Summary
Det primære effektmål i kliniske forsøg for neuromuskulære lidelser er generelt forbedret muskelfunktion. Derfor vurderer effekten af potentielle terapeutiske forbindelser på muskel ydeevne pre klinisk i musemodeller er af stor betydning. Vi her beskriver flere funktionelle tests for at løse dette.
Abstract
Duchennes muskeldystrofi (DMD) er en alvorlig og progressiv muskelsvind lidelse, som ingen kur tilgængelig. Ikke desto mindre har flere potentielle farmaceutiske forbindelser og genterapi tilgange skred ind kliniske forsøg. Med forbedring i muskel funktion er det vigtigste endepunkt i disse studier, har en masse lagt vægt på etablering af pålidelige, reproducerbare, og let at udføre funktionsprøver at pre klinisk vurdere muskelfunktion, styrke, kondition og koordination i mdx musemodel for DMD. Både invasive og invasive tests er tilgængelige. Tests, der ikke forværrer sygdommen kan anvendes til at bestemme den naturlige historie af sygdommen og virkningerne af terapeutiske interventioner (f.eks. Forben gribestyrke test, to forskellige hængende tests ved hjælp af enten en ledning eller et gitter og rotarod kører). Alternativt kan tvinges løbebånd kører bruges til at forbedre sygdomsprogression og / eller vurderebeskyttende virkninger af terapeutiske interventioner på sygdom patologi. Vi her beskriver, hvordan du udfører disse mest almindeligt anvendte funktionelle tests på en pålidelig og reproducerbar måde. Ved hjælp af disse protokoller er baseret på standard operationelle procedurer muliggør sammenligning af data mellem forskellige laboratorier.
Introduction
Duchennes muskeldystrofi (DMD) er den mest almindelige neuromuskulære lidelse, der rammer 1:5000 nyfødte drenge. Denne alvorlige og progressiv muskelsvind sygdom er forårsaget af mutationer i DMD-genet, der forstyrrer den åbne læseramme og forhindre syntesen af funktionelt dystrophinprotein. Muskelfibre mangler dystrophin er sårbare over for at udøve induceret skade. Ved udmattelse af musklen gendannelseskapacitet, og på grund af kronisk inflammation af beskadigede muskler, er fibre erstattet af bindevæv og fedt, derefter fører til et tab af funktion. Generelt DMD patienter mister ambulation af de nedre lemmer i begyndelsen af andet årti. Senere også musklerne i arme og skulderåget er berørt og patienterne ofte udvikler thoracolumbale skoliose skyldes asymmetrisk svækkelse af muskler, der støtter rygsøjlen. Assisteret ventilation kræves generelt i de sene teenageår eller begyndelsen af tyverne. Respiratoriske og hjertesvigt blytil døden i tredje eller fjerde årti 1.
Selvom det forårsagende gen er blevet opdaget over 25 år siden 2, er der ingen kur til rådighed for DMD. Men bedre sundhedspleje og brug af kortikosteroider har øget levealder i den vestlige verden 3.. Med brugen af dyremodeller som MDX mus, store skridt fremad ind opdagelsen af potentielle terapeutiske strategier er blevet foretaget. MDX mus er det mest almindeligt anvendte DMD musemodel. Det har en punktmutation i exon 23 af det murine Dmd genet og mangler derfor dystrophin 4. I løbet af de sidste par år har mange foreslåede strategier skred ind kliniske forsøg 5-9. I disse forsøg forbedring af muskel funktion er det primære endpoint, der ligger til grund vigtigheden af at teste fordel af forbindelser på muskel funktion i mus under pre kliniske fase af test.
Ligesom DMDpatienter også dystrofin negative muskelfibre af mdx-mus er sårbare over for at udøve induceret skade og deres muskler er svækket i forhold til C57BL/10ScSnJ vildtypemus. Denne forringelse kan vurderes med en række funktionelle tests. Nogle af disse tests er noninvasive og ikke interfererer med muskel patologi (fx forelimb håndtrykskraft hængende tests og rotarod kører). Derfor kan de bruges til at overvåge den naturlige historie af sygdommen eller bestemme virkningerne af forbindelser på sygdomsprogression. For at få en dybtgående billede af den indflydelse af forbindelser på muskel funktion i MDX mus, kan en funktionel test regime, der ikke interfererer med sygdomsprogression bestående af alle disse analyser anvendes 10.
