Summary
Multiplex analyser kan give gavnlig information for basale cellulære mekanismer og eliminere spild af reagenser og unødvendige gentagne eksperimenter. Vi beskriver her en multiplex caspase-3/7 aktivitet assay anvendelse af fluorescerende-og luminescerende-baserede metoder, for at bestemme cellelevedygtighed i en in vitro hypothalamus model efter oxidativ udfordring med palmitinsyre.
Abstract
Evnen til multiplex assays undersøgelser af komplekse cellulære mekanismer eliminerer behovet for gentagne eksperimenter giver interne kontroller, og mindsker spild omkostninger og reagenser. Her beskrives optimering af et multipleks assay til at vurdere apoptose efter en palmitinsyre (PA) udfordring i en in vitro hypothalamus model, ved hjælp af både fluorescerende og luminescerende assays til at måle levedygtige celletal og caspase-3/7 aktivitet i en 96-brønds mikrotiterpladeformat. Efter PA udfordring blev levedygtige celler bestemmes ved en resazurin-baserede fluorescerende assay. Caspase-3/7 aktivitet blev derefter bestemt ved hjælp af en luminogene substrat, DEVD og normaliseret til celle nummer. Denne multiplexing analyse er en nyttig teknik til at bestemme ændringer i caspaseaktivitet efter en apoptotisk stimulus, såsom mættet fedtsyre udfordring. Den mættede fedtsyre PA kan øge hypothalamus oxidativt stress og apoptose, der angiver den mulige indførselnce af assays, såsom den der er beskrevet her i at studere forholdet mellem mættede fedtsyrer og neuronal funktion.
Introduction
Kost rig på mættede fedtsyrer, såsom palmitinsyre (PA) har været knyttet til fedme og andre følgesygdomme, herunder hjerte-kar-sygdomme og diabetes 1, 2. Højt fedtindhold har også vist sig at øge oxidativ stress, apoptose og neuronal degeneration i hypothalamus, en vigtig regulator af appetit og energiforbrug 3-7. Er derfor vigtig for udviklingen af farmakologiske behandlinger for fedme Forstå den mekanisme, hvorigennem højt fedtindhold kost eksponering inducerer hypothalamus dysregulering. Men de cellulære mekanismer, hvorigennem fedt påvirker neuronal funktion er fortsat uklare. En bedre forståelse af, hvordan fedtstoffer, såsom PA kan udløse udbrud af hypothalamus apoptotiske veje er et nødvendigt første skridt hen imod dette mål. Målet med denne artikel er at beskrive en multiplex assay for in vitro-test af neuronal respons på PA eksponering, udviklet til brug i studier af hypothalamic neurodegeneration. Vi giver en detaljeret beskrivelse af en in vitro 96-brønds format multiplex assay til måling af caspase 3/7 aktivitet pr samlede antal celler i en differentieret udødeliggjort voksen mus hypothalamus cellelinje (betegnet A12) efter oxidativ udfordring med PA 8.
Kort fortalt cellelevedygtighed bestemt efter PA udfordring via en resazurin assay. Resazurin er en celle-permeable forbindelse, der undergår enzymatisk reduktion af metabolisk aktive celler, en fremgangsmåde tænkt ske via mitokondrierne 9. Levedygtige celler kontinuerligt konvertere resazurin til resorufin, der producerer et fluorescerende signal proportionalt med antallet af levedygtige celler. Caspase-3/7 aktivitet analyseres derefter ved hjælp af en DEVD-baserede lumogenic assay. DEVD er en aminosyresekvens (Asp-Glu-Val-Asp) spaltes af caspase-3. Når denne sekvens er koblet til en lumogenic stof ved aktivering af intracellulær caspase-3/7 og efterfølgende spaltningaf DEVD substrat, det luminescerende produkt frigivet. Denne reaktion er proportional med caspaseaktivitet og dermed til induktion af apoptose. Da døde celler ikke kan producere caspase, caspase-3/7 aktivitet er af natur forbigående; analyse derfor skal udfyldes mellem 30 min til 4 timer efter udfordring, afhængigt af effektiviteten af celle stressor. Cellelevedygtighed er omvendt proportional med caspase-3/7 aktivitet og kan anvendes til at bestemme mekanismer for celledød. For eksempel har denne metode tidligere blevet anvendt til at vise, at forbehandling med peptid hormon orexin nedsætter apoptose i hypothalamus celler udfordret med hydrogenperoxid, hvilket tyder på, at mekanismer, der er ramt af denne behandling er vigtige i at beskytte mod oxidativ skade 10. Det er vigtigt at bemærke disse assays er cellelinie-og vævs-afhængig, da de afhængige mitokondriel aktivitet at reducere assayreagenser. Denne protokol er optimeret til voksen mus hypothalamus (A12) celler; imidlertidbeskrevne fremgangsmåder kan ændres til at passe inden for rammerne af tilsvarende forskning.
