Summary
يمكن فحوصات متعددة لتوفير المعلومات المفيدة الآليات الخلوية الأساسية والقضاء على النفايات من الكواشف والتجارب المتكررة التي لا داعي لها. نحن هنا وصف متعددة كاسباس 3/7 النشاط الفحص، وذلك باستخدام أساليب الفلورسنت والقائم على الانارة، لتحديد بقاء الخلية في نموذج طائي في المختبر التالية التحدي التأكسدي مع حمض البالمتيك.
Abstract
القدرة على معدد المقايسات في دراسات الآليات الخلوية المعقدة يلغي الحاجة لإجراء التجارب المتكررة، ويوفر الضوابط الداخلية، ويقلل من الهدر في التكاليف والكواشف. نحن هنا وصف تعظيم الاستفادة من مقايسة متعددة لتقييم موت الخلايا المبرمج التالية حمض البالمتيك (PA) التحدي في نموذج طائي في المختبر، وذلك باستخدام كل من الفلورسنت والانارة مقرها المقايسات لقياس عدد خلايا قابلة للحياة وكاسباس 3/7 النشاط في 96 جيدا تنسيق وحة microtiter. بعد التحدي السلطة الفلسطينية، تم تحديد خلايا قابلة للحياة من خلال فحص الفلورسنت القائم على ريسازورين. كان كاسباس 3/7 ثم تحديد النشاط باستخدام الركيزة luminogenic، DEVD، وتطبيع لعدد الخلايا. هذا الاختبار هو مضاعفة تقنية مفيدة لتحديد التغير في النشاط كاسباس بعد التحفيز أفكارك، مثل الأحماض الدهنية المشبعة التحدي. الأحماض الدهنية المشبعة السلطة الفلسطينية يمكن أن تزيد الاكسدة طائي وموت الخلايا المبرمج، مما يدل على إمكانية importaالامتحانات التنافسية الوطنية من المقايسات مثل التي وصفت هنا في دراسة العلاقة بين الأحماض الدهنية المشبعة وظيفة الخلايا العصبية.
Introduction
تم الوجبات الغذائية الغنية بالأحماض الدهنية المشبعة مثل حمض البالمتيك (PA) ترتبط السمنة والأمراض المصاحبة الأخرى، بما في ذلك أمراض القلب والشرايين والسكري 1 و 2. وقد تبين أيضا الوجبات الغذائية عالية الدهون لزيادة الاكسدة، موت الخلايا المبرمج، وتنكس الخلايا العصبية في منطقة ما تحت المهاد، وهو منظم المهم الشهية والطاقة النفقات 3-7. فهم الآلية التي من خلالها التعرض حمية عالية الدهون يؤدي التقلبات طائي بالتالي، من المهم لتطوير علاجات الدوائية للسمنة. ومع ذلك، فإن الآليات الخلوية من خلالها الدهون الغذائية يؤثر على وظيفة الخلايا العصبية تظل غير واضحة. فهم أفضل لكيفية الدهون مثل السلطة الفلسطينية قد تؤدي ظهور مسارات أفكارك طائي هو خطوة أولى ضرورية نحو هذا الهدف. الهدف من هذه المقالة هو لوصف مقايسة متعددة في المختبر لاختبار استجابة الخلايا العصبية للتعرض للسلطة الفلسطينية، وضعت لاستخدامها في دراسات حتنكس عصبي ypothalamic. نحن نقدم وصفا مفصلا ل96 جيدا شكل فحص في المختبر متعددة لقياس كاسباس 3/7 النشاط في العدد الكلي للخلايا في خلد الماوس الكبار خط متباينة طائي الخلية (المعين A12) بعد التحدي التأكسدي مع السلطة الفلسطينية 8.
