Summary
Multiplex deneyleri temel hücresel mekanizmaların için yararlı bilgi sağlamak ve reaktifler ve gereksiz tekrarlı deneyler atık ortadan kaldırabilir. Biz, palmitik asit ile oksidatif karşılaştırmadan sonra, bir in vitro modelde hipotalamik hücre yaşayabilirliğini belirlemek için, flüoresan ve ışıldayan dayalı yöntemler kullanılarak, burada çok katlı bir kaspaz-3/7 aktivite deneyi tarif eder.
Abstract
Kompleks hücresel mekanizmalar çalışmalarda tahlilleri multiplex yeteneği, tekrarlanan deneyler için olan ihtiyacı ortadan kaldırır iç kontrol sağlar ve maliyet ve reaktifler de atık azalır. Burada, 96 oyuklu bir viyabl hücre sayılarını ve kaspaz-3/7 aktivitesini ölçmek için, esaslı tahliller flüoresan ve ışıldayan her ikisini de kullanarak, bir in vitro modelde hipotalamik bir palmitik asit (PA) meydan aşağıdaki apoptoz değerlendirmek için çok katlı bir tahlilin optimizasyonu tanımlamak Mikrotitre plaka biçimi. PA mücadeleden sonra, canlı hücreler, resazurin tabanlı bir floresan deneyi ile belirlenmiştir. Caspase-3/7 aktivitesi, alt tabaka luminogenic, DEVD ve hücre sayısına normalleştirildi kullanılarak belirlendi daha sonra. Bu birkaç katlı deney, doymuş yağlı asit meydan okuma olarak bir apoptotik uyarıcı, aşağıdaki kaspaz aktivitesi değişikliği belirlemek için yararlı bir teknik olduğunu. Doymuş yağ asidi PA potansiyel importa gösteren, hipotalamik oksidatif stres ve apoptoz artırabilirörneğin bu gibi deneylerin nce doymuş yağlı asitlere ve nöronal fonksiyonu arasındaki ilişkiyi inceleyerek burada tarif.
Introduction
Palmitik asit (PA) gibi doymuş yağ asitleri zengin diyet obezite ve kalp-damar hastalıkları ve diyabet, 1, 2 dahil olmak üzere diğer eşlik eden durumlar ile bağlantılı olmuştur. Yüksek yağlı diyetler de oksidatif stres, apoptosis ve hipotalamusta nöronal dejenerasyon, iştah ve enerji harcaması 3-7 arasında önemli bir düzenleyici geliştirmek için gösterilmiştir. Yüksek yağlı diyet maruz hipotalamik bozulmasına neden mekanizması üzerine anlama obezite için farmakolojik tedavilerin geliştirilmesi için oldukça önemlidir. Ancak, diyet yağ nöronal fonksiyonu etkiler hangi aracılığıyla hücresel mekanizmalar belirsizdir. PA gibi yağlar hipotalamus apoptotik yolun başlangıcı tetikleyebilir nasıl daha iyi anlaşılması, bu amaç doğrultusunda gerekli bir ilk adımdır. Bu makalenin amacı saat çalışmalarında kullanılmak üzere geliştirilmiş PA maruz nöronal yanıtın in vitro test etmek için çok katlı bir tahlil, tanımlamaktırypothalamic nörodejenerasyon. Biz, PA 8 ile oksidatif cebine (A12 olarak adlandırılır), bir farklılaştırılmış ölümsüzleşmiş yetişkin fare hücre hattı, hipotalamik bir hücre toplam sayısı başına 3/7 kaspaz aktivitesi ölçmek için bir in vitro 96 oyuklu tahlil formatı multipleks ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır.