Alternativt kan tvinges løbebånd kørende bruges til forsætligt forværre sygdommen og afprøve de beskyttende kapacitet forbindelser 11. Løbebåndet kan også væreanvendt som effektmål, hvor køretid indtil udmattelse måles 12, eller som et værktøj til træthed MDX-mus, så de klarer sig dårligere i en efterfølgende funktionstest sikrer større forskelle i resultaterne mellem behandlingsgrupper 13. Når du vælger funktionelle tests, skal deres effekt på sygdomsudviklingen skal holdes for øje, især når afprøvning dystrofiske mus som MDX mus 14.
Vi her beskriver i detaljer, hvordan du udfører de mest almindeligt anvendte funktionelle tests i en pålidelig og reproducerbar måde baseret på tilgængelige standard operationelle procedurer fra TREAT-NMD netværk. Klik her for at besøge TREAT-NMD .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De her beskrevne eksperimenter blev godkendt af Animal Ethics Committee (DEC) i Leiden University Medical Center (LUMC). Mus blev avlet af dyret facilitet i LUMC og holdes i individuelt ventilerede bure med 12 hr lys mørke cyklusser. De havde ad libitum adgang til vand og standard chow.
Når du udfører nogen af de funktionelle tests er beskrevet nedenfor, eksperimentelle betingelser skal kontrolleres nøje for at reducere variation. Fortrinsvis bør anvendes alder og køn matchede mus, som performance forskellig alder og køn. Mus, der tilhører samme kuld randomiseret i forsøgsgrupper. Dyrene skal testes af samme operatør, der blindet til de eksperimentelle grupper. Tests skal udføres på samme tidspunkt og ugedag, samme rum kan observeres 14 Stor variation mellem de enkelte mus og tidspunkter for alle at udligne lugte, lyde, osv.funktionelle tests, derfor 6-8 mus / forsøgsgruppe skal bruges. Funktionsundersøgelserne kan også i høj grad varierer mellem de forskellige indavlede vildtype stammer. Derfor bør eksperimentelle og styrer vildtypemus altid har tilsvarende baggrunde (i tilfælde af mdx mus bruger C57BL/10ScSnJ vildtypestamme). Alle data er beskrevet her er blevet opnået med C57BL/10ScSnJ vildtypestamme, som vi refererer til som vildtype herfra på. De her beskrevne test kan anvendes i længderetningen fra mindst 1 til 19 måneder i mdx-mus og vildtypemus. Tests bør ikke gentages mere end én gang om ugen for at forhindre mus fra at miste interesse og vilje til at udføre opgaven.
1.. Forben Gribestyrke Test
Brug forelimb gribestyrke test til at måle styrken af forbenene. Testen er baseret på den tendens til en mus til instinktivt gribe et gitter når den er ophængt i halen 15 og adapted fra DMD_M2.2.001.pdf .
- Apparat oprettet: Vedhæft et gitter til en krafttransducer, der måler den maksimale kraft, som musen på nettet i løbet af trækket. Sørg for, at indstillingen er på Peak spænding tilstand (T-PK) til at trække. Enhederne i kraft kan justeres i enten ounces-of-force, gram-of-force, pounds-of-force, kilogram-of-force, eller newton.
Bemærk: Vi foretrækker at arbejde med gram enhed af værdier. Flere målere er kommercielt tilgængelige, men kun aksiale transducere giver pålidelige resultater som løftestang typen krafttransducere negativt er påvirket af de fysiske love i håndtaget effekt. Enten en ubøjelige gitter eller trekant kan anvendes med søjler, der er 1-2 mm i diameter. - Forud for testen vurdere legemsvægt af musen for at muliggøre normalisering for legemsvægt.
- Brug gram enhed af værdier. Nulstil måleren ved starten af hver recording.
- Fjern musen fra sit bur ved at snuppe halen og bevæger sig vandret mod gitteret.
- Kontroller, at musen griber nettet stramt med begge forpoter.
- Træk musen væk fra nettet, således at dens rækkevidde er brudt, den højeste kraft, til nettet, vil blive vist på transduceren display, som kan være enten manuelt eller automatisk registreret.
- Kun tage trækker højde, hvor musen viser resistens over for forsøgslederen. Afvis foranstaltninger, hvor kun én forpote, eller bagben blev anvendt, og hvor musen slået under trækket.
- Lad musen trække gitteret tre gange i træk, og derefter returnere den i buret for en hvileperiode på mindst et minut Bemærk:. Mellem serie trækker en hvileperiode er nødvendig for musen til at komme sig og undgå vanedannelse.