لفترة وجيزة، ويتحدد بقاء الخلية التالية تحديا للسلطة الفلسطينية عن طريق فحص ريسازورين القائمة. ريسازورين هو مركب نفاذية الخلية التي يخضع الحد الأنزيمية في خلايا نشطة أيضي، وهي عملية يعتقد أن تحدث عن طريق الميتوكوندريا 9. تحويل خلايا قابلة للحياة باستمرار ريسازورين لresorufin، وتنتج إشارة الفلورسنت يتناسب مع عدد من خلايا قابلة للحياة. ثم يتم تحليل النشاط كاسباس 3/7 باستخدام مقايسة lumogenic مقرها DEVD. DEVD هو تسلسل الأحماض الأمينية (آسيا والمحيط الهادئ، غلو، فال ASP) المشقوق من قبل كاسباس 3. عندما يقترن هذا التسلسل إلى مادة lumogenic، على تفعيل الخلايا كاسباس 3/7 والانقسام اللاحقةمن DEVD الركيزة، يتم تحريرها المنتج الانارة. هذا رد فعل يتناسب مع النشاط كاسباس وبالتالي إلى استحثاث موت الخلايا المبرمج. كما الخلايا الميتة لا يمكن ان تنتج كاسباس، كاسباس 3/7 النشاط هي عابرة الطبيعة؛ ولذلك ينبغي أن يكتمل تحليل ما بين 30 دقيقة إلى 4 ساعات بعد التحدي، وهذا يتوقف على فعالية الضغوطات الخلية. بقاء الخلية يتناسب عكسيا مع نشاط كاسباس 3/7، ويمكن استخدامها لتحديد آليات موت الخلايا. على سبيل المثال، قد سبق استخدام هذا الأسلوب لإظهار أن المعالجة مع هرمون الببتيد أوريكسين يقلل موت الخلايا المبرمج في الخلايا طائي تحدى مع بيروكسيد الهيدروجين، مما يوحي بأن آليات تتأثر بهذا العلاج مهما في حماية ضد الضرر التأكسدي 10. من المهم أن نلاحظ هذه المقايسات والخط والتي تعتمد على الخلايا والأنسجة، كما أنها تعتمد على النشاط الميتوكوندريا للحد من الكواشف مقايسة. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للماوس الكبار طائي (A12) الخلايا؛ ومع ذلك،يجوز تغيير الأساليب المذكورة لتدخل ضمن نطاق البحوث مماثلة.
المقايسات المتنوعة من ثقافة واحدة ويوفر أيضا ميزة على الطريقة التقليدية في أداء فحوصات فردية لعدة أسباب. بالإضافة إلى توفير الوقت وعينات الخلايا، والكواشف والثقافة، ويمكن أيضا تقديم المقايسات مضاعفة المعرفة من بقاء الخلية والوفاة، وتوفير الضوابط الداخلية، والقضاء على الحاجة لإجراء التجارب المتكررة 11، 12.
وقد اعتمدت أساليب بديلة على البقع أو ELISAs الغربية، والتي هي فحوصات موثوق بها، ولكنها مكلفة وتستغرق وقتا طويلا (1-2 أيام)، وخاصة عند استخدام تنسيق 96 جيدا. باستثناء الوقت الذي يستغرقه لخلايا الثقافة للمقايسة مضاعفة، مرة إجمالية تبلغ أقل من 3 ساعة. في حين تم تحسين هذا البروتوكول للاستخدام مع A12 الخلايا، فإنه يجوز تغيير لاستخدامها في نماذج أخرى مع الحفاظ في الاعتبار العوامل التي قد تؤثر على سلامة الخلية. ردعإذا التعدين هذا البروتوكول سيعمل على سلسلة من التجارب يتوقف على عدد من العينات أو الظروف التجريبية والتجارب على المصب المخطط لها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الطلاء والصيانة الثقافة الخليوي
- الدافئة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) سائل الإعلام والثقافة (DMEM + 10٪ FBS + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين / نيومايسين) إلى 37 درجة مئوية.
- الحصول على الأسهم من A12 الخلايا المجمدة من -80 درجة مئوية.
- بسرعة ذوبان الجليد الخلايا في 37 درجة مئوية حمام الماء؛ مرة واحدة إذابة، بلطف خلايا ماصة لنقل إلى 75 سم 2 تنفيس قارورة الثقافة وإضافة 10 مل من وسائل الإعلام الثقافة.
- احتضان بين عشية وضحاها في قارورة 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. بعد نضح وسائل الإعلام على مدار 24 ساعة واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة. تستمر الخلايا المتنامية حتى يتم الحصول على 70-80٪ التقاء (النمو 2-3 أيام).
2. العد وطلاء الخلايا
- DMEM الدافئة و 1X-التربسين EDTA-حل ل37 درجة مئوية.
- وسائل الإعلام نضح من الخلايا ويغسل مرتين مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS).
- إضافة 500 ميكرولتر من محلول التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة.
- فصلالخلايا من القارورة باستخدام مكشطة وتعليق الخلايا في 5 مل من وسائل الإعلام. تمر الخلايا من خلال مصفاة ويمر عبر مصفاة الخلية في أنبوب 50 مل نظيفة. قد تحتاج لتمرير الخلايا من خلال مصفاة أكثر من مرة، ولكن لا تكرر أكثر من ثلاث مرات.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات لتحديد كمية الخلايا لثقافة البذور 6،000 خلية / جيدا في قاع أسود أو أبيض لوحة الجدران 96 جيدا واضحة في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام. احتضان لوحة في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
3. تحديد الجدوى الخليوي وكاسباس 3/7 آخر
- نقل السلطة إلى معقمة 5 مل قارورة زجاجية وذوبان في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تمييع الأسهم PA 01:10 حل في DMSO وإضافته إلى prewarmed DMEM للحصول على تركيز العمل النهائية من 0.1 ملي السلطة الفلسطينية. لوسائل الإعلام السيطرة، إضافة نفس تركيز DMSO التي يتم إضافتها إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على السلطة الفلسطينية.