Kısaca, hücre canlılığı, bir resazurin bazlı deney ile PA meydan sonra belirlenir. Resazurin, metabolik olarak aktif hücrelerin enzimatik indirgeme işlemine tabi tutulurlar hücre geçirgen bileşiktir düşünce bir işlem olup, mitokondri 9 yoluyla oluştuğu. Canlı hücreler sürekli olarak canlı hücre sayısı ile orantılı bir floresan sinyali üreten, resorufine Resazurin dönüştürün. Caspase-3/7 aktivitesi daha sonra bir DEVD-tabanlı lumogenic deneyi kullanılarak analiz edilir. DEVD kaspaz-3 parçalanabilen bir amino asit sekansı (Glu-Asp-Val-Asp) 'dir. Bu dizi hücre içi kaspaz-3/7 aktivasyonu ve daha sonra yarılma üzerine, bir lumogenic maddeye bağlanmış olduğundaDEVD substrat, lüminesan ürün serbest bırakılır. Bu reaksiyon, kaspaz aktivitesi ve böylece apoptoz endüksiyonu ile orantılıdır. Ölü hücreleri kaspaz üretemediği gibi, kaspaz-3/7 etkinlik doğa geçici gereğidir; Bu nedenle analiz hücre stres etkinliği bağlı olarak, 4 saat sonrası meydan 30 dakika arasında tamamlanmalıdır. Hücre canlılığı, kaspaz-3/7 aktivitesi ile ters orantılıdır ve hücre ölümü mekanizmasını belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, bu yöntem daha önce oreksin bu muamele ile etkilenmez mekanizmaları 10 oksidatif hasara karşı korumada önemli olduğunu düşündürmektedir, hidrojen peroksit ile meydan hipotalamik hücrelerde apoptosisi azaltan peptid hormon ile ön işleme tabi tutulmasının göstermek için kullanılmıştır. Bu deney, bu reaktif maddeleri azaltmak için mitokondriyal aktivite güvenmek olarak, bu deneyler, hücre çizgisi ve doku-bağımlı dikkat etmek önemlidir. Bu protokol, yetişkin fare hipotalo (A12) hücreleri için optimize edilmiştir; Bununla birlikte,Tarif edilen yöntemler, benzer araştırma kapsamında uyacak şekilde değiştirilebilir.
Tek bir kültürden çoklayıcı tahlilleri iyi çeşitli nedenlerle bireysel analizler yapmanın geleneksel yöntem üzerinde bir avantaj sağlar. Zaman, hücre örnekleri ve kültür reaktifler tasarrufu yanı sıra, çoğullama tahliller, aynı zamanda, hücre hayatta kalma ve ölüm bilgi sağlamak iç kontrol sağlar ve tekrarlanan deneylerde 11, 12 için olan ihtiyacı ortadan kaldırabilir.
Alternatif yöntemler, 96 oyuklu bir format kullanılarak, özellikle güvenilir olan deneyler, Western lekeler ya da ELISAlar, güvenerek, ama pahalı ve zaman alıcı (1-2 gün) olan var. Bu çoklayıcı tahlil için kültür hücreleri için gereken süre hariç, toplam süresi en az 3 saattir. Bu protokol A12 hücreleri ile kullanım için optimize edilmiş olsa hücre bütünlüğünü etkileyebilecek etmenler dikkate tutarken, diğer modellerinde kullanılmak üzere değişmiş olabilir. CaydırmakBu protokol, deney için bir dizi çalışma eğer numune maden ya da deneysel koşullar sayısına ve planlanan alt deneylere bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hücre Kültürü 1. Kaplama ve Bakım
- Sıcak Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kültür ortamı (DMEM +% 10 FBS +% 1 Penisilin / Streptomisin / Neomisin) 37 ° C'ye kadar
- -80 ° C donmuş A12 hücre stoku elde
- Hızla 37 ° C su banyosunda hücreleri çözülme; bir kez çözülmüş, yavaşça pipet hücreleri 75 cm 2 havalandırmalı kültür şişesine transfer ve kültür ortamı 10 ml ekleyin.
- 37 ° C de% 5 CO2 inkübatör içinde bir gece boyunca inkübe şişe Aspire medya 24 saat sonra taze ortam ile değiştirin. % 70-80 izdiham (2-3 gün büyüme) ürün elde edilene kadar artan hücreler devam edin.
2.. Sayma ve Kaplama Hücreler
- Sıcak DMEM ve 37 ° C'ye kadar 1x-tripsin-EDTA çözeltisi
- Hücrelerden aspire ve ortam steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kere yıkayın.
- Tripsin çözeltisinin 500 ul ilave edin ve 2-5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Ayırmakıspatula ile ve medya 5 ml hücrelerin süspansiyonu şişeden hücreler. Süzgecinden hücreleri geçmek ve temiz bir 50 ml tüp içine hücre süzgecinden geçer. Bir kereden fazla süzgecinden hücreleri geçmesi gerekebilir, ama daha üç kez tekrarlamak değil.
- Ortam, 100 ul'lik nihai bir hacimde 96 oyuklu bir açık alt siyah veya beyaz duvarlı bir plaka içerisinde 6,000 hücre / oyuk tohum kültür hücre miktarını belirlemek üzere, bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. 24 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 içinde plaka inkübe edin.
