Summary
Nöromüsküler hastalıklar için klinik çalışmalarda birincil sonuç ölçütü genellikle kas fonksiyonunu artırıldı. Bu nedenle, fare modellerinde klinik öncesi kas performansı üzerindeki potansiyel terapötik bileşiklerin etkisini değerlendirmek büyük önem taşımaktadır. Biz burada bu adrese birkaç fonksiyonel testler açıklar.
Abstract
Duchenne müsküler distrofi (DMD) tedavisi kullanılabilir olduğu bozukluğu israf ciddi ve ilerleyici kas. Bununla birlikte, birkaç farklı farmasötik bileşikler ve gen terapisi yaklaşımları klinik çalışmalarda içine ilerlemiştir. Bu çalışmalarda en önemli uç noktası olma kas fonksiyonunda iyileşme ile, vurgu bir sürü kas fonksiyonu, gücü, durumu, ve koordinasyon değerlendirmek klinik öncesi fonksiyonel testler gerçekleştirmek için, güvenilir, tekrarlanabilir ve kolay kurma üzerine yerleştirilmiştir DMD için mdx fare modeli. Hem invaziv ve non-invaziv testler mevcuttur. Hastalığı şiddetlendirebilir olmayan testler hastalığın doğal seyrini ve terapötik müdahaleler (örneğin. Ön ayakları kavrama kuvveti testi, bir tel ya da bir ızgara ve rotarod çalışan kullanarak iki farklı asılı testleri) etkilerini belirlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, zorunlu yürüme bandı yürütülmesini hastalığın ilerlemesini artırmak ve / veya değerlendirilmesi için kullanılabilirhastalık patolojisi üzerinde tedavi edici girişimlerin koruyucu etkileri. Burada güvenilir ve yeniden üretilebilir bir şekilde bu en yaygın olarak kullanılan fonksiyonel testlerin nasıl açıklar. Standart operasyon prosedürlerine dayanarak bu protokolleri kullanarak farklı laboratuarlar arasında verilerin karşılaştırılmasını sağlar.
Introduction
Duchenne müsküler distrofi (DMD) 1:5,000 yenidoğan erkek etkileyen en sık görülen nöromüsküler hastalıktır. Bu şiddetli ve ilerleyici kas erimesi hastalığı açık okuma çerçevesini bozabilir ve fonksiyonel distrofin protein sentezini engellemek DMD genindeki mutasyonların neden olur. Distrofini eksik kas lifleri inüklenmiş egzersiz açıktır. Kasın rejeneratif kapasitesinin tükendikten sonra, ve zarar gören kas kronik inflamasyon, lifler, örneğin fonksiyon kaybına yol açan, bağ dokusu ve yağ ile değiştirilir. Genellikle, DMD hastaları, ikinci on yılda erken alt ekstremite ambulasyonu kaybedersiniz. Daha sonra, aynı zamanda kol ve omuz kuşağı kasları etkilenen ve hastalar genellikle nedeniyle omuriliği destekleyen kasların asimetrik zayıflamasına torakolomber skolyoz gelişebilir. Yardımlı havalandırma genellikle geç ergenlik veya erken yirmili gereklidir. Solunum ve kalp yetmezliği kurşunüçüncü veya dördüncü on 1 ölüme.
Neden olan gen 25 yıl önce 2 keşfedilmiş olmasına rağmen, DMD için kullanılabilir tedavisi yoktur. Ancak, sağlık bakımı gelişmiş ve kortikosteroid kullanımı Batı dünyasında 3 yaşam beklentisini artmıştır. Mdx fare gibi hayvan modellerinin kullanımı ile önemli adımlar potansiyel tedavi stratejileri keşif içine iletmek yapılmıştır. Mdx fare en sık kullanılan DMD fare modelidir. Bu murin Dmd geninin ekson 23, bir nokta mutasyon vardır ve bunun sonucu olarak distrofin 4 yoksundur. Yıl son çift üzerinde, önerilen birçok strateji klinik çalışmalarda 5-9 içine ilerlemiştir. Bu çalışmalarda, kas fonksiyonlarının iyileştirilmesi test öncesi klinik aşamasında farelerde kas fonksiyonu üzerinde bileşiklerin yararı test önemi vurgulanarak, birincil son nokta.
DMD gibiHastalar aynı zamanda, MDX farelerin distrofin olumsuz kas lifleri hasarını egzersiz hassas olan ve kas fonksiyonu C57BL/10ScSnJ yabani tip farelere kıyasla bozulur. Bu bozulma fonksiyonel testler çeşitli değerlendirilebilir. Bu testlerin bazıları noninvaziv ve kas patoloji (örn. ön ayakları kavrama gücü, asılı testleri ve rotarod çalışan) karışmaz. Bu yüzden, hastalığın doğal seyrini izlemek veya hastalığın ilerlemesi üzerinde bileşiklerin etkisini belirlemek için de kullanılabilir. Bir mdx farelerde kas fonksiyonu üzerinde bileşiklerin etkisi derinlik resimde, bu testlerin tüm oluşan hastalığın ilerlemesi ile müdahale etmeyen bir işlevsel test rejimi 10 kullanılabilmektedir almak için.
