidabili come tipo di leva trasduttori di forza sono influenzati negativamente dalle leggi fisiche dell'effetto leva. O una griglia nonflexible o triangolo possono essere utilizzati con bar che sono 1-2 mm di diametro. - Prima della prova, valutare il peso corporeo del topo, per consentire la normalizzazione per peso corporeo.
- Utilizzare grammi come unità di valori. Resettare il contatore all'inizio di ogni recording.
- Rimuovere il mouse dalla gabbia afferrando la coda e si muove orizzontalmente verso la griglia.
- Verificare che il mouse afferra la griglia saldamente con entrambe le zampe anteriori.
- Estrarre il mouse dall'immagine griglia in modo che la sua portata è rotto, la massima forza applicata alla griglia viene visualizzata sul display del trasduttore, che può essere manualmente o automaticamente registrato.
- Prendere tiri in considerazione solo in cui il mouse mostra resistenza allo sperimentatore. Respingere misure in cui una sola zampa, o quelle posteriori sono stati usati e in cui il mouse trasformato durante la trazione.
- Sia il mouse tirare la griglia tre volte di seguito e poi tornare nella gabbia per un periodo di riposo di almeno un minuto Nota:. Tra serie di tira un periodo di riposo è necessario per il mouse per recuperare ed evitare la formazione di abitudini.
- Poi lasciare il mouse eseguire quattro serie di tiri, ciascuno seguito da un breve periodo di riposo. In questo modo il mouse ha tirato un totale di 15x (3 tiri x 5 = 15 volte tira).
- Determinare la forza massima aderenza e per normalizzare il peso corporeo prendendo la media dei tre valori più alti dei 15 valori raccolti.
- Facoltativo: Determinare fatica calcolando il decremento tra la media dei primi due e gli ultimi due serie di tira 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C e 13 +14 + 15 = D. La formula: (C + D) / (A + B) dà un valore di 1 per i topi che non sono affaticato. Questo può essere espresso in percentuale in modo che un mouse senza fatica ha un valore di 0% e un mouse che arti anteriori sono completamente affaticato ha un valore di 100%.
2. Test Hanging
Con i test pensili, equilibrio, coordinazione e condizione muscolare può essere valutata. Questi test si basano sulla conoscenza che i topi sono desiderosi di restare appeso a un filo o una griglia fino ad esaurimento 16. Ci sono due test pensili distintive che all'inizio della prova siasolo i due arti anteriori o quattro arti sono utilizzati, usando rispettivamente un filo o griglia. La prova appeso con il filo e la griglia sono il metodo di tempo sospeso più lungo adattato da DMD_M.2.1.004.pdf e DMD_M.2.1.005.pdf rispettivamente. Un limite appeso fisso viene utilizzato di 600 sec. La maggior parte dei topi wild type può appendere per 600 secondi, mentre i topi distrofici non può. Per ridurre il trascorrere del tempo l'esecuzione di questa prova, un tempo massimo di impiccagione è stato messo in atto. I topi che cadono fuori il filo o la griglia prima di allora sono date fino a due tentativi. Questo viene fatto per riassicurare che i topi sono davvero in grado di appendere e non cadono a causa di goffaggine.
- Prova pensile con due arti
- Apparecchiatura impostare: Strettamente garantire un panno di metallo di spessore traino 2 mm a uno scaffale con del nastro adesivo e mantenere il gancio circa il 370; cm sopra uno strato di assestamento. Nota: in alternativa, potrebbero essere utilizzati a 55 cm di larghezza mm di filo metallico di spessore 2 che è strettamente protetta tra due tribune verticali. La distanza di 37 cm è sufficiente a incoraggiare i topi a rimanere appeso, ma anche sufficientemente bassa per evitare che i topi da lesioni in caso di caduta verso il basso. Il filo non deve vibrare o spostare durante la prova in quanto ciò potrebbe interferire con le prestazioni del mouse.
- Maneggiare il mouse con la coda e portarlo vicino al filo.
- Sia il mouse afferrare il filo con solo le due zampe anteriori, e abbassare le zampe posteriori in modo tale che il mouse si blocca solo con le due zampe anteriori sul filo (Figura 2B).
- Direttamente avviare il timer quando il mouse viene rilasciato. Dopo il rilascio, i topi forti cercano di catturare il filo con tutti i quattro arti e la coda, che è consentito (Figura 2C).
- Quando un mouse mostra un comportamento improprio (come in equilibrio su o deliberatamente salta fuori il filo come shriscatto a figure 2D e 2E), affrontare direttamente questo sostituendo il mouse sul filo senza fermare il timer.
