Summary
मल्टीप्लेक्स assays बुनियादी सेलुलर तंत्र के लिए फायदेमंद जानकारी उपलब्ध कराने और अभिकर्मकों और अनावश्यक दोहराव प्रयोगों की बर्बादी को खत्म कर सकते हैं. हम palmitic एसिड के साथ ऑक्सीडेटिव चुनौती के बाद एक इन विट्रो हाइपोथैलेमस मॉडल में सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए, फ्लोरोसेंट और luminescent आधारित विधियों का उपयोग कर, यहाँ एक मल्टीप्लेक्स कस्पासे 3/7 गतिविधि परख का वर्णन.
Abstract
जटिल सेलुलर तंत्र की पढ़ाई में assays मल्टीप्लेक्स क्षमता, दोहराव प्रयोगों के लिए की आवश्यकता समाप्त आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है, और लागत और अभिकर्मकों में बर्बादी कम हो जाती है. यहाँ हम एक 96 अच्छी तरह से व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती और कस्पासे 3/7 गतिविधि को मापने के लिए आधारित assays फ्लोरोसेंट और luminescent दोनों का उपयोग कर, एक में इन विट्रो हाइपोथैलेमस मॉडल में एक palmitic एसिड (पीए) चुनौती के बाद apoptosis का आकलन करने के लिए एक मल्टीप्लेक्स परख के अनुकूलन का वर्णन microtiter प्लेट स्वरूप. पा चैलेंज के बाद, व्यवहार्य कोशिकाओं एक resazurin आधारित फ्लोरोसेंट परख द्वारा निर्धारित किया गया है. कस्पासे 3/7 गतिविधि एक luminogenic सब्सट्रेट, DEVD, और सेल नंबर के लिए सामान्यीकृत का उपयोग करके निर्धारित था. इस बहुसंकेतन परख ऐसे संतृप्त फैटी एसिड चुनौती के रूप में एक apoptotic प्रोत्साहन, निम्नलिखित कस्पासे गतिविधि में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है. संतृप्त फैटी एसिड पीए संभावित importa का संकेत है, हाइपोथैलेमस oxidative तनाव और apoptosis बढ़ा सकते हैंजैसे कि assays के nce संतृप्त फैटी एसिड और neuronal समारोह के बीच संबंधों का अध्ययन करने में यहाँ का वर्णन किया.
Introduction
ऐसे palmitic एसिड (पीए) के रूप में संतृप्त फैटी एसिड में अमीर आहार मोटापा और हृदय रोग और मधुमेह 1, 2 सहित अन्य comorbidities, से जोड़ा गया है. उच्च वसा वाले आहार ऑक्सीडेटिव तनाव, apoptosis, और हाइपोथेलेमस में neuronal अध: पतन, भूख और ऊर्जा व्यय 3-7 का एक महत्वपूर्ण नियामक वृद्धि दर्ज की गई है. उच्च वसा वाले आहार जोखिम हाइपोथैलेमस अनियंत्रण लाती है, जिसके माध्यम से तंत्र को समझना मोटापा के लिए औषधीय उपचार के विकास के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है. हालांकि, आहार वसा neuronal समारोह को प्रभावित करता है, जिसके माध्यम से सेलुलर तंत्र अस्पष्ट रहते हैं. इस तरह के पीए के रूप में वसा हाइपोथैलेमस apoptotic रास्ते की शुरुआत ट्रिगर हो सकता है की एक बेहतर समझ इस उद्देश्य की ओर एक आवश्यक पहला कदम है. इस अनुच्छेद के लक्ष्य घंटे की पढ़ाई में इस्तेमाल के लिए विकसित पीए प्रदर्शन करने के लिए neuronal प्रतिक्रिया की इन विट्रो में परीक्षण के लिए एक मल्टीप्लेक्स परख, का वर्णन करने के लिए हैypothalamic neurodegeneration. हम देहात 8 के साथ ऑक्सीडेटिव चुनौती के बाद (A12 नामित) एक विभेदित अमर वयस्क माउस हाइपोथैलेमस सेल लाइन में कोशिकाओं की कुल संख्या प्रति 3/7 गतिविधि कस्पासे मापने के लिए इन विट्रो 96 अच्छी तरह प्रारूप मल्टीप्लेक्स परख का विस्तृत विवरण उपलब्ध कराते हैं.