Alternatif olarak, zorla koşu bandı koşu kasten hastalığın ilerlemesini kötüleştirecek ve bileşiklerin 11 koruyucu kapasitelerini test etmek için kullanılır. Koşu bandı da olabilirBu tedavi grupları arasındaki performans 13 daha büyük farklılıklar sağlanması daha sonraki bir işlevsel test daha az iyi performans o kadar tükenme kadar çalışma süresi 12 ölçülen ya da yorgunluk, MDX fareler için bir araç olarak edildiği sonuç ölçüsü olarak kullanılır. Fonksiyonel testler seçerken mdx fare gibi 14 distrofik fareler test, özellikle hastalığın ilerlemesi üzerindeki etkileri göz önünde tutulmalıdır.
Biz burada TEDAVİ NMD ağı mevcut standart işletim prosedürleri dayalı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde en sık kullanılan fonksiyonel testler yapmak için nasıl ayrıntılı olarak açıklanmıştır. TEDAVİ Ulusal Füze Savunması ziyaret etmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada anlatılan deneyler Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi (LUMC) ve Hayvan Etik Komitesi (DEC) tarafından onaylanmıştır. Fareler LUMC en hayvan tesis tarafından yetiştirilen ve 12 saat aydınlık karanlık döngüsü ile tek tek havalandırılmış kafeslerde tutuldu. Onlar su ve standart mamasına ad libitum erişim vardı.
Aşağıda tarif edilen fonksiyonel testlerin herhangi gerçekleştirirken, deney koşulları kesinlikle değişimini azaltmak için kontrol edilmesi gerekir. Performans yaş ve cinsiyetler arasındaki farklılık gibi Tercihen, yaş ve cinsiyet eşleştirilmiş fareler, kullanılmalıdır. Aynı çöp ait Fareler deney grupları üzerinde randomize olmalıdır. Hayvanlar deney grupları için kör aynı operatör tarafından test edilmelidir. Testler tek tek farelerden ve zaman noktaları arasında 14 büyük değişim herkes için görülebilir vb kokuları, sesleri, eşitlemek için gün ve hafta içi, aynı odada aynı anda üzerinde yapılmalıdırişlevsel testler, bu nedenle 6-8 farenin / deney grubu kullanılmalıdır. Fonksiyonel test performansı da büyük ölçüde farklı akraba yabani tip suşlar arasında farklılık olabilir. Bu yüzden, deney ve kontrol yabani tip farenin her zaman (MDX farelerde durumunda C57BL/10ScSnJ vahşi tip suşu kullanın) karşılık gelen arka olmalıdır. Burada tarif edilen tüm veriler, burada itibaren vahşi tip bakın C57BL/10ScSnJ vahşi tip suş ile elde edilmiştir. Burada tarif edilen deneyler MDX ve vahşi tip farelerde yaşı en az 1-19 ay uzunlamasına kullanılabilir. Testler ilgi ve görevi gerçekleştirmek için istekli kaybetme fareler önlemek için fazla haftada bir kez daha tekrar edilmemelidir.
1.. Ön ayakları Tutuş Dayanım Testi
Ön ayakları gücünü ölçmek için ön ayakları kavrama kuvveti testi kullanın. Test kuyruk 15 tarafından askıya zaman içgüdüsel bir ızgara kavramak için bir fare eğilimi dayalı ve adapte edilirD DMD_M2.2.001.pdf .
- Aparatı kurmak: çekme sırasında ızgara üzerinde fare tarafından uygulanan maksimum kuvvet ölçen bir kuvvet dönüştürücü, bir ızgara takın. Emin ayar çekmek için Tepe germe modunda (T-PK) açık olduğundan emin olun. Güç birimleri ya da gram-of-kuvvet, gram-of-kuvveti-of pound-kuvvet, kilogram-of-kuvvet veya Newton olarak ayarlanabilir.
Not: Biz değerlerin birimi olarak gram ile çalışmayı tercih. Birden metre ticari olarak mevcuttur, ancak kolu tipi kuvvet dönüştürücüler olumsuz kolu etkisi fizik yasaları tarafından etkilenmektedir gibi yalnızca eksenel dönüştürücüler güvenilir sonuçlar verir. , Bir ızgara veya nonflexible üçgen ya çapı 1-2 mm olan çubuklar kullanılabilir. - Testten önce, vücut ağırlığı için normalleştirme izin vermek için, fare vücut ağırlığı değerlendirmek.
- Değerler birim olarak gram kullanın. Her reco başlangıcında metre sıfırlarding.
- Kuyruk kapma ve ızgaraya doğru yatay olarak hareket ederek kafesinden fareyi çıkarın.
- Fare hem forepaws sıkıca kavrıyor ızgara kontrol edin.
- Onun kavramak kırık olduğunu bu yüzden uzak ızgara fareyi çekin; ızgarasına uygulanan yüksek kuvvet elle ya da otomatik olarak kaydedilmiş olabilir Transdüserin, ekranda gösterilir.
- Sadece fare deneyci direnç gösteren hangi hesaba çeker alır. Sadece bir forepaw veya arka ayakların kullanılan ve fare çekme sırasında çevrildi hangi önlemlerin Reddet.
- Fare bir satırda grid üç kez çekin ve ardından en az bir dakika dinlenme dönemi için kafes içinde iade edelim Not:. Serisi arasında bir dinlenme süresi fare kurtarmak ve alışkanlık oluşumunu önlemek için gerekli çeker.