3.. Hücre Canlılık ve Kaspaz-3/7 Aktivitesi Tayini
- Steril 5 ml bir cam şişeye aktarılır ve PA% 100 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözünür. DMSO içinde stok Pensilvanya çözüm 01:10 sulandırmak ve 0.1 mM PA nihai bir çalışma konsantrasyonunu elde etmek DMEM'yi prewarmed ekleyin. Kontrol ortamı için, PA içeren ortam ilave edilir DMSO aynı konsantrasyonu ekleyin.
- De her ortamı çıkartın ve değiştirin 50 ul medya + / -PA. 37 ° C'de% 5 CO2 içinde, 2 saat boyunca inkübe Daha sonra 5 ul resazurin reaktif ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilir.
- Hücre canlılığı ölçmek için bir modlu microplate okuyucu, kayıt floresan (560 EX / 590 EM) kullanma. Sonuçlar, göreli floresans birimleri (RFU) olarak sunulmaktadır.
- Aynı plaka için, kaspaz maddesi 55 ul ekleyin ve 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
- Yine kaspaz-3/7 aktivitesini ölçmek için mikroplak okuyucu, rekor lüminesans kullanarak. Sonuçlar kaspaz-3/7 aktivitesi ile doğrudan orantılı bir parlaklık ile, göreli ışık birimi (RLU) olarak sunulmaktadır.
- , Hücre sayımına kaspaz-3/7 aktivitesi normalize kaspaz-3/7 aktivitesi (RLU), hücre canlılığı (RFU) bölün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, yukarıdaki hücre ölümü mekanizmasını belirlemek için çoklayıcı iki ayrı deneylerde sonuçlarını açıklar. Şekil 1 hücre canlılığı ve kaspaz-3/7 aktivitesinin belirlenmesi için protokol bir genel görünüşünü göstermektedir. Caspase aktivitesi önemli ölçüde 2 saat kuluçkadan (Şekil 2A ve Tablo 1) PA ile tehdit hücrelerde yükseltilmiştir. Hücre membran bütünlüğünün kaybı PA (Şekil 2B) 2 saat maruz kaldıktan sonra hücrelerde belirgin bir apoptoz indüklenmesi ile bağlantılı bir morfolojik bir değişikliktir. Şekil 3 PA apoptoz meydana getiren ve inkübasyon optimize önemini ortaya koyan potansiyel yolu özetlenmektedir DEVD reaktifte zaman.
Şekil 1,. Çok katlı bir tahlili için deneysel tasarımkaspaz-3/7 aktivitesini belirlemek için. Hücreler, 24 saat boyunca, 96 oyuklu bir plaka içerisine tohumlanır ve sonra PA varlığında ya da yokluğunda kuluçkaya yatırılır. Her reaktif varlığında Kuluçka süreleri modele bağlı olarak değişebilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2,. Caspase-3/7 aktivite 2 saat PA karşılaştırmadan sonra artar. Hipotalamus A12 hücreleri, 2 saat süre ile 0.1 mM PA varlığında ya da yokluğunda muamele edildi. Caspase-3/7 etkinliğini önemli ölçüde PA (p <0.01) ile muamele edilmiş hücrelerde yükseltilmiştir. Hücre zarı bütünlüğü gözle PA varlığında kaybolur. resmi büyütmek için buraya tıklayın. 