Multiplexing assays fra en enkelt kultur og giver en fordel i forhold til den traditionelle metode til udførelse af individuelle analyser af flere grunde. Ud over at spare tid, celleprøver og kultur reagenser kan multiplexing assays også give viden af cellernes overlevelse og død, giver den interne kontrol, og fjerne behovet for gentagne forsøg 11, 12.
Alternative metoder har påberåbt Western blots eller ELISA'er, som er pålidelige analyser, men er dyre og tidskrævende (1-2 dage), især ved anvendelse af en 96-brønds format. Fradrag af den tid, det tager at dyrke celler til multiplexing assay samlede tid er mindre end 3 timer. Mens dette protokol er blevet optimeret til brug med A12-celler, kan det ændres til brug i andre modeller samtidig huske faktorer, der kan påvirke celle integritet. Determinedrift Hvis denne protokol ville arbejde for en række forsøg, afhænger af antallet af prøver eller eksperimentelle betingelser, og om planlagte downstream eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Plating og vedligeholdelse af Cell Culture
- Varm Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kulturmedium (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin / Neomycin) til 37 ° C.
- Opnå lager af frosne A12 celler fra -80 ° C.
- Hurtigt optø cellerne i 37 ° C vandbad; Optøede, forsigtigt pipette celler til at overføre til en 75 cm 2 ventileret kultur kolbe og tilsættes 10 ml af dyrkningsmedier.
- Inkuber kolbe natten over i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Aspirer medier efter 24 timer og erstatte med friske medier. Fortsæt voksende celler til 70-80% konfluens opnås (2-3 dages vækst).
2. Optælling og Plating Cells
- Varm DMEM og 1x-trypsin-EDTA-opløsning til 37 ° C.
- Aspirer medier fra cellerne og vaskes to gange med sterilt phosphatbufret saltvand (PBS).
- Tilsæt 500 pi trypsinopløsning og inkuberes ved 37 ° C i 2-5 min.
- Frigørceller fra kolben ved hjælp af en skraber og suspendere celler i 5 ml medier. Pass celler gennem si og passere gennem celle si i et rent 50 ml rør. Kan være nødvendigt at passere celler gennem si mere end én gang, men ikke gentage mere end tre gange.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer at bestemme mængden af celler til kulturen til frø 6.000 celler / brønd i en 96-brønds klar bund sort eller hvid walled pladen i et slutvolumen på 100 pi medier. Inkubér pladen i 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
3.. Bestemmelse Cell levedygtighed og Caspase-3/7 Activity
- Overførsel PA til en steril 5 ml hætteglas og opløse i 100% dimethylsulfoxid (DMSO). Lager PA løsning fortyndet 1:10 i DMSO og føje den til forvarmet DMEM at opnå en endelig arbejdsgruppe koncentration på 0,1 mM PA. Af kontrolhensyn medier, tilsæt den samme koncentration af DMSO, der føjes til medier indeholdende PA.
- Fjern mediet i hver brønd og erstatte med 50 gl medier + / -PA. Inkubér pladen i 2 timer i 5% CO2 ved 37 ° C. Derpå tilsættes 5 ul resazurin reagens og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Ved hjælp af en multimode mikropladelæser, registrere fluorescens (560 EX / 590 EM) til at måle cellelevedygtighed. Resultaterne er vist som relative fluorescensenheder (RFU).
- Til den samme plade, tilsættes 55 pi caspase reagens og inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer.
- Igen ved hjælp af mikropladelæser, optage luminescens at måle caspase-3/7 aktivitet. Resultaterne er vist som relative luminescence units (RLU), med luminescens direkte proportional med caspase-3/7 aktivitet.
- At normalisere caspase-3/7 aktivitet celletal, dividere celle levedygtighed (RFU) ved caspase-3/7 aktivitet (RLU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen Ovenstående beskriver resultater i multiplexing to separate analyser for at fastslå mekanismer for celledød. Figur 1 viser en oversigt over protokollen til at bestemme cellernes levedygtighed og caspase-3/7 aktivitet. Caspaseaktivitet var signifikant forøget i celler udfordret med PA efter 2 timers inkubation (figur 2A og tabel 1). Tab af cellemembranens integritet er en morfologisk ændring der er associeret med induktion af apoptose, som er tydelig i celler efter 2 timers udsættelse PA (figur 2B). Figur 3 skitserer den potentielle vej, hvor PA inducerer apoptose og viser betydningen af at optimere inkubationstid tid i DEVD reagens.
Figur 1.. Experimental design for en multiplex assayat bestemme caspase-3/7 aktivitet. Cellerne udsås i en 96-brønds plade i 24 timer og derefter inkuberet i nærvær eller fravær af PA. Inkubationstider i nærværelse af hvert reagens kan variere afhængigt af modellen. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Caspase-3/7 aktivitet er øget efter 2 timer PA udfordring. Hypothalamus A12-celler blev behandlet i nærvær eller fravær af 0,1 mM PA i 2 timer. Caspase-3/7 aktivitet blev signifikant forøget i celler behandlet med PA (p <0,01). Cellemembranen integritet synligt tabt i overværelse af PA. Klik her for at se større billede. 