- Sonra fare çeker dört dizi, kısa bir dinlenme dönemi takip her yapalım. Bu şekilde mousE 15x (3 çekişten x 5 kat = 15) çekmeniz toplam çekti.
- Maksimum kavrama gücünü belirlemek ve toplanan 15 değerleri dışında yüksek üç değerlerin ortalaması alınarak vücut ağırlığı normalleştirmek.
- İsteğe bağlı: ilk iki ortalamasının ve çekiştirmeye son iki dizi 1 +2 +3 = A, 4 +5 +6 = B, 10 +11 +12 = C arasında ve 13 +14 + düşmeyi hesaplayarak yorgunluk belirleyin 15 = D. Formül: (C + D) / (A + B) yorgun olmayan fareler için 1 bir değer verir. Yorulmadan fare% 0 arasında bir değere ve ön ayaklar tamamen% 100 arasında bir değere sahiptir aşırı yorgunluk olduğu bir fare olması için bu yüzde olarak ifade edilebilir.
2. Testler asılı
Asılı testleri, denge, koordinasyon ve kas durumu ile değerlendirilebilir. Bu testler fareler bitkinlik 16 kadar tel veya ızgara üzerinde asılı kalması için istekli olduğu bilgisine dayanmaktadır. Iki farklı asılı testler ya testin başlangıcında bulunmaktadırİki ön ayakları veya tüm dört bacağı sırasıyla sadece bir tel veya ızgara kullanarak kullanılır. Tel ve ızgara kullanarak asılı testi uyarlanan uzun asma zaman yöntem DMD_M.2.1.004.pdf ve DMD_M.2.1.005.pdf sırasıyla. Sabit asılı sınırı 600 saniye kullanılır. Distrofik fareler Yapamam ise yabani tip farelerin çoğunluğu, 600 saniye için asabilirsiniz. Bu testi yapmanın zamanı harcama azaltmak için, maksimum asılı süre yerde kuruldu. Daha önce tel veya ızgara düşmek Fareler iki denemeden kadar verilir. Bu fareler asmak için gerçekten edemiyoruz nedeniyle sakarlık düşmemesi reasürans yapılır.
- Iki kol ile bir test asılı
- Aparatı kurmak: Sıkıca bant ile bir rafa 2 mm kalınlığında metal kumaş askı güvenli ve çevresinde 37 askı korumak0, yatak tabakası üzerinde cm. Not: alternatif olarak, sıkı bir şekilde 2 dikey bantları arasında sabitlenmektedir genişliğinde 2 mm kalınlığında bir metal tel 55 cm kullanılabilir. 37 cm mesafe asılı kalması fareler teşvik etmek için yeterli, ama aynı zamanda düşme zaman yaralanmalardan fareler önlemek için yeteri kadar düşüktür. Tel titrer ya bu fare performansı olumsuz etkileyebilir test sırasında yerini almamalıdır.
- Kuyruk üzerinden fareyi idare ve tel yakın getirmek.
- Fare sadece iki ön ayakların ile tel kavramak edelim ve fare sadece telin (Şekil 2B) üzerindeki iki ön ayakların ile asılı olduğu bir şekilde arka ayakların alt.
- Fare serbest bırakıldığında doğrudan sayacını başlatmak. Serbest bırakıldıktan sonra, güçlü fareler (Şekil 2C) izin verilir, tüm dört bacağı ve kuyruğu ile tel yakalamaya çalışın.
- Bir fare üzerinde dengeleme ya da kasıtlı sh olarak tel atlama gibi yanlış bir davranış gösterir (zaman) Şekil 2D ve 2E kendi doğrudan zamanlayıcı durmadan tel üzerinde fareyi değiştirerek bu adresi.
- Bir fare teli kapalı düştüğünde, Sayacı durdurmak ve asılı zamanı kaydedecektir.
- Fareler 600 sn asmak için mümkün olduğunda, tel onları çıkarmak ve kafes onları geri. Bu sınırın önce düşmek Fareler iki denemeden bir süre verilir.
- (Çalışmaların uzun yani) maksimum asılı zamanını kaydedin ve daha fazla analiz için kullanabilirsiniz.
- Dört bacağı ile testi asılı
- Aparatı kurmak: kullanın ya kare ya da bu test için bir sıçan veya tavşan için büyük bir kafesin kapağı yapılmış bir el. Düşen üzerine kendilerine zarar fareler önlemek için 25 cm yumuşak yatak üzerinde ızgara yerleştirin, aynı zamanda kasten ızgara kapalı atlamak için fareler vazgeçirmek için. Deneyci elle bu hareketler olarak deney sırasında ızgara tutmak zorunda kalmaması sıkıca ızgarayı güvenli olabilir iFarenin performansı ile nterfere.
- Onun dört pençeleri ile anlamasından böylece ızgara üzerinde fare yerleştirin.
- Fare asılı böylece ızgarayı ters çevirin ve doğrudan Sayacı başlatmak.
- Test oturumu 600 saniye bir süre için asmak mümkün olan fareler için sona erer. Izgara kapalı iki denemeden önce maksimum düşme fareler verin.
- Daha fazla analiz için maksimum asılı zaman (yani. Çalışmaların uzun) kullanın.