- Så lad musen udføre fire serier af træk, hver efterfulgt af en kort hvileperiode. På denne måde stændigee har trukket alt 15x (3 trækker x 5 gange = 15 trækker).
- Bestem den maksimale gribestyrke og normalisere for kropsvægt ved at tage gennemsnittet af de tre højeste værdier ud af de 15 værdier indsamlet.
- Valgfrit: Bestem træthed ved at beregne decrement mellem gennemsnittet af de to første og de sidste to serier af pulls 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C og 13 +14 + 15 = D. Med formlen: (C + D) / (A + B) giver en værdi på 1 for mus, der ikke er trætte. Dette kan udtrykkes i procent, således at en mus uden træthed har en værdi på 0% og en mus, som forlemmer fuldstændigt trætte har en værdi på 100%.
2. Hængende Tests
Med hængende tests, balance, koordination og muskel tilstand kan vurderes. Disse tests er baseret på den viden, at mus er ivrige efter at blive hængende på en wire eller gitter indtil udmattelse 16. Der er to markante hængende prøver i som ved forsøgets begyndelse entenkun de to forben eller alle fire lemmer anvendes, ved hjælp af en wire eller gitter henholdsvis. Den hængende test med tråden og gitteret er den længste suspension tid metode tilpasset fra DMD_M.2.1.004.pdf og DMD_M.2.1.005.pdf hhv. En fast hængende grænse anvendes på 600 sek. Størstedelen af vildtypemus kan hænge i 600 sek, medens dystrofe mus kan ikke. For at reducere tidsforbruget udføre denne test blev en maksimal hængende tid sat på plads. Mus, der falder af tråden eller gitter inden da er givet op til to yderligere forsøg. Dette er gjort for at genforsikre at mus er virkelig ude af stand til at hænge og ikke forfalder til klodsethed.
- Hængende test med to ben
- Apparat oprettet: Stramt sikre et 2 mm tykt metal klud strop til en hylde med tape og vedligeholde bøjlen omkring 370, cm over et lag af strøelse. Bemærk: Alternativt kan en 55 cm bred 2 mm tyk metaltråd som er tæt sikret mellem 2 lodrette stande anvendes. Afstanden 37 cm er tilstrækkelig til at fremme mus til at forblive hængende, men også lav nok til at forhindre mus fra skader når de falder ned. Wiren må ikke vibrere eller fortrænge under testen, da dette kan interferere med udførelsen af musen.
- Håndter musen via halen og bringe den i nærheden af wiren.
- Lad musen gribe tråden med de to kun forpoterne og sænke bagben på en sådan måde, at mus kun hænger med de to forpoter på tråden (figur 2B).
- Direkte starte timeren når musen slippes. Efter udgivelsen, stærke mus forsøger at fange ledningen med alle fire lemmer og hale, som er tilladt (Figur 2C).
- Når en mus viser forkert adfærd (ligesom at balancere på eller bevidst hoppe fra tråden som shejer i figur 2D og 2E), direkte løse dette ved at erstatte musen på wiren uden at stoppe timeren.
- Når en mus falder af wire, stoppe timeren og optage hængende tid.
- Når musene er i stand til at hænge på 600 sek tage dem fra wiren og returnere dem til buret. Mus, der falder før denne grænse får højst to yderligere forsøg.
- Den maksimale hængende tid (dvs. den længste af forsøg) og bruge denne til yderligere analyse.
- Hængende test med fire lemmer
- Apparat oprettet: Brug enten en håndlavet firkantet eller låget på en stor bur til en rotte eller kanin til denne test. Placer gitteret 25 cm over blødt underlag for at forhindre mus i at skade sig selv ved at falde, men også at afskrække mus til forsætligt springe ud af nettet. Stramt fastgøre nettet, således at forsøgslederen ikke nødt til manuelt at holde nettet under eksperimentet, da disse bevægelser kunne jegnterfere med musen ydeevne.
- Anbring musen på nettet, således at det griber den med sine fire poter.
- Vend gitteret, så musen hænger og direkte starte timeren.
- Den testsession ender for mus, der er i stand til at hænge i en varighed på 600 sek. Giv mus, der falder ud af nettet tidligere højst to yderligere forsøg.
- Brug den maksimale hængende tid (dvs.. Den længste af de forsøg) for yderligere analyse.
3. Rotarod Running
Med rotarodtesten muskelstyrke, kan koordination, balance og tilstand bestemmes 17.