Şekil 3.. Pensilvanya kaynaklı hücre ölümü Potansiyel yolu. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
| Kontrol | 0.1 mM PA | ||||
| Canlı hücreler | Kaspaz 3/7 | oran | Canlı hücreler | Kaspaz 3/7 | oran |
| Floresan (560 EX / 590 EM) | 650 nm tepe luminescence | Kaspaz / Canlı hücreler | Floresan (560 EX / 590 EM) | 650 nm tepe luminescence | Kaspaz / Canlı Carşın |
| 1951,8 | 45,488 | ,023305667 | 808,78 | 16.731 | ,020686713 |
| 1647.0 | 46.011 | ,027936248 | 788,84 | 22.080 | ,027990467 |
| 1911,0 | 34,508 | ,018057561 | 777,68 | 28.234 | ,036305421 |
| 1792,5 | 14.183 | ,007912413 | 807,45 | 20,457 | ,025335315 |
| 1965,7 | 19.868 | ,010107341 | 829,14 | 17.777 | ,021440288 |
| 1803,0 | 20,229 | ,011219634 | 742,35 | 29.280 | ,039442312 |
| 1804,8 | 27.188 | ,015064273 | 761,77 | 17.777 | ,023336440 |
| 1890,1 | 40,7825 | ,021576901 | 756,66 | 20.914 | ,027639891 |
Toplanan verilerin ve hesaplanan oranları Tablo 1.. Örnek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multipleks tahlil, örneğin PCR microarrays İmmuno, ve diğer protein bazlı algılama yöntemleri 13, 14 gibi çeşitli uygulamalarda bilim adamları tarafından kullanılan bir iyi kabul tekniktir. Son zamanlarda, çoklayıcı deneyler artan in vitro plaka bazlı deneylerde kullanılan ve sitotoksisitesini değerlendirmek için güvenilir bir yöntem olarak doğrulanmış ve 12 canlılığı edilmiş hale gelmiştir. Yukarıdaki protokol, PA hücumundan A12 hücrelerde kaspaz-3/7 etkinliği ve hücre yaşayabilirliğini belirlemek için çoklayıcı ve parlak floresan deneyleri etkinliğini göstermektedir. Hücre canlılığı, canlı hücre içinde, hızlı ve güvenilir bir temsili için izin veren, başlangıç PA zedelenmesinin 10 dakika içinde belirlenmiştir. Bu rezasurin bazlı reaktif ölçülecek daha fazla uç noktalar için izin veren bir canlı hücre tahlili olduğu not edilmelidir; Bununla birlikte, kaspaz-3/7 etkinliğini belirlemek için inkübasyon süresi optimize essentia olduğukullanılabilir sonuçlar elde etmek için 15 l.
Apoptosis dış uyarımlar, hücre içi sinyal ve belirgin morfolojik ve biyokimyasal olayları sonucunu veren yüzey reseptörleri tarafından aktive edilebilir. Kaspaz 3 aktivitesi, DNA fragmantasyonu, hücre membran bütünlüğü kaybı, kromatin yoğunlaşması, ve poli Artan (ADP-riboz) polimeraz (PARP) hücre bölünmesinin 16 araştırılabilir apoptoz bazı özel göstergeleridir. Kaspaz 3 ve 7 aktivasyonu apoptotik hasarı 17 azaltmayı amaçlayan farmakolojik manipülasyonlara değerlendirmek için onları gerekli patron yapımına, apoptoz modülatörleri primer bulunmaktadır. Uzamış apoptozis geçiren hücreler sonunda kaspaz-3/7 aktivitesini 11 belirlemek için uygun bir zaman çerçevesi seçmenin önemini vurgulayan, hücre parçalaması gözlemlenebilir sekonder nekroz, uğrayacaktır. Daha önce belirtildiği gibi, kaspaz-3/7 etkinliği geçici olduğu; Bu nedenle, belirleme, stres hücre etkinliğine bağlı olarak thkaspaz aktivitesini tahlil e uygun zamanlama biraz çaba alabilir. Ayrıca, bizim çoklayıcı protokol için temel sınırlamalar kaspaz-3/7 aktivitesi belirlenmiştir ancak miktarı değil, ve elde edilen lizat alt deneyleri (örneğin, Western blot ya da gen ekspresyon) için kullanılamaz olabilir vardır.
Hücre seçilen model döngüsü ve nasıl bu tekniği uygularken zaman belirlenen stres yanıt olabilecek özelliklerini anlamak geçerli sonuçlar elde etmek önemlidir. Değerlendirecek çalışmalar planlanırken ek hususlar apoptotik yollar şunlardır: 1) kuyu başına ekilir hücrelerin uygun yoğunluğunu belirlemek; 2) konsantrasyon ve kullanılan stres veya ilaç inkübasyonu; ve 3) bir deneyde kullanılan reaktifler için uygun bir inkübasyon süresi. Standardizasyon veya bu hususları ele ön çalışmaların eksikliği genellikle hatalı verilere neden olur. Inci standardize etmek için kullanılır zaman ve çabaBiz burada açıklamak e çoklayıcı tahlil apoptotik çalışmaları 10 için, değerli, güvenilir ve zaman kazandıran bir teknik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek hiçbir çatışmalar var.
Acknowledgments
Burada anlatılan çalışma Gazi İşleri ABD Biyomedikal Laboratuvarı Araştırma ve Geliştirme BX001686-1A1 ve VA Rehabilitasyon Araştırma ve Geliştirme tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
- Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
- Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
- Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
- Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
- Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
- Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
- Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