3. Rotarod Koşu
Rotarod Test kas gücü, koordinasyon, denge, ve durumu 17 tespit edilebilir.
- Aparatı kurmak: Bu test için, fareler dönen bir tüp üzerinde çalıştırmak zorunda. Sabit hız dakika (rpm) başına 5 devirlerde ayarlanmış olduğundan emin olun ve ilk 15 saniye içinde 5-45 rpm hız artar o zaman başladı. Bundan sonra onun hızını korumak için vardır.
- Döner çemberde geçirdiği bir tüp üzerinde fareler yerleştirinit 5 rpm yavaş sabit bir hızda döndüğü zaman. Beş fareye, eşzamanlı olarak test edilebilir.
- Run bir kez tüm fareler konumlandırılmış başlayın. Ilk 15 saniye içinde tüpün hızını bu hızı muhafaza sonra 5-45 rpm hızlandırır.
- Çalışmasını izleyin. Işletim süresi sürekli olarak yazılım tarafından kaydedilir. Bu tüpün altına yerleştirilmiş zaman çubuğu aktive olarak bir fare tüp kapalı düştüğünde zaman çalışan otomatik olarak durur. Döndürmek için tüp durmadan çalışırken tüp üzerinde ters yöne bakan dönüp fareler yeniden konumlandırmak.
- 500 saniyelik bir süre için çalıştırmak mümkün olan fareler için bir test oturumu bitirmek. Farelere daha önce düştüğünde onlara, onların çalışma süresini artırmak için izin iki denemeden bir maksimum verir.
- Daha fazla analiz için (denemelerinin uzun yani) maksimum çalışma süresi kullanın.
4. Koşu Bandı Egzersiz
Koşu bandı öncesi klinik araştırmalarda bir araç olarak üç şekilde kullanılabilir. Öncelikle, zorla koşu bandı koşu (: ayrıca bkz bu protokol açıklandığı gibi hastalığı patoloji azdırmak için kullanılabilir DMD_M2.1.001.pdf ). İkinci olarak, bu ilgili fare ve tedavilerin etkilerinin maksimum çalışma kapasitesi (farenin tükenme kadar çalışmasına izin metodu için bkz değerlendirilebilir DMD_M.2.1.003.pdf ). Son olarak, koşu bandı koşu bu ikinci testte 13 daha az iyi performans böylece fareyi tüketmeye önce başka bir fonksiyonel test için kullanılabilir. Bu doğrudan protokol 1-3 de tarif edilen fonksiyonel testlerden herhangi biri birini takip, aşağıda tarif edildiği gibi iki veya üç kez haftalık fareler egzersiz ile yapılır.
- Aparatı kurmak: birkaç farenin ru can ticari olarak mevcut birkaç koşu bandı vardırn aynı anda ve yükseklik, süre ve hız ayarlanabilir hangi için. Bazı koşu bandı çalıştırmak için fareler teşvik etmek için düşük yoğunluklu şokları sunmak için bir ızgara ile donatılmıştır. Bununla birlikte, MDX farenin basınca karşı hassas ve kolayca akış yönünde el ile hafif bir itme dostça bir şekilde motive edilebilir. Bu nedenle, güçlü şok ızgara KULLANMAYIN teşvik edilmektedir. Genellikle, el ile uyarılması sadece ilk çalışma oturumu sırasında gereklidir.
- Yatay koşu bandı üzerinde fareler yerleştirin.
- / Dk 12 m koşu hızında koşu bandı başlayın. Daha yüksek hızlar kolaylıkla tükenme yol açtığı durumlarda, düşük hızlar (8 m / dakika) (> 15 ay) farelerin kullanılacak gerekir.
- Ilk oturumunda, onlar kemer sonuna yakın olduğunuzda onları hafifçe iterek çalıştırmak için fareler teşvik ediyoruz.
- Fareler 30 dakika bir süre için çalıĢtırdığınızda kendi kafes içine geri koyun.
- Örneğin 12 hafta boyunca haftada iki kez tekrarlayın. Gerektiğinde dinlenme süreleri izin verin. Örneğin, bazı mdx fareler çalışmasını durdurmak ve birkaç dakika dinlenmeye izin verilmelidir var. Bu durumda, kemer kapatın, tüm farelere iki dakikalık bir dinlenme süresi vermek, 4 m / dak iki dakika süreyle kemer açın. Bundan sonra, 12 m / dak hızını artırmak ve fareler protokolü tamamlamak için izin verir. Tüm fareler, tüm çalışma protokolü Tam önemlidir.
Not: mdx fareler dinlenme dönemleri ihtiyaç durumunda 30 dakika egzersiz protokolü öncesine kadar sıcak bir düşünün. Derhal / min 8 m, 8 dakikalık ısınma ve ardından 4 m / dk 'lık bir hızda, 2 dakika iklime alıştırma süresi: Bu ısıtmak oturum oluşur.