- Apparat oprettet: Til denne test, mus nødt til at køre på en roterende rør. Sørg for, at konstant hastighed er sat til 5 omdrejninger per minut (rpm), og at hastigheden stiger 5-45 rpm i de første 15 sekunder ved start. Efter dette har det at bevare sin hastighed.
- Placer mus på røret af rotarodnår det roterer ved en langsom konstant hastighed på 5 opm. Fem mus kan testes samtidigt.
- Start kørslen, når alle mus er placeret. Inden for de første 15 sek hastigheden af røret accelererer 5-45 rpm, hvorefter den fastholder denne hastighed.
- Overvåg løb. Køretiden løbende registreres af softwaren. Køretid stopper automatisk, når en mus falder af røret, da det aktiverer den tid bar placeret under røret. Flyt mus, der drejer omkring overfor den modsatte retning på røret, mens den kører uden at stoppe røret til at rotere.
- Afslut test session for mus, der er i stand til at køre i en varighed på 500 sek. Giv mus maksimalt to flere forsøger giver dem mulighed for at forbedre deres køretid, når de falder tidligere.
- Brug den maksimale køretid (dvs. den længste af de forsøg) for yderligere analyse.
4.. Løbebånd Øvelse
Denløbebånd kan bruges på tre måder som et redskab i pre klinisk forskning. For det første kan tvinges løbebånd drift anvendes til at forværre sygdomspatologi som beskrevet i denne protokol (se også: DMD_M2.1.001.pdf ). For det andet kan den maksimale køreevne af mus og virkningerne af behandlinger på dette vurderes (se for metode til at lade mus løbe indtil udmattelse DMD_M.2.1.003.pdf ). Endelig kan løbebånd løb anvendes forud for en anden funktionel test for at udtømme musen, så det fungerer mindre godt i den anden test 13. Dette gøres ved at udøve mus to gange eller tre gange ugentligt som beskrevet nedenfor, direkte efterfulgt af enten en af de funktionelle tests, der er beskrevet i protokol 1-3.
- Apparat oprettet: Der er flere løbebånd kommercielt tilgængelige på hvor flere mus kan run samtidig og for hvilke elevation, varighed og hastighed kan justeres. Nogle løbebånd er udstyret med et gitter til at levere lav intensitet chok at tilskynde mus til at køre. Men mdx-mus er følsomme over for stress og let kan begrundes i en venligere måde af en let tryk med hånden i køreretningen. Derfor er det stærkt opfordres til ikke at bruge det chok nettet. Generelt er stimulering med hånden kun nødvendig i den første løbessession.
- Placer mus på den vandrette løbebånd.
- Start løbebåndet ved en hastighed på 12 m / min. Lavere hastigheder (8 m / min) skal anvendes i gamle mus (> 15 måneder), hvor højere hastigheder let føre til udmattelse.
- Under den første session, tilskynde mus til at køre ved forsigtigt at skubbe dem, når de er i slutningen af båndet.
- Når mus har kørt for en periode på 30 minutter, placere dem tilbage i deres bur.
- Gentag dette to gange om ugen for fx 12 uger. Tillad hvileperioder efter behov. For eksempel har nogle MDX mus nødt til at stoppe kører, og skal have lov til at hvile i et par min. Hvis dette sker, skal remmen, skal du give musene en hvileperiode på to minutter, vend bælte på for to minutter ved 4 m / min. Efter dette, øge hastigheden til 12 m / min og tillade musene at afslutte protokollen. Det er vigtigt, at alle mus fuldføre hele kørende protokol.
Bemærk: I tilfælde MDX-mus har brug for hvileperioder, overveje en varm op før 30 min motion protokol. Denne varme op session består af: en 2 min akklimatiseringsperiode ved en hastighed på 4 m / min, umiddelbart efterfulgt af en 8 min opvarmningstid på 8 m / min.
I vores hænder 4-16 uger gamle kvindelige mdx mus er i stand til at fuldføre 30 min motion protokol uden at hvile. Andre har rapporteret, at i en alder matchede mandlig MDX mus 45% af musene behøver hvileperioder for at afslutte øvelsen. Den varme op protokol reduceres mængden af stop 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den forelimb gribestyrke af vildtype og mdx mus stiger i alderen 4-12 uger, og reducerer igen i ældre mus. Nedskrivninger i kraft allerede kan observeres i de unge mdx-mus. Repræsentative data af 9 uger gamle hunmus er vist i figur 1A og 1 B. Selvom træthed ikke adskiller mellem stammerne endnu i denne alder, mdx mus er svagere end vildtype mus. Vi har ikke data endnu på udmattelse i ældre MDX og vilde type mus.