- Quando un topo cade il filo, fermare il timer e registrare il tempo appeso.
- Quando i topi sono in grado di appendere per 600 sec, li togliere il filo e restituirli alla gabbia. I topi che cadono prima di questo limite sono dati un massimo di altri due tentativi.
- Registrare il tempo massimo di sospensione (cioè la più lunga delle prove) e di utilizzare per ulteriori analisi.
- Prova attaccatura con quattro arti
- Apparecchiatura istituito: Utilizzare una mano fatta quadrato o il coperchio di una grande gabbia per un ratto o coniglio per questo test. Posizionare la griglia 25 cm sopra biancheria morbida per evitare i topi da sé danneggiare upon cadere, ma anche per scoraggiare topi saltare intenzionalmente fuori della griglia. Fissare saldamente la griglia in modo che lo sperimentatore non deve tenere manualmente la rete durante l'esperimento come questi movimenti potrebbero interfere con le prestazioni del mouse.
- Posizionare il mouse sulla griglia in modo che afferra con le sue quattro zampe.
- Invertire la griglia in modo che il mouse è appesa e direttamente avviare il timer.
- La sessione di test termina per i topi che sono in grado di appendere per una durata di 600 sec. Dare topi che cadono fuori dalla griglia prima di un massimo di altri due tentativi.
- Utilizzare il tempo massimo di sospensione (ie. La più lunga delle prove) per ulteriori analisi.
3. Gara podistica rotarod
Con la forza muscolare prova rotarod, coordinazione, equilibrio, e la condizione può essere determinato 17.
- Apparecchiatura set up: Per questo test, i topi devono correre su un tubo rotante. Assicurarsi che la velocità di regime è fissato a 5 giri al minuto (rpm), e che la velocità aumenta 5-45 rpm nei primi 15 sec all'avvio. Dopo questo deve mantenere la sua velocità.
- Posizionare il mouse sul tubo del rotarodquando ruota a bassa velocità costante di 5 rpm. Cinque topi possono essere testati contemporaneamente.
- Inizia la corsa una volta che tutti i topi sono posizionati. Entro i primi 15 sec la velocità del tubo accelera 5-45 rpm dopo che mantiene tale velocità.
- Monitorare la corsa. Il tempo di esecuzione è continuamente registrata dal software. Tempo di esecuzione si arresta automaticamente quando il mouse si stacca il tubo come questo attiva la barra del tempo posizionato sotto il tubo. Riposizionare topi che girano attorno fronte nella direzione opposta del tubo durante l'esecuzione senza fermare il tubo di ruotare.
- Terminare la sessione di test per i topi che sono in grado di correre per una durata di 500 sec. Dare topi un massimo di altri due tentativi, permettendo loro di migliorare il loro tempo di esecuzione, quando cadono in precedenza.
- Utilizzare il tempo massimo di funzionamento (ossia la più lunga delle prove) per ulteriori analisi.
4. Esercizio Treadmill
Iltapis roulant può essere utilizzato in tre modi come strumento nella ricerca clinica pre. In primo luogo, costretto tapis roulant in esecuzione può essere utilizzato per aggravare la patologia della malattia, come descritto in questo protocollo (vedi anche: DMD_M2.1.001.pdf ). In secondo luogo, la capacità di funzionamento massima di topi e gli effetti dei trattamenti su questo può essere valutata (Vedere per il metodo per consentire topi funzionano fino all'esaurimento DMD_M.2.1.003.pdf ). Infine, tapis roulant in esecuzione può essere utilizzato prima per un altro test funzionale di esaurire il mouse in modo che si comporta meno bene nella seconda prova 13. Ciò avviene esercitando topi due o tre volte alla settimana come descritto di seguito, direttamente seguito da una delle prove funzionali descritte protocollo 1-3.
- Apparecchiatura istituito: Ci sono diversi tapis roulant disponibili in commercio su cui molti topi possono run simultaneamente e per i quali l'elevazione, la durata e la velocità può essere regolata. Alcuni tapis roulant sono dotati di una griglia per fornire shock a bassa intensità per incoraggiare i topi a correre. Tuttavia, i topi mdx sono sensibili allo stress e può essere facilmente motivati in modo più amichevole da una leggera spinta con la mano nella direzione di marcia. Pertanto, è fortemente incoraggiato NON utilizzare la griglia shock. Generalmente, la stimolazione con la mano è necessaria solo durante la prima sessione in esecuzione.