Bizim ellerde 4-16 haftalık dişi fareler mdx dinlenme olmadan 30 dakika egzersiz protokolünü tamamlamak edebiliyoruz. Diğerleri yaş erkek mdx farelere farelerin% 45 egzersiz bitirmek için dinlenme süreleri gerek yok uyumlu olduğunu bildirdi. Isınma protokolü azaltmakdurak 12'nin s miktarı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vahşi tip ve MDX farelerin ön ayakları kavrama kuvveti 4-12 haftalık yaş arasında artar ve büyük farelerde daha azaltır. Yürürlükte Bozukluklar zaten genç MDX farelerde gözlemlenebilir. 9 haftalık dişi farelerin Örnek data Şekiller 1 A ve 1 B 'de gösterilmiştir. Yorgunluk bu yaşta henüz suşları arasındaki farklılık olmamasına rağmen, mdx vahşi farelerden daha zayıftır. Biz eski MDX ve vahşi tip farelerde yorgunluğu henüz bir veri yok.
Güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, çoklu değerlendirmeler aynı deneyci tarafından yapılması gerekir. Biz burada (5 çeker gibi düşük), çeker ancak daha az sayıda 15 kez / bireyi çekmek için açıklamak da güvenilir veri sağlar. Dikkat dikkat bu ölçüde sonuçlarını etkilemek gibi ızgara üzerinde pençeleri konumlandırma çizilmelidir. Çekme sırasında, sadece iki forepaws kullanılmalıdır ve b varE yanyana (Şekil 1C) için güzel yerleştirilir. Fare çekme direnci göstermiyorsa, değer dikkate alınmamalıdır.
Iki bacak ve dört ekstremite asılı testler için (4-16 haftalık), özellikle genç yabani tip fareler kolayca 600 sn maksimum asılı saati ulaşabilirsiniz. Contrastingly, genç mdx farelerin performansı hem suşları bu onların en iyi yetenekleri (Şekil 2A ve 3A) teste asmak yerine tüm çaba olsa bile, engelli (onlar neredeyse hiç maksimum asılı zaman ulaşmak) ve aynı zamanda yaşla birlikte bozulur edilir. MDX ve vahşi tip fareler arasında kez askıdaki büyük farklar, tel ile elde edilir. Bu nedenle, kas fonksiyonu üzerinde bileşiklerin etkisi daha küçük boyutları bu testi kullanılarak tespit edilebilir. Asılı performansı (veya performans başka bir türü) yüksek standart sapma barlarda sonuçlanan zamanla bireyler içinde ve arasında değişir. Nonetheless, mdx fareler sürekli yaş (Şekil 2A) vahşi tip farelere eşleşti daha kötü performans. Birden değerlendirmeleri yapmak, sadece uç nokta ölçümleri daha tedavi üzerine fonksiyonel gelişmeler daha detaylı fikir sağlayabilir. Bu ilk oturumda hayvanların bir fonksiyon testlerini gerçekleştirmek için nasıl akılda tutulmalıdır. Tüm testlerde mevcut olan bu öğrenme eğrisi, açıkça yaş 4-6 hafta arasında görülebilir. Fareler nedeniyle de öğrenme ve / veya büyüme bu yaş döneminde, iyileşme arasında bir ayrım hızla büyümeye Ancak, yapılamaz. Iki kol için performansı asılı cinsiyet farklılıkları testi asmak da bulunmuştur. Dişi mdx farelerin performansı ~ 100 sn erkeklerden aşıyor ve koşu bandı meydan dişi mdx farelerin performansı (4A ile Şekil 2A karşılaştırın) tartışmasız erkeklerden neredeyse karşılaştırılabilir. Bu bulgu, yaş a kullanmanın önemini vurgularnd cinsiyet yanlılığı önlemek için fareler eşleşti. Biz yönünde bir ön çalışma verilerine sahip çok eski MDX ve yabani tip sıçanlar artar (18 ay) farenin arasında her iki asılı testlerde performans farklılıkları.
Farelerin çoğunluğu testi uymak ve iki veya dört ekstremite (ya ile asmak rağmen, tel üzerinde dengeleme kasten vb (Şekil 2D ve 2E) tel atlayarak; Bazı fareler gibi tel üzerinde asılı önlemek için uygunsuz davranışlar sergileyebilir Şekiller 2B ve 2C). Bazen, güçlü fareler kasten tel atlamayın. Onlar önce sadece iki arka ayaklarında ve tel üzerindeki kuyruk ile atlama ve yere mesafeyi tahmin etmek için aşağı bakmak için asmak. Bazen dört ekstremite asılı testi sırasında ızgara üzerinde görülen uygunsuz davranış kasten ızgara kapalı atlama veya ızgara üzerinde tırmanma oluşur. Davranışı her olmayan formları easil olabilir,ayırt edici y ve izin verilmemelidir. Bu yollardan birinde asılı önlemek fareler doğrudan sayacını durdurarak olmadan tel veya ızgara geri konulmalıdır.
Vahşi tip farelerde daha büyük bir kısmı (Şekil 3B) yaparken döner çemberde geçirdiği, MDX farenin hemen hemen hiç, 500 saniye maksimum çalışma süresi için çalıştırın. Yaşla birlikte, her iki soy performansını çalışan azaltır. Bazı fareler dönen tüp kenetlenirler ve çevresinde 'cartwheeling' ile çalışan önlemek edebiliyoruz. Bu düzeltilmiş ve birden fazla farenin böylece deney grupları içinde bir varyasyon, artan uzun süreler boyunca bu yapmaya başlamak zaman test ciddi bir sınırlama olamaz. Özellikle kısmen çalıştırın ve kısmen cartwheel ve çalışan düşüş içine cartwheeling geçiş sırasında bazı fareler için. Çalışırken, bazı fareler dönen tüpün etrafında çevirin. Bu davranış, doğrudan, tüp fareler yeniden konumlandırılması tarafından ele alınmalıdırdışarı durdurma. Ayrıca, bu tür bir davranış bu testin kullanımlarını sınırlandırmaktadır.