For at opnå pålidelige og reproducerbare resultater, der skal gøres ved den samme forsøgslederen flere vurderinger. Vi her beskriver at trække 15 gange / individ, men et mindre antal pulls (så lavt som 5 trækker) også give pålidelige data. Bør udarbejdes Omhyggelig opmærksomhed på positioneringen af poter på nettet, da dette kan i høj grad påvirke resultater. Under trækket bør kun begge forpoterne skal anvendes, og de er nødt til be placeres pænt ved siden af hinanden (figur 1C). Når musen ikke viser modstand mod træk bør værdien ikke tages i betragtning.
For de to lemmer og fire lemmer hængende tests, især unge (4-16 uger gamle) vildtypemus kan nemt nå den maksimale hængende tid på 600 sek. Contrastingly er udførelsen af unge mdx mus svækket (de næppe nogensinde opnå maksimal hængende tid), og også forringes med alderen, selv om begge stammer lægge alle kræfter i at udføre disse hænge tests på deres bedste evner (figur 2A og 3A). Der opnås større forskelle i hængende gange mellem mdx og vildtypemus med wiren. Derfor kan selv små effektstørrelser af forbindelser på muskelfunktion påvises under anvendelse af denne test. Hængende performance (eller enhver anden form for ydelse) adskiller sig inden for og mellem individer over tid resulterer i høj standardafvigelse barer. Nonetheless, mdx mus konsekvent udføre værre end alder matchede vildtypemus (figur 2A). Udførelse af flere vurderinger kan give mere detaljeret indblik i funktionelle forbedringer efter behandling end kun endpoint målinger. Det bør erindres, at i den første session lærer dyrene, hvordan du udfører en funktionstest. Dette indlæringskurve, der er til stede i alle test, er klart synlig mellem 4-6 ugers alderen. Men fordi mus også vokse hurtigt i denne alder periode, en sondring mellem forbedring på grund indlæring og / eller vækst kan ikke foretages. Der er også fundet kønsforskelle i hængende ydelse for de to led hænge test. Ydelse af kvindelige MDX-mus overstiger værdien af hanner af ~ 100 sekunder, og udførelse af løbebånd udfordret kvindelige MDX-mus er næsten sammenlignes med de ubestridte hanner (sammenlign figur 2A med 4A). Dette fund understreger vigtigheden af at bruge alder and køn matchede mus for at undgå bias. Vi har foreløbige data tyder på, at forskelle i præstation i både hængende tests mellem mdx og vildtypemus stigninger i meget gammel (18 måneder) mus.
Nogle mus viser upassende opførsel for at undgå at hænge på wiren lignende, balancerende på wire, hoppe fra tråden bevidst etc. (figur 2D og 2E), selv om de fleste af mus i overensstemmelse med testen og hænge med enten to eller fire ben ( 2B og 2C). Lejlighedsvis stærke mus hoppe fra tråden forsætligt. De hænger før hoppe med kun to bagben og hale på wiren og kigge ned til at estimere afstanden til jorden. Upassende adfærd, der lejlighedsvis ses på nettet i løbet af de fire lemmer hængende Testen består af bevidst hoppe væk fra nettet eller klatring på nettet. Enhver form for uhensigtsmæssig adfærd kan være easily fornemme og bør ikke være tilladt. Mus, der undgår at hænge i en af disse måder, skal placeres direkte tilbage på wiren eller gitter uden at stoppe timeren.
På rotarod, mdx mus næppe nogensinde løbe den maksimale køretid på 500 sekunder, mens en større andel af vildtypemus gør (figur 3B). Med alderen kører udførelsen af begge stammer falder. Nogle mus er i stand til at klemme tæt på den roterende rør og undgå at løbe af 'cartwheeling' rundt. Dette kan ikke korrigeres for, og er en alvorlig begrænsning af testen, når flere mus begynde at gøre dette i længere perioder, og derved øge variationen inden de eksperimentelle grupper. Især for nogle mus, der dels kører og dels Cartwheel, og i løbet af overgangen fra cartwheeling til at køre efteråret. Nogle mus vende rundt på den roterende rør, mens den kører. Denne adfærd bør løses for ved direkte genplacering musene på røret, medud stoppe det. Også denne form for adfærd begrænser nytten af denne test.