- إزالة وسائل الإعلام في كل بئر واستبدالها مع وسائل الإعلام 50 ميكرولتر + / -السلطة الفلسطينية. احتضان لوحة لمدة 2 ساعة في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. ثم إضافة 5 ميكرولتر كاشف ريسازورين واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام قارئ المتعدد صفيحة ميكروسكوبية، سجل مضان (560 EX / 590 م) لقياس بقاء الخلية. يتم عرض النتائج وحدات مضان النسبي (RFU).
- لنفس لوحة، وإضافة 55 ميكرولتر من كاشف كاسباس ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
- مرة أخرى باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية، سجل التلألؤ لقياس النشاط كاسباس 3/7. يتم عرض النتائج وحدات التلألؤ النسبي (RLU)، مع التلألؤ يتناسب طرديا مع كاسباس 3/7 النشاط.
- لتطبيع النشاط كاسباس 3/7 إلى عدد خلايا، وتقسيم الخلية الجدوى (RFU) من خلال كاسباس 3/7 النشاط (RLU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول أعلاه توضح النتائج في مضاعفة تحليلين منفصلين لتحديد آليات موت الخلايا. الشكل 1 يبين لمحة عامة عن بروتوكول لتحديد بقاء الخلية وكاسباس 3/7 النشاط. وزيادة النشاط بشكل ملحوظ كاسباس في الخلايا تحدى مع السلطة الفلسطينية بعد 2 ساعة الحضانة (الشكل 2A والجدول 1). فقدان النزاهة غشاء الخلية هو تغيير المورفولوجية المرتبطة استحثاث موت الخلايا المبرمج، وهي واضحة في الخلايا بعد التعرض 2 ساعة إلى السلطة الفلسطينية (الشكل 2B). الشكل 3 يحدد مسار المحتملة التي PA يستحث موت الخلايا المبرمج ويدل على أهمية تحسين الحضانة الوقت في كاشف DEVD.
الشكل 1. تصميم التجريبية لفحص متعددلتحديد النشاط كاسباس 3/7. هي المصنفة الخلايا في لوحة 96 جيدا لمدة 24 ساعة ثم حضنت في وجود أو عدم وجود السلطة الفلسطينية. قد تختلف أوقات الحضانة في وجود كل كاشف اعتمادا على نموذج. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
وزيادة النشاط الشكل 2. كاسباس 3/7 بعد 2 ساعة التحدي السلطة الفلسطينية، وعولجوا طائية A12 الخلايا في وجود أو عدم وجود 0.1 ملي السلطة الفلسطينية لمدة 2 ساعة. وزيادة النشاط كاسباس 3/7 بشكل كبير في الخلايا تعامل مع السلطة الفلسطينية (ع <0.01). يتم فقدان الخلية سلامة الغشاء واضح في وجود السلطة الفلسطينية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. 