Aynı protokolü geçiren vahşi tip fareler etkilenmez iken çalışan Zorla koşu bandı, Nontreated mdx farelerde hastalığı patoloji alevlenmesine için kolay ve etkili bir egzersizdir. Genellikle, fare, fareler birden aynı anda çalışan, özellikle de bir ilk antrenmandan sonra koşu bandı aşina olmak ve çalıştırmak için hazırız. (Yaş 15 ay boyunca) Eski mdx fareler çalışan zorluklar var ve genç fareler için kullanılan 30 dakika için 12 m / dk aynı hızda çalışan ile baş edemez. Bu nedenle, 30 dakika 8 m / dak daha yavaş bir çalışma hızı. Mdx fareler kısa bir süre için yalnızca kullanılabilir nedenle yokuş aşağı çalışan, eksantrik kasılmalar özellikle savunmasız tüm protokol bitirmek için tüm fareleri sağlayan tavsiye edilir.
Alternatif olarak, iki uzuv asılı tel t gibi diğer fonksiyonel testlerest (Şekil 4A) çalıştıran hemen sonra gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada tasarım kullanarak, suşları veya tedavi kolları arasındaki farklılıklar bandı meydan işlenmemiş mdx fareler hareketsiz mdx farelere 13 daha bu testlerini daha az yetenekli artması muhtemeldir.
Daha önce de belirtildiği gibi, MDX farelerde kas fonksiyonunu incelenirken, C57BL/10ScSnJ vahşi tip suşu gelen genetik kökenli olan kullanılması gerekmektedir. Biz bile bir koşu bandı 18,19 farklıdır performansını çalışan kendilenmiş yabani tip suşları arasındaki bu tavsiye. Ama aynı zamanda noninvaziv fonksiyonel testler, fonksiyonel performans genetik geçmişleri etkilenir. 5, üç temsilcisi grafik bunu göstermektedir Şekil nerede BL/10 arka plan üzerinde ve BL/10, BL/6J, DBA2 oluşan karma bir arka plan üzerine mdx farelerin performansı ve 129OLA karşılaştırılmıştır. Karışık plan fareler Takdir edileceği gibi,totarod üzerinde asılı tel testlerinde daha iyi ve daha kötü performans.
Şekil 1. 9 haftalık dişi mdx vücut ağırlığı için normalize ön ayakları kavrama gücü, temsilcisi sonuçları ve pençeleri doğru konumlandırma. A. ayakları kavrama kuvveti (n = 5) ve vahşi tip (n = 4) fareler. Kavrama gücü zaten genç mdx farelerde bozulur. Yıldız <0.05 p gösterir ve A'da gösterildiği gibi veri aynı bireylerin ortalama ± st.dev. B. Yorgunluk olarak sunulmaktadır, ortalama% 10'dan daha az oldu ve dikkat, güvenilir veri elde etmek için suşları. C arasında değişmektedir vermedi ön ayakları kavrama kuvveti analizi sırasında pençeleri konumlandırma dikkat edilmelidir. Farenin doğru konumlandırma; iki forepaws birbirine yakın olan, arka ayakların are ızgara dokunmadan ve fare Ön pençelerin D. yanlış yerleştirme düz bir çizgi çekme değildir,. fare düz bir çizgi çekme değildir. Bu durumda, ya da sadece bir forepaw ya da ayaklarda kullanıldığında, fare çekme sırasında etrafında dönüyor ya da direnç göstermek için yoksun, veri atılmalıdır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. İki uzuv asılı testleri, temsili sonuçları ve uygun ve uygun olmayan davranış asılı. A. erkek MDX haftada bir kez gerçekleştirilen iki bacak asılı test temsili bir örneği, (n = 18, 4-10 hafta, n = 13, 11 ve 12 hafta, n = 10, 13 hafta) ve yaş cinsiyet ve vahşi tip fareler eşleşen (n = 6). Bir öğrenme eğrisi test ilk birkaç hafta içinde iki suş için görünür. MDX farelerin performans yabani tip farelere kıyasla daha kötüydü. Ortalama ± st.dev olarak sunulan veriler. İzin verilen maksimum asılı zaman noktalı çizgi ile gösterilir. B. Bu testin doğru başlangıç pozisyonu iki forepaws ile. C. Fare fonksiyonel yeteneği bağlı olarak da D. Arka ayakların ve kuyruk kullanabilir ve fareler E. küçük bir kısmında, özellikle güçlü yabani tip fareler, bazen yan çubuklar üzerinde tırmanma ya da tel üzerinde dengeleyerek asılı önleyebilirsiniz. Bazı fareler bilerek tel atlamayın. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
files/ftp_upload/51303/51303fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 3,. Dört ekstremite asılı ve sınama çalıştırma rotarod. Erkek mdx (n = 18, 4-10 hafta, n = 13, 11 ve 12 hafta, n = 8, 13 hafta) ve yabani tip (kez haftalık değerlendirilen A. Dört uzuv asılı performans n = 6) fareleri. Zamanla, mdx vahşi farelerden daha az uzun asmak. B. Rotarod kez çalışan genç erkek mdx (n = 18, 4-10 hafta, n = 13, 11 ve 12 hafta, n = 10, 13 hafta arasında fark yoktu ) ve yabani tip sıçanlar (n = 6). Veriler ortalama ± st.dev olarak temsil edilmektedir.