- Posizionare il mouse sul tapis roulant orizzontale.
- Avviare il tapis roulant ad una velocità di marcia di 12 m / min. Velocità inferiori (8 m / min) devono essere utilizzati in topi (> 15 mesi), il cui velocità più elevate facilmente portare ad esaurimento.
- Durante la prima sessione, incoraggiare topi per eseguire spingendo delicatamente quando sono vicino alla fine del nastro.
- Quando i topi hanno eseguito per una durata di 30 minuti, metterli di nuovo nella loro gabbia.
- Ripetere questa operazione due volte a settimana, ad esempio per 12 settimane. Consenti periodi di riposo quando necessario. Per esempio, alcuni topi mdx devono smettere di correre e dovrebbe essere consentito di riposare per un paio di minuti. Se questo accade, spegnere la cinghia, dare a tutti i topi un periodo di riposo di due minuti, girare la cintura per due minuti a 4 m / min. Dopo questo, aumentare la velocità di 12 m / min e permettere ai topi per finire il protocollo. È importante che tutti i topi completare l'intero protocollo esecuzione.
Nota: In caso di topi mdx hanno bisogno di periodi di riposo, si consideri un warm up prima che il protocollo di esercizio 30 min. Questa sessione scaldare costituito da: un periodo di acclimatazione 2 min ad una velocità di 4 m / min, seguito immediatamente da un 8 min riscaldamento a 8 m / min.
Nelle nostre mani 4-16 settimane topi mdx femminili sono in grado di completare il protocollo di esercizio 30 min senza riposo. Altri hanno riferito che in età abbinato maschile topi mdx il 45% dei topi hanno bisogno di periodi di riposo per terminare l'esercizio. Il protocollo di warm up a ridurres la quantità di fermate 12.
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Representative Results
La forza di presa zampa anteriore di tipo selvatico e topi mdx aumenta di età compresa tra 4-12 settimane e riduce di nuovo nei topi anziani. Le svalutazioni in vigore possono già essere osservati in giovani topi mdx. Dati rappresentativi di nove settimane vecchie topi femmina sono mostrati nelle Figure 1A e 1 B. Anche se la stanchezza non differisce tra i ceppi ancora a questa età, i topi mdx sono più deboli di topi wild type. Non abbiamo ancora i dati sulle affaticabilità in mdx anziani e topi wild type.
Per ottenere risultati affidabili e riproducibili, multipli valutazioni devono essere fatte dallo stesso sperimentatore. Noi descriviamo qui di tirare 15 volte / individuale, numeri comunque piccoli di tiri (a partire da 5 tiri) anche fornire dati affidabili. Particolare attenzione deve essere redatto per il posizionamento delle zampe sulla griglia in quanto questo può influenzare in gran parte i risultati. Durante il tiro, solo due zampe anteriori devono essere utilizzati e devono be ben posizionato accanto all'altro (Figura 1C). Quando il mouse non mostra resistenza alla trazione, il valore non deve essere preso in considerazione.
Per le due prove degli arti e quattro arti appesi, soprattutto i giovani (4-16 settimane) topi wild type possono facilmente raggiungere il tempo massimo impiccagione di 600 sec. Contrastingly, le prestazioni di giovani topi mdx è compromessa (che quasi mai raggiungono tempo massimo impiccagione), e inoltre si deteriora con l'età, anche se entrambi i ceppi messo tutti gli sforzi in esecuzione di questi test appendere ai loro migliori capacità (Figure 2A e 3A). Le differenze più grandi in tempi sospesa tra tipo mdx e topi selvatici si ottengono con il filo. Pertanto, anche le piccole dimensioni degli effetti dei composti sulla funzione muscolare possono essere rilevati con questo test. Prestazioni Hanging (o qualsiasi altro tipo di prestazione) differiscono all'interno e tra gli individui nel tempo con conseguente elevato barre di deviazione standard. Nonetheless, topi mdx costantemente prestazioni peggiori rispetto all'età abbinato topi wild type (Figura 2A). Esecuzione di valutazioni multiple in grado di fornire indicazioni più dettagliate in miglioramenti funzionali su trattamento di solo misurazioni endpoint. Va tenuto presente che nella prima sessione animali imparano come eseguire un test funzionale. Questa curva di apprendimento, che è presente in tutti i test, è chiaramente visibile tra 4-6 settimane di età. Tuttavia, poiché i topi crescono rapidamente anche in questo periodo di età, una distinzione tra miglioramento a causa di apprendimento e / o la crescita non può essere fatta. Sono stati anche trovati differenze di genere in appesi prestazioni per i due arti appendere test. Prestazioni di topi femmina mdx supera quello dei maschi di ~ 100 sec, e le prestazioni del tapis roulant sfidato femminile topi mdx è quasi paragonabile a quella dei maschi non contestati (confrontare con figure 2A 4A). Questo risultato sottolinea l'importanza di utilizzare età unnd genere abbinato topi per evitare distorsioni. Abbiamo dati preliminari suggeriscono che le differenze in termini di prestazioni in entrambe le prove sospese tra il tipo di topi mdx aumenti e selvatici in molto vecchio (18 mesi) topi.