Tvungen løbebånd kører, er en nem og effektiv øvelse til at forværre sygdommen patologi i ubehandlede MDX mus, mens vild type mus, der gennemgår den samme protokol ikke påvirkes. Generelt mus blive fortrolig med løbebånd efter en indledende træning og er villige til at køre, især når flere mus kører samtidigt. Gamle mdx mus (over 15 måneder) har svært ved løb og ikke kan klare den samme hastighed på 12 m / min i 30 min anvendes til unge mus. Derfor anbefales en langsommere hastighed på 8 m / min i 30 min så alle mus til at afslutte hele protokollen. MDX mus er særligt sårbare over for excentriske sammentrækninger derfor downhill kører, kan kun bruges til en kort varighed.
Alternativt kan andre funktionelle tests som de to ben hængende wire test kan udføres direkte efter kører (figur 4A). Ved hjælp af dette studie design, sandsynligvis vil stige forskelle mellem stammer eller behandlingsgrupper som løbebånd udfordret ubehandlede MDX mus er mindre i stand til at udføre disse tests end stillesiddende MDX mus 13.
Som nævnt tidligere, når man studerer muskelfunktionen hos mdx-mus, den C57BL/10ScSnJ vildtypestamme skal bruges som er af en tilsvarende genetisk baggrund. Vi anbefaler dette som selv mellem indavlede vildtypestammer løbebånd kører præstationer varierer 18,19. Men også i invasive funktionelle tests er funktionelle ydeevne påvirkes af genetiske baggrunde. Figur 5 illustrerer dette i tre repræsentative grafer, hvor udførelsen af mdx-mus på en BL/10 baggrund og på en blandet baggrund, der består af BL/10, BL/6J, DBA2 og 129OLA sammenlignes. Som det kan forstås af de blandede baggrund musklarer sig bedre i de hængende wire test og værre på rotarod.
Figur 1. Forelimb håndtrykskraft repræsentative resultater og korrekt positionering af poter. A. forben gribestyrke normaliseret for kropsvægt 9 uger gamle kvindelige MDX (n = 5) og vild type (n = 4) mus. Gribestyrke er allerede nedsat hos unge mdx-mus. Stjerner angiver p <0,05 og data præsenteres som gennemsnit ± st.dev. B. Træthed af de samme personer, som vist i A, var i gennemsnit mindre end 10% og ikke varierer mellem stammer. C. For at opnå pålidelige data, opmærksomhed bør tages hensyn til placeringen af poterne under forben gribestyrke analyse. Korrekt placering af musen, to forpoter er ved siden af hinanden, baglemmer are ikke rører nettet og musen trækker i en lige linje D. Forkert placering af forpoterne. musen ikke trækker i en lige linje. Når dette sker, eller når der anvendes kun én forpoteknogler eller også bagbensknogler, musen vender rundt i løbet trække eller mangler at vise modstand, data skal kasseres. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. To lemmer hængende tests, repræsentative resultater og passende og upassende hængende adfærd. A. Et repræsentativt eksempel på de to lemmer hængende test udført én gang ugentligt i mandlig MDX (n = 18, 4-10 uger, n = 13, 11 og 12 uger, n = 10, 13 uger), og alder og køn matchede vildtypemus (n = 6). En indlæringskurven er synligt for begge stammer i de første par uger af test. Udførelse af mdx-mus var værre sammenlignet med vildtypemus. Data præsenteret som gennemsnit ± st.dev. Maksimal hængende fristen er angivet ved den stiplede linje. B. Den korrekte startposition med denne test er med de to forpoterne. C. Afhængigt funktionsevne af musen kan også bruge bagbensknogler og hale. D og E. En lille delmængde af mus, især stærke vild type mus, kan lejlighedsvis undgå hængende ved klatring på side barer eller balancerer på wiren. Nogle mus med vilje hopper af tråden. Klik her for at se en større version af dette tal.
files/ftp_upload/51303/51303fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Fire lemmer hængende og rotarod kører test. A. Fire lemmer hængende vurderede ydelse en gang om ugen i mandlig MDX (n = 18, 4-10 uger, n = 13, 11 og 12 uger, n = 8, 13 uger) og vildtype ( n = 6) mus. Over tid, mdx mus hænge mindre lang end vild type mus. B. rotarod kører tider var ingen forskel mellem unge mandlige MDX (n = 18, 4-10 uger, n = 13, 11 og 12 uger, n = 10, 13 uger ) og vildtype-mus (n = 6). Data er repræsenteret som middelværdi ± st.dev.