Şekil 4. Dişi farelerde fonksiyonel performans ve iskelet kası patolojisi egzersiz protokolünü çalıştıran zorla koşu bandı etkisi. Kas patoloji kasıtlı oldufarenin 12 haftalık bir süre boyunca, 30 dakika boyunca 12 m / dk 'da yatay bir yürüme bandı üzerinde haftada üç kez çalışmasına izin şiddetlenir. Doğrudan çalıştırdıktan sonra, fareler iki bacak asılı test katılmak zorunda kaldı. Tüm yabani tip fareler (n = 5) izin verilen maksimum kadar asılı kalması, tüm mdx fare (n = 6) (p <0.001, ortalama ± st.dev olarak sunulan veriler.). B. varlığı daha önce tel kapalı düşerken Zar hasarının zarında gözyaşı ile kas liflerinin üzerinden sızıntı plazma kreatin kinaz (CK) düzeyleri ölçülerek belirlenmiştir. CK düzeyleri egzersiz öncesi vahşi tip farelere kıyasla mdx farelerde yükselmişti. Koşu bandı egzersiz hemen artmış düzeyleri (p <0.01, ortalama ± st.dev olarak sunuldu yıldız, veri. Belirtilir) yabani tip farelerde düşük kalmıştır. CD, mdx farelerde. Mdx farelerin kasları kötüleşmesi, egzersiz koşu bandı çok savunmasız Hastalık patolojisinin yaygın birürkiye'de çalışan bir kaç hafta. (D) yaygın fibrozis ve nekroz gelişmiştir mdx fare gösterisi icra 16 haftalık nonexercised (C) ve koşu bandı kuadriseps bu Hematoksilen ve Eosin boyamaları. Aynı çalışma protokolü geçiren vahşi tip farelere E. Kaslar etkilenmez. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 5,. Genetik arka plan etkisi fonksiyonel performans mdx fareler. Farkların fonksiyonel performans üzerine karışık arka plan etkisi. Bu göstermek için, erkek mdx (BL/10 arka plan, n = 18, 4-10 hafta, n = 13, 11 ve 12 çiş performansks, n = 10, 13 hafta), MDX (karışık BL/10, BL/6J, DBA2 ve 129OLA arka plan, n = 5) farenin zaman içinde karşılaştırılmıştır. önemli ölçüde, iki suş arasında farklılık A. iki uzantılı asılı test performansı. B. Dört uzuv asılı test sonuçları karma plan mdx farelerde biraz daha yüksektir. C. Rotarod çalışan kere de biraz suşları arasındaki farklılık. Ortalama ± st.dev olarak sunulan veriler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan işlevsel testler, yeniden üretilebilir, uygulaması kolay ve vahşi tip ve yaştan bağımsız distrofik fareler için de geçerlidir. Testler öncesi klinik kas fonksiyonu, gücü, durumu ve koordinasyonu değerlendirmek için yararlı araçlar sağlar. Hastalığın doğal seyri üzerinde bir bileşiğin etkilerini test ederken, girişimsel olmayan testler burada (ön ayakları kavrama gücü, hem asılı testleri ve rotarod testi) tarif güzel bu testler ardışık günlerde gerçekleştirilen bir işlevsel test rejiminde kombine edilebilir . Bu protokoller, MDX fareler için zararlı değildir ve uzunlamasına bir şekilde 10 olarak kullanılabilir. Bu testlerin her sonuçları yerine tek bir kas farklı veya kısmen örtüşen kas grupları tarafından oluşturulan akılda tutulmalıdır. Bu nedenle, birden testleri bir arada kullanarak daha eksiksiz bir resim elde etmek için önerilen ve deney işlevselliği de böylece daha iyi bir fikir olduğunumental grupları. Seçenek olarak ise, bir tek kas fonksiyonel gelişmeler kas fizyolojisi ölçümler 20 kullanılarak değerlendirilebilir.
Davranış testleri gibi, aynı zamanda fonksiyonel testler geniş farklı fareler arasındaki varyasyon, ya da farklı değerlendirmeler arasında bir fare içinde gösterebilir. Değişimini azaltmak için, tüm testler fareler aşina olan aynı deneyi tarafından yapılmalıdır. Oda kokuları ve sesleri gibi dış değişkenler, gün ve test gerçekleştirildiği haftanın günün zamanı mümkün olduğu kadar sabit tutulmalıdır. Fareler cinsiyet ve yaş eşleştirilmiş olmalıdır. Hastalığın ilerlemesini azdırmak için koşu bandı koşu kullanırken, tüm fareler eşit muamele edilir, böylece çalışan tüm parametreleri (çalışma süresi, hız ve eğim), bütün deney grupları için zamanla sabit tutulduğu standart bir protokol kullanmak esastır. Farelerin çoğunluğu fonksiyonel testler katılmaya istekli olan ve en çok hayvan yüksek göstermesine rağmenisteklilik düzeyleri, bazı fareler (öncelikle güçlü yabani tip fareler) bazen deney ve gösteri kaçınma davranışı yerine kaçının. Bu davranış için düzeltilmiş değil zaman, yanlış sonuçlar 21 çizilmiş olabilir. Neyse ki, bu davranış türleri yalnızca zaman zaman gözlenir ve tel ızgara veya totarod geri fare yerleştirerek, ya da kavrama gücü metre üzerinde başka bir zaman çekerek düzeltilebilir.