Alcuni topi mostrano un comportamento inappropriato per evitare appesa al filo come: equilibrio sul filo, salta fuori il filo deliberatamente ecc (figure 2D e 2E), anche se la maggior parte dei mouse conformi alla prova e appendere con due o quattro arti ( Figure 2B e 2C). Di tanto in tanto, i topi forti saltano fuori il filo intenzionalmente. Sono appesi prima di saltare con solo due zampe posteriori e la coda sul filo e guardare in basso per stimare la distanza al suolo. Comportamento inadeguato che si vede di tanto in tanto sulla griglia durante il test di quattro arto sospensione è costituita da deliberatamente saltare fuori dalla griglia o salire sulla griglia. Tutte le forme inappropriate di comportamento possono essere easily distinto e non dovrebbe essere consentito. I topi che evitano appeso in uno di questi modi vanno direttamente reimmessi sul filo o griglia senza fermare il timer.
Sul rotarod, topi mdx quasi mai correre per la durata massima di 500 secondi, mentre una percentuale maggiore di topi wild type do (Figura 3B). Con l'età, l'esecuzione di prestazioni di entrambi i ceppi diminuisce. Alcuni topi sono in grado di serrare saldamente sul tubo rotante e impedisce l'esecuzione da 'cartwheeling' intorno. Questo non può essere corretto ed è una grave limitazione della prova quando più topi iniziano facendo per periodi prolungati, aumentando così la variazione all'interno dei gruppi sperimentali. Soprattutto per alcuni topi che corrono in parte e in parte la ruota, e durante la transizione da cartwheeling in caduta in esecuzione. Alcuni topi girano sul tubo rotante durante l'esecuzione. Questo comportamento dovrebbe essere affrontato per riposizionando direttamente i topi sul tubo, confuori fermarlo. Anche questo tipo di comportamento limita l'utilità di questo test.
Treadmill in esecuzione forzata è un esercizio semplice ed efficace per esacerbare la patologia della malattia in topi mdx non trattate, mentre wild type topi sottoposti allo stesso protocollo non sono interessati. In generale, i topi familiarizzare con il tapis roulant, dopo una sessione di formazione iniziale e sono disposti a correre, soprattutto quando più i topi sono in esecuzione contemporaneamente. Vecchi topi mdx (oltre 15 mesi di età) hanno difficoltà a correre e non possono far fronte con la stessa velocità di marcia di 12 m / min per 30 min usato per topi giovani. Pertanto, una velocità di rotazione più lenta di 8 m / min per 30 min si raccomanda consentire a tutti i mouse per terminare l'intero protocollo. Topi mdx sono particolarmente vulnerabili alle contrazioni eccentriche, quindi discesa in esecuzione può essere utilizzato solo per un breve periodo.
In alternativa, altri test funzionali, come i due fili arto appeso test può essere effettuata direttamente dopo l'esecuzione (Figura 4A). Utilizzando questo motivo lo studio, le differenze tra i ceppi o bracci di trattamento possono aumentare come tapis roulant sfidato topi mdx trattati sono meno in grado di eseguire questi test di sedentari topi mdx 13.
Come accennato in precedenza, quando si studia la funzione muscolare nei topi mdx, il C57BL/10ScSnJ ceppo selvatico deve essere utilizzato, che è del background genetico corrispondente. Consigliamo questo come anche tra i ceppi di tipo selvaggio inbred tapis roulant in esecuzione delle prestazioni differisce 18,19. Ma anche nei test funzionali non invasive, prestazioni funzionali è influenzata da background genetico. Figura 5 illustra questo in tre grafici rappresentativi in cui le prestazioni di topi mdx su uno sfondo BL/10 e su un fondo misto composto da BL/10, BL/6J, DBA2 e 129OLA sono confrontati. Come si può apprezzare i topi sfondo mistiprestazioni migliori nei test filo appeso e peggio sul rotarod.