Figur 4.. Effekten af tvungen løbebånd løbetræning protokol om funktionsdygtighed og funktionelle skeletmuskulatur patologi hos hunmus. Muscle patologi var bevidstforværres ved at lade mus køre på en vandret løbebånd tre gange om ugen på 12 m / min i 30 min i en periode på 12 uger. Umiddelbart efter kører, havde mus til at deltage i de to led hængende test. Mens alle vildtypemus (n = 5), forbliver hængende indtil den maksimalt tilladte alle mdx-mus (n = 6) falder wiren tidligere (p <0,001, data præsenteret som middelværdi ± st.dev.). B. Tilstedeværelsen skade membran blev bestemt ved at vurdere plasma kreatinkinase (CK) niveauer, som lækker ud af muskelfibre gennem tårer i membranen. CK niveauer blev forhøjet i mdx-mus i forhold til vildtype-mus før motion. Løbebånd motion straks forhøjede niveauer (p <0,01 er angivet med asterisk, data præsenteres som gennemsnit ± st.dev.) I MDX mus, mens de fortsat lave i vild type mus. Cd. Muskler mdx mus er meget sårbare over for løbebånd, forværring patologi udstrakt enfter et par uger for at køre. Disse Hæmatoxylin og eosin farvninger af quadriceps af en 16 uger gammel nonexercised (C) og løbebånd udnyttet (D) MDX mus viser, at omfattende fibrose og nekrose er udviklet. E. Muskler vildtypemus gennemgår samme kørende protokol berøres ikke. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Effekt af en blandet baggrund på funktionel præstation i mdx-mus. Forskelle i genetiske baggrund indflydelse funktionelle ydeevne. For at illustrere dette, udførelse af mandlig MDX (BL/10 baggrund, n = 18, 4-10 uger, n = 13, 11 og 12 weeaa, n = 10, 13 uger), og mdx (blandet BL/10, BL/6J, DBA2 og 129OLA baggrund, n = 5) mus blev sammenlignet over tid. A. To led hængende test ydeevne var væsentligt forskellige mellem de to stammer. B. Fire lemmer hængende testresultater var lidt højere i de blandede baggrund MDX-mus. C. rotarod køretider også lidt forskellig mellem stammer. Data præsenteret som gennemsnit ± st.dev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De funktionelle tests præsenteret her, er reproducerbare, let at udføre og som gælder for vildtype og dystrofiske mus uafhængig af deres alder. Testene giver nyttige værktøjer til at pre klinisk vurdere muskelfunktion, styrke, kondition og koordination. Ved afprøvning af virkningerne af en forbindelse på den naturlige historie af sygdommen, de invasive tests beskrevet her (forben gribestyrke begge hængende tests og rotarodtesten) kan pænt kombineres i en funktionel test regime, hvor disse tests udføres på hinanden følgende dage . Disse protokoller er ikke skader mdx-mus og kan anvendes i en langsgående måde 10. Det bør erindres, at resultaterne af hver af disse prøver er genereret af forskellige eller delvist overlappende muskelgrupper i stedet for en enkelt muskel. Ved hjælp af en kombination af flere tests anbefales derfor at få et mere komplet billede, og dermed bedre indsigt i funktionaliteten af erfamentale grupper. Alternativt kan funktionelle forbedringer af et eneste muskel vurderes ved hjælp muskelfysiologi målinger 20.
Ligesom adfærdsmæssige test, også funktionelle tests kan vise omfattende variation mellem forskellige mus, eller inden for en mus mellem forskellige vurderinger. For at reducere variation, bør alle prøver skal udføres af den samme eksperimentator, der er fortrolig med mus. Eksterne variabler som lugte og lyde i rummet, skal tidspunktet på dagen og dag i ugen, hvor testen udføres holdes så konstant som muligt. Mus skal være køn og alder matchet. Når du bruger løbebånd kører for at forværre sygdommens progression, er det vigtigt at bruge en standardiseret protokol, hvor alle kørende parametre (kører tid, hastighed og hældning) holdes konstant over tid for alle forsøgsgrupper, således at alle musene behandles lige. Selv om de fleste af mus er ivrige efter at deltage i de funktionelle tests, og de fleste dyr viser højniveauer af vilje, nogle mus (primært stærk vildtype mus) lejlighedsvis undgå at udføre testen og show undgåelsesadfærd. Når denne adfærd ikke er korrigeret for, kunne drages forkerte konklusioner 21. Heldigvis er disse typer af adfærd kun observeret lejlighedsvis og kan korrigeres for ved at placere musen tilbage på wiren, gitter eller rotarod, eller trække en anden tid på gribestyrke meter.