الرقم 3. الطريق المحتملة لموت الخلايا الناجم عن السلطة الفلسطينية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
| مراقبة | 0.1 ملي السلطة الفلسطينية | ||||
| خلايا قابلة للحياة | كاسباس 3/7 | نسبة | خلايا قابلة للحياة | كاسباس 3/7 | نسبة |
| مضان (560 EX / 590 م) | التلألؤ 650 نانومتر الذروة | كاسباس / خلايا قابلة للحياة | مضان (560 EX / 590 م) | التلألؤ 650 نانومتر الذروة | كاسباس / C قابلة للحياةأذرع |
| 1951.8 | 45.488 | 0.023305667 | 808.78 | 16.731 | 0.020686713 |
| 1647.0 | 46.011 | 0.027936248 | 788.84 | 22.080 | 0.027990467 |
| 1911.0 | 34.508 | 0.018057561 | 777.68 | 28.234 | 0.036305421 |
| 1792.5 | 14.183 | 0.007912413 | 807.45 | 20.457 | 0.025335315 |
| 1965.7 | 19.868 | 0.010107341 | 829.14 | 17.777 | 0.021440288 |
| 1803.0 | 20.229 | 0.011219634 | 742.35 | 29.280 | 0.039442312 |
| 1804.8 | 27.188 | 0.015064273 | 761.77 | 17.777 | 0.023336440 |
| 1890.1 | 40،7825 | 0.021576901 | 756.66 | 20.914 | 0.027639891 |
الجدول 1. مثال على البيانات التي تم جمعها ونسب محسوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مقايسة متعددة هي تقنية مقبولة تماما التي تم استخدامها من قبل العلماء في العديد من التطبيقات مثل PCR ميكروأرس، مناعي، وغيرها من وسائل الكشف عن البروتين على أساس 13 و 14. في الآونة الأخيرة، وأصبحت تستخدم بشكل متزايد المقايسات مضاعفة في التجارب في المختبر القائم على لوحة ولقد تم التحقق من صحة باعتبارها طريقة دقيقة لتقييم سمية الخلايا وقدرتها على البقاء 12. في البروتوكول أعلاه، علينا أن نظهر فعالية مضاعفة الفلورسنت والانارة فحوصات لتحديد النشاط كاسباس 3/7 وبقاء الخلية في الخلايا A12 التالية تحدي السلطة الفلسطينية. تقرر بقاء الخلية في غضون 10 دقيقة من الإهانة الأولي للسلطة الفلسطينية، والسماح لتمثيل سريعة وموثوق بها خلايا قابلة للحياة. تجدر الإشارة إلى أن كاشف القائم على rezasurin هو فحص الخلية الحية التي تسمح لمزيد من النهاية إلى أن يقاس؛ ومع ذلك، وتحسين فترة حضانة لتحديد النشاط كاسباس 3/7 هو ضروريهل للحصول على نتائج قابلة للاستخدام 15.
موت الخلايا المبرمج يمكن تفعيلها من خلال التحفيز الخارجي، وإشارات الخلية الداخلية، والمستقبلات السطحية مما يؤدي إلى الأحداث المورفولوجية والبيوكيميائية متميزة. زيادة كاسباس 3 النشاط، تجزئة الحمض النووي، وفقدان الخلية سلامة الغشاء، والتكثيف لونين، وبولي (ADP-الريبوز) البلمرة (PARP) انشقاق بعض علامات محددة من الخلايا التي يمكن أن يتم التحقيق 16. تفعيل كاسباس 3 و 7 جهري الرئيسي لموت الخلايا المبرمج، مما يجعلها علامات أساسية لتقييم في التلاعب الدوائية تهدف إلى الحد من الأضرار أفكارك 17. والخلايا التي تمر موت الخلايا المبرمج لفترات طويلة في نهاية المطاف الخضوع نخر الثانوية، يمكن ملاحظتها بواسطة تحلل الخلية، مما يؤكد على أهمية اختيار إطار زمني مناسب لتحديد كاسباس 3/7 النشاط 11. كما ذكر سابقا، كاسباس 3/7 النشاط هو عابر؛ لذا، اعتمادا على فعالية الضغوطات الخلية، وتحديد اله التوقيت المناسب لفحص النشاط كاسباس يمكن أن يستغرق بعض الجهد. بالإضافة إلى ذلك، فإن القيود الرئيسية لبروتوكول المتنوعة لدينا هي أن النشاط كاسباس 3/7 يمكن تحديدها ولكن ليس كميا، والمحللة الناتجة لا يمكن أن تستخدم لفحوصات المصب (أي البقع الغربية أو التعبير الجيني).
فهم خصائص دورة الخلية من النموذج المختار، وكيف أنها قد تستجيب لضغوطات معينة عند تطبيق هذه التقنية أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج صحيحة. اعتبارات إضافية عند التخطيط الدراسات التي من شأنها تقييم مسارات أفكارك هي: 1) تحديد كثافة مناسبة من الخلايا التي يتم المصنفة لكل بئر؛ 2) التركيز والحضانة من الضغوطات أو المخدرات المستخدمة؛ و 3) فترة حضانة مناسبة لالكواشف المستخدمة في الفحص. فإن الافتقار إلى التوحيد أو من الدراسات الأولية التي تعالج هذه الاعتبارات تؤدي عموما في بيانات خاطئة. الوقت والجهد المستخدمة لتوحيد اله مضاعفة فحص وصفنا هنا يوفر تقنية قيمة وموثوق بها، وتوفير الوقت للدراسات أفكارك 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم الصراعات في الكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل الموصوف هنا من قبل وزارة الخارجية الامريكية لشؤون المحاربين القدامى مختبر أبحاث الطب الحيوي والتنمية BX001686-1A1 وVA بحوث التأهيل والتنمية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
- Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
- Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
- Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
- Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
- Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
- Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
- Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