Figura 1. Forza di presa zampa anteriore, risultati rappresentativi e corretto posizionamento delle zampe. A. forelimb forza di presa normalizzata per il peso corporeo di 9 settimane mdx femminile (n = 5) e wild type (n = 4) topi. Forza di presa è già alterata in giovani topi mdx. Gli asterischi indicano p <0,05 e dati sono presentati come media ± st.dev. B. La fatica degli stessi individui, come mostrato in A, sia in media meno del 10% e non variano tra i ceppi. C. Per ottenere dati affidabili, attenzione dovrebbe essere pagato al posizionamento delle zampe durante forelimb analisi forza di presa. Il corretto posizionamento del mouse; due zampe anteriori sono uno accanto all'altro, hindlimbs are non toccare la rete e il mouse è tirando in linea retta D. L'errato posizionamento delle zampe anteriori,. il mouse non sta tirando in linea retta. Quando questo accade, o quando vengono utilizzati solo una delle zampe anteriori o anche gli arti posteriori, il mouse si gira durante la trazione o manca di mostrare la resistenza, i dati devono essere eliminate. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Due test arto pensili, risultati rappresentativi e comportamenti appendere adeguato e appropriato. A. Un esempio rappresentativo della prova due impiccagione arto effettuato una volta alla settimana in mdx maschile (n = 18, 4-10 settimane, n = 13, 11 e 12 settimane, n = 10, 13 settimane) e l'età e genere abbinato topi wild type (n = 6). Una curva di apprendimento è visibile per entrambi i ceppi nelle prime settimane di test. Prestazioni di topi mdx è stata peggiore rispetto a quella dei topi wild type. I dati presentati come media ± st.dev. Tempo massimo consentito attaccatura è indicato dalla linea tratteggiata. B. La posizione di partenza di questo test è con le due zampe anteriori. C. A seconda della capacità funzionale del topo può anche utilizzare le zampe posteriori e la coda. D e E. Un piccolo sottogruppo di topi, particolarmente forti topi wild type, occasionalmente può evitare di appendere salendo sulle barre laterali o bilanciamento sul filo. Alcuni topi saltano intenzionalmente fuori il filo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Quattro arti impiccagione e rotarod test di corsa. A. Quattro prestazioni arto appeso valutata una volta alla settimana in mdx maschile (n = 18, 4-10 settimane, n = 13, 11 e 12 settimane, n = 8, 13 settimane) e la wild type ( n = 6) topi. Nel corso del tempo, i topi mdx appendere meno lungo di topi wild type. B. Rotarod tempi di esecuzione non differiva tra i giovani mdx maschile (n = 18, 4-10 settimane, n = 13, 11 e 12 settimane, n = 10, 13 settimane ) e topi wild type (n = 6). I dati sono rappresentati come media ± st.dev.
Figura 4. L'effetto del tapis roulant costretto esecuzione protocollo di esercizio sulle prestazioni funzionali e scheletrico patologia muscolare nei topi femmina. Muscolare Patologia deliberatamenteesacerbato lasciando topi eseguiti su un tapis roulant orizzontale tre volte alla settimana a 12 m / min per 30 min per una durata di 12 settimane. Direttamente dopo l'esecuzione, topi dovevano partecipare alla prova due arto appeso. Mentre tutti i topi wild type (n = 5) rimangono appesi fino al massimo consentito, tutti i topi mdx (n = 6) cadere il filo anteriore (p <0.001, i dati presentati come media ± st.dev.). B. La presenza di danneggiamento della membrana è stata determinata valutando plasmatici della creatina chinasi (CK), livelli che fuoriescono su fibre muscolari attraverso le lacrime nella membrana. Livelli di CK sono stati elevati nei topi mdx rispetto ai topi wild type prima dell'esercizio. Esercizio al treadmill subito un aumento dei livelli (p <0,01 indicate da un asterisco, i dati presentati come media ± st.dev.) Nei topi mdx, mentre sono rimasti bassi in topi wild type. CD. Muscoli dei topi mdx sono molto vulnerabili a tapis roulant esercizio, peggioramento patologia malattia ampiamente unopo un paio di settimane di corsa. Queste colorazioni ematossilina e eosina del quadricipite di 16 settimane di età nonexercised (C) e tapis roulant esercitata (D) mdx topo mostrano che estesa fibrosi e necrosi sono sviluppati. E. muscoli di topi wild type che subiscono lo stesso protocollo di esecuzione non sono interessati. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Effetto di un fondo misto sulle prestazioni funzionali in topi mdx. Differenze in background influenza genetica prestazioni funzionali. Per illustrare questo, le prestazioni di mdx maschile (BL/10 sfondo, n = 18, 4-10 settimane, n = 13, 11 e 12 weeks, n = 10, 13 settimane) e mdx (BL/10 misto, BL/6J, DBA2 e 129OLA sfondo, n = 5) topi è stato confrontato nel corso del tempo. A. Due le prestazioni del test arto impiccagione era significativamente diversa tra i due ceppi. B. Quattro i risultati dei test arto pensili sono stati leggermente superiori in background misti topi mdx. C. rotarod tempi di esecuzione anche un po 'differivano tra i ceppi. I dati presentati come media ± st.dev.