Forbedringer i en funktionel test (f.eks hængende test vurdere muskelfunktion) ikke nødvendigvis at samarbejde forekomme med forbedringer i anden test (forben gribestyrke vurdere eneste muskelstyrke). I MDX mus, kan der skelnes mellem forbedringer i muskelfunktion tidligere end i muskelstyrke. Dette ses også i DMD patienter, der deltager i kliniske forsøg, hvor klinisk betydningsfulde forbedringer i 6 min gangtest ikke cooccur med forbedringer i muskelstyrke 6,7. Men dette kantil dels afhænge af den arbejdende mekanisme af den testede forbindelse, og det er muligt, at andre forbindelser forbedre styrke og ikke funktion. Derfor bør resultaterne af testene tolkes med virkningsmekanismen for forbindelsen i tankerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Margriet Hulsker for hendes fotografiske assistance og hjælp til at opnå billeder af mus og korrekturlæsere for deres meget konstruktive kommentarer. Dette arbejde blev støttet af ZonMw, TREAT-NMD (kontrakt nummer LSHM-CT-2006 til 036.825) og Duchenne Parent Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
| Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
| Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
| Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
| Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |
References
- Blake, D. J., Weir, A., Newey, S. E., Davies, K. E. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9, 77-93 Forthcoming.
- Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., Moore, K. J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81, 1189-1192 (1984).
- Bowles, D. E., et al. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Mol. Ther. 20, 443-455 (2012).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 Forthcoming.
- Goemans, N. M., et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 364, 1513-1522 (2011).
- Malik, V., et al. Gentamicin-induced readthrough of stop codons in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 67, 771-780 (2010).
- Skuk, D., et al. First test of a "high-density injection" protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscul. Disord. 17, 38-46 (2007).
- van Putten, M., et al. A 3 months mild functional test regime does not affect disease parameters in young mdx mice. Neuromuscul. Disord. 20, 273-280 (2010).
- De Luca, A., et al. Gentamicin treatment in exercised mdx mice: Identification of dystrophin-sensitive pathways and evaluation of efficacy in work-loaded dystrophic muscle. Neurobiol. Dis. 32, 243-253 (2008).
- Radley-Crabb, H., et al. A single 30min treadmill exercise session is suitable for 'proof-of concept studies' in adult mdx mice: A comparison of the early consequences of two different treadmill protocols. Neuromuscul. Disord. , (2011).
- van Putten, M., et al. The effects of low levels of dystrophin on mouse muscle function and pathology. PLoS.One. , (2012).
- Willmann, R., et al. Enhancing translation: Guidelines for standard pre-clinical experiments in mdx mice. Neuromuscul. Disord. 1, 43-49 (2011).
- Connolly, A. M., Keeling, R. M., Mehta, S., Pestronk, A., Sanes, J. R. Three mouse models of muscular dystrophy: the natural history of strength and fatigue in dystrophin-, dystrophin/utrophin-, and laminin alpha2-deficient mice. Neuromuscul. Disord. 11, 703-712 (2001).
- Rafael, J. A., Nitta, Y., Peters, J., Davies, K. E. Testing of SHIRPA, a mouse phenotypic assessment protocol on Dmd(mdx) and Dmd(mdx3cv) dystrophin-deficient mice. Mamm. Genome. 11, 725-728 (2000).
- Chapillon, P., Lalonde, R., Jones, N., Caston, J. Early development of synchronized walking on the rotorod in rats. Effects of training and handling. Behav. Brain Res. 93, 77-81 (1998).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Lerman, I., et al. Genetic variability in forced and voluntary endurance exercise performance in seven inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 92, 2245-2255 (2002).
- Sharp, P. S., Jee, H., Wells, D. J. Physiological characterization of muscle strength with variable levels of dystrophin restoration in mdx mice following local antisense therapy. Mol. Ther. 19, 165-171 (2011).
- Klein, S. M., et al. Noninvasive in vivo assessment of muscle impairment in the mdx mouse model--a comparison of two common wire hanging methods with two different results. J. Neurosci. Methods. 203, 292-297 (2012).