(Örneğin test değerlendirmek kas fonksiyonunu asılı) bir fonksiyonel test iyileştirmeler mutlaka başka bir testi (tek kas gücünü değerlendirmek ön ayakları kavrama gücü) iyileşmeler meydana işbirliği zorunda değildir. Mdx farelerde, kas fonksiyonu gelişmeler daha önce kas gücü daha ayırt edilebilir. Bu da 6 dakikalık yürüme testi klinik olarak anlamlı iyileşmeler kas gücü 6,7 iyileştirmeler ile cooccur yok klinik çalışmalarda katılan DMD hastalarında görülür. Bununla birlikte, bu maykısmen test edilen bileşiğin çalışma mekanizması bağlıdır ve diğer bileşikler gücü olup işlevini geliştirmek mümkündür. Bu nedenle, testlerin sonuçları akılda bileşiğin eylem mekanizması ile yorumlanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Onu fotoğraf yardım için Margriet Hulsker teşekkür ediyor ve onların çok yapıcı yorumlar için farelerin görüntüleri ve yorumcular elde yardımcı olmak istiyorum. Bu çalışma ZonMw, TEDAVİ-NMD (sözleşme numarası LSHM-CT-2006-036825) ve Duchenne Ortaklık Projesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse grip strength meter | Chatillon DFE (resold by Columbus Instruments) | # 80529 | |
| Hanging wire 2 limbs device | Cloth hanger or custom made device | ||
| Hanging wire 4 limbs device | Lid of rat cage or custom made device | ||
| Rotarod | Ugo Basil | # 47600 | |
| Treadmill for mice Exer 3/6 | Columbus Instruments | # 1055SRM |
References
- Blake, D. J., Weir, A., Newey, S. E., Davies, K. E. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9, 77-93 Forthcoming.
- Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A., Moore, K. J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81, 1189-1192 (1984).
- Bowles, D. E., et al. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Mol. Ther. 20, 443-455 (2012).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 Forthcoming.
- Goemans, N. M., et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 364, 1513-1522 (2011).
- Malik, V., et al. Gentamicin-induced readthrough of stop codons in Duchenne muscular dystrophy. Ann. Neurol. 67, 771-780 (2010).
- Skuk, D., et al. First test of a "high-density injection" protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscul. Disord. 17, 38-46 (2007).
- van Putten, M., et al. A 3 months mild functional test regime does not affect disease parameters in young mdx mice. Neuromuscul. Disord. 20, 273-280 (2010).
- De Luca, A., et al. Gentamicin treatment in exercised mdx mice: Identification of dystrophin-sensitive pathways and evaluation of efficacy in work-loaded dystrophic muscle. Neurobiol. Dis. 32, 243-253 (2008).
- Radley-Crabb, H., et al. A single 30min treadmill exercise session is suitable for 'proof-of concept studies' in adult mdx mice: A comparison of the early consequences of two different treadmill protocols. Neuromuscul. Disord. , (2011).
- van Putten, M., et al. The effects of low levels of dystrophin on mouse muscle function and pathology. PLoS.One. , (2012).
- Willmann, R., et al. Enhancing translation: Guidelines for standard pre-clinical experiments in mdx mice. Neuromuscul. Disord. 1, 43-49 (2011).
- Connolly, A. M., Keeling, R. M., Mehta, S., Pestronk, A., Sanes, J. R. Three mouse models of muscular dystrophy: the natural history of strength and fatigue in dystrophin-, dystrophin/utrophin-, and laminin alpha2-deficient mice. Neuromuscul. Disord. 11, 703-712 (2001).
- Rafael, J. A., Nitta, Y., Peters, J., Davies, K. E. Testing of SHIRPA, a mouse phenotypic assessment protocol on Dmd(mdx) and Dmd(mdx3cv) dystrophin-deficient mice. Mamm. Genome. 11, 725-728 (2000).
- Chapillon, P., Lalonde, R., Jones, N., Caston, J. Early development of synchronized walking on the rotorod in rats. Effects of training and handling. Behav. Brain Res. 93, 77-81 (1998).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Lerman, I., et al. Genetic variability in forced and voluntary endurance exercise performance in seven inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 92, 2245-2255 (2002).
- Sharp, P. S., Jee, H., Wells, D. J. Physiological characterization of muscle strength with variable levels of dystrophin restoration in mdx mice following local antisense therapy. Mol. Ther. 19, 165-171 (2011).
- Klein, S. M., et al. Noninvasive in vivo assessment of muscle impairment in the mdx mouse model--a comparison of two common wire hanging methods with two different results. J. Neurosci. Methods. 203, 292-297 (2012).