Figur 3.. Potentiel vej for PA celledød. Klik her for at se større billede.
| Kontrol | 0,1 mM PA | ||||
| Levedygtige celler | Caspase 3/7 | forholdet | Levedygtige celler | Caspase 3/7 | forholdet |
| Fluorescens (560 EX / 590 EM) | Luminescens 650 nm peak | Caspase / levedygtige celler | Fluorescens (560 EX / 590 EM) | Luminescens 650 nm peak | Caspase / levedygtig Cells |
| 1951,8 | 45,488 | 0,023305667 | 808,78 | 16,731 | 0,020686713 |
| 1647,0 | 46,011 | 0,027936248 | 788,84 | 22.080 | 0,027990467 |
| 1911,0 | 34,508 | 0,018057561 | 777,68 | 28,234 | 0,036305421 |
| 1792,5 | 14,183 | 0,007912413 | 807,45 | 20,457 | 0,025335315 |
| 1965,7 | 19,868 | 0,010107341 | 829,14 | 17,777 | 0,021440288 |
| 1803,0 | 20,229 | 0,011219634 | 742,35 | 29,280 | 0,039442312 |
| 1804,8 | 27,188 | 0,015064273 | 761,77 | 17,777 | 0,023336440 |
| 1890,1 | 40,7825 | 0,021576901 | 756,66 | 20,914 | 0,027639891 |
Tabel 1.. Eksempel på indsamlede data og beregnede nøgletal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multiplex analyse er et godt accepteret teknik, der er blevet brugt af forskere i talrige applikationer såsom PCR microarrays, immundetektion og andre protein-baserede metoder til påvisning 13, 14. For nylig har multiplexing assays blevet stadig mere anvendt i in vitro plade-baserede eksperimenter og er blevet valideret som en præcis metode til vurdering af cytotoksicitet og levedygtighed 12.. I ovenstående protokol, vi demonstrere effektiviteten af multiplexing fluorescerende og selvlysende analyser for at fastslå caspase-3/7 aktivitet og levedygtighed celle i A12 celler efter PA udfordring. Cellelevedygtighed blev bestemt inden for 10 min af initial PA fornærmelse, giver mulighed for en hurtig og pålidelig repræsentation af levedygtige celler. Det skal bemærkes, at rezasurin reagent er en levende celle assay, der giver mulighed for yderligere endepunkter, der skal måles; dog optimere inkubationstid til at bestemme caspase-3/7 aktivitet er essential for at opnå brugbare resultater 15.
Apoptose kan aktiveres af eksterne stimulationer, interne celle signaler, og overflade-receptorer resulterer i forskellige morfologiske og biokemiske begivenheder. Øget caspase 3 aktivitet, DNA-fragmentering, tab af cellemembranens integritet, chromatinkondensering og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltning er nogle specifikke markører for apoptose, der kan undersøges 16. Aktivering af caspase 3 og 7 er de primære modulatorer af apoptose, hvilket gør dem vigtige markører for at vurdere farmakologiske manipulationer til formål at reducere apoptotisk skade 17.. Celler, der gennemgår langvarig apoptose i sidste ende vil gennemgå sekundær nekrose, ses af cellelysis, hvilket understreger betydningen af at vælge en passende tidsramme til at bestemme caspase-3/7 aktivitet 11. Som tidligere nævnt, caspase-3/7 aktivitet er forbigående; Derfor, afhængigt af effektiviteten af celle stressor, bestemme the passende timing til analyse caspaseaktivitet kan tage nogle indsats. Endvidere er de vigtigste begrænsninger for vores multiplexing protokollen er, at caspase-3/7 aktivitet kan bestemmes, men ikke kvantificeret, og det resulterende lysat kan ikke anvendes til efterfølgende assays (dvs. Western blots eller genekspression).
Forståelse egenskaber af cellecyklus af den valgte model, og hvordan den kan reagere på udpegede stressfaktorer ved anvendelsen af denne teknik er kritisk for at opnå gyldige resultater. Yderligere overvejelser ved planlægning af undersøgelser, der vil evaluere apoptotiske veje er: 1) at fastsætte en passende tæthed af celler, der er podet pr godt; 2) koncentration og inkubation af stressor eller stof, der anvendes; og 3) passende inkubationstid for de reagenser, der anvendes i et assay. Den manglende standardisering eller forundersøgelser, som tager disse overvejelser vil generelt resultere i fejlagtige data. Den tid og kræfter bruges til at standardisere the multiplexing assay vi beskriver her giver en værdifuld, pålidelig og tidsbesparende teknik til apoptotiske undersøgelser 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Den her beskrevne arbejde blev finansieret af det amerikanske Department of Veterans Affairs Biomedicinsk Laboratorium Forskning og Udvikling BX001686-1A1 og VA Rehabilitering forskning og udvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
- Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
- Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
- Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
- Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
- Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
- Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
- Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