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Discussion
I test funzionali presentati qui sono riproducibili, facili da eseguire e applicabile al wild type e topi distrofici indipendentemente dalla loro età. I test forniscono strumenti utili per la validità clinicamente valutare la funzione muscolare, la forza, la condizione e il coordinamento. Quando si testano gli effetti di un composto sulla storia naturale della malattia, i test non invasivi descritte qui (forza di presa forelimb, entrambe le prove pensili e il test rotarod) può essere ben combinati in un regime di prova funzionale in cui questi test vengono eseguiti in giorni consecutivi . Questi protocolli non sono dannose per topi mdx e possono essere utilizzati in modo longitudinale 10. Va tenuto presente che i risultati di ciascuna di queste prove sono generati da differenti o in parte sovrapposti gruppi muscolari invece di un singolo muscolo. Pertanto, utilizzando una combinazione di test multipli è consigliato avere un quadro più completo e quindi una migliore comprensione della funzionalità della esperienzagruppi mentali. In alternativa, i miglioramenti funzionali di un unico muscolo possono essere valutati sulla base delle misure di fisiologia muscolare 20.
Come test comportamentali, anche i test funzionali in grado di dimostrare ampia variazione tra diversi tipi di mouse, o all'interno di un topo tra valutazioni diverse. Per ridurre la variazione, tutte le prove devono essere eseguite dallo stesso sperimentatore che ha familiarità con i topi. Variabili esterne come odori e suoni nella stanza, ora del giorno e il giorno della settimana in cui viene eseguito il test dovrebbero essere tenuti il più possibile costante. I topi dovrebbero essere di genere e di età corrispondente. Quando si utilizza tapis roulant esacerbare la progressione della malattia, è indispensabile utilizzare un protocollo standardizzato in cui tutti i parametri di funzionamento (durata, velocità e pendenza) vengono mantenute costanti nel tempo per tutti i gruppi sperimentali, in modo che tutti i topi sono ugualmente trattati. Sebbene la maggioranza dei topi sono pronti a partecipare ai test funzionali e la maggior parte degli animali mostrano altalivelli di disponibilità, alcuni topi (principalmente forte topi wild type) di tanto in tanto evitare di eseguire il comportamento di test e spettacolo evasione. Se questo comportamento non è corretto per, i falsi si potrebbero trarre conclusioni 21. Fortunatamente, questi tipi di comportamento sono osservati solo occasionalmente e possono essere corretti per posizionando il mouse avanti sul filo, griglia o rotarod, o tirando un'altra volta sul misuratore forza di presa.
Miglioramenti in una prova funzionale (ad esempio appesi test di valutazione della funzione muscolare) non necessariamente devono collaborare verifica con i miglioramenti in un altro test (forelimb forza di presa valutare sola forza muscolare). Nei topi mdx, miglioramenti nella funzione muscolare possono distinguere prima che in forza muscolare. Questo è visto anche in pazienti DMD che partecipano a studi clinici dove i miglioramenti clinicamente significativi nel test del cammino di 6 minuti non cooccur con miglioramenti nella forza muscolare 6,7. Tuttavia, questo puòin parte dipendono dal meccanismo di funzionamento del composto testato ed è possibile che altri composti migliorare la forza e non funzione. Pertanto, i risultati dei test dovrebbero essere interpretati con il meccanismo d'azione del composto in mente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Margriet Hulsker per la sua assistenza per la ripresa e aiutare a ottenere immagini di topi e dei revisori per i loro commenti molto costruttivi. Questo lavoro è stato sostenuto da ZonMw, TREAT-NMD (numero di contratto LSHM series-CT-2006-036825) e il Parent Project Duchenne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
| Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
| Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
| Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
| Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |
References
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