संक्षेप में, सेल व्यवहार्यता एक resazurin आधारित परख के माध्यम से पा चैलेंज निम्न निर्धारित किया जाता है. Resazurin metabolically सक्रिय कोशिकाओं में एंजाइमी कमी से होकर गुजरती है कि एक सेल पारगम्य यौगिक है, सोचा था कि एक प्रक्रिया mitochondria 9 के माध्यम से होते हैं. व्यवहार्य कोशिकाओं लगातार व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के अनुपात एक फ्लोरोसेंट संकेत उत्पादन, resorufin को resazurin परिवर्तित. कस्पासे 3/7 गतिविधि तो एक DEVD आधारित lumogenic परख का उपयोग कर विश्लेषण किया है. DEVD कस्पासे -3 द्वारा cleaved एक एमिनो एसिड अनुक्रम (एएसपी ग्लू-वैल एएसपी) है. इस क्रम intracellular कस्पासे 3/7 के सक्रियण और बाद में दरार पर, एक lumogenic पदार्थ के लिए युग्मित है जबDEVD सब्सट्रेट, luminescent उत्पाद जारी की है. यह प्रतिक्रिया कस्पासे गतिविधि करने के लिए और इस तरह apoptosis के शामिल होने के लिए आनुपातिक है. मृत कोशिकाओं कस्पासे का उत्पादन नहीं कर सकते हैं, कस्पासे 3/7 गतिविधि प्रकृति क्षणिक से है; इसलिए विश्लेषण सेल तनाव के प्रभाव पर निर्भर करता है, 4 घंटा बाद चुनौती को 30 मिनट के बीच पूरा किया जाना चाहिए. सेल व्यवहार्यता कस्पासे 3/7 गतिविधि के विपरीत आनुपातिक है और कोशिका मृत्यु के तंत्र को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इस पद्धति पहले से orexin इस उपचार से प्रभावित तंत्र oxidative नुकसान 10 के खिलाफ की रक्षा करने में महत्वपूर्ण हैं, सुझाव है कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ चुनौती दी hypothalamic कोशिकाओं में apoptosis को कम कर देता पेप्टाइड हार्मोन के साथ कि pretreatment दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह वे परख अभिकर्मकों कम करने के लिए mitochondrial गतिविधि पर निर्भर के रूप में इन assays, सेल लाइन और ऊतक पर निर्भर कर रहे हैं नोट करना महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल वयस्क माउस हाइपोथैलेमस (A12) कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है; हालांकि,वर्णित विधियों इसी तरह के अनुसंधान के दायरे के भीतर फिट करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है.
एक ही संस्कृति से बहुसंकेतन assays अच्छी तरह से कई कारणों से व्यक्तिगत assays के प्रदर्शन की पारंपरिक विधि एक से अधिक लाभ प्रदान करता है. समय, सेल के नमूने, और संस्कृति अभिकर्मकों बचत के अलावा, बहुसंकेतन assays भी, सेल अस्तित्व और मृत्यु का ज्ञान प्रदान आंतरिक नियंत्रण प्रदान करते हैं, और दोहराव प्रयोगों 11, 12 के लिए की आवश्यकता को समाप्त कर सकते हैं.
वैकल्पिक तरीकों एक 96 अच्छी तरह प्रारूप का उपयोग, खासकर जब विश्वसनीय assays हैं जो पश्चिमी blots या ELISAs, पर भरोसा किया, लेकिन महंगा है और समय लेने वाली (1-2 दिन) हैं. यह बहुसंकेतन परख के लिए संस्कृति कोशिकाओं में लगने वाले समय को छोड़कर, कुल समय कम से कम 3 घंटा है. इस प्रोटोकॉल A12 कोशिकाओं के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है जबकि सेल अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं कि मन कारकों में रखते हुए, यह अन्य मॉडलों में इस्तेमाल के लिए परिवर्तित किया जा सकता है. रोकनाइस प्रोटोकॉल प्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए काम करेगा अगर खनन नमूने या प्रयोगात्मक शर्तों की संख्या पर योजना बनाई और नीचे की ओर प्रयोगों पर पर निर्भर करता है.
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Protocol
सेल संस्कृति के 1. चढ़ाना और रखरखाव
- गर्म Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) संस्कृति मीडिया (DMEM + 10% FBS + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / Neomycin) 37 डिग्री सेल्सियस
- -80 डिग्री सेल्सियस से जमे A12 कक्षों का जायजा प्राप्त
- तेजी से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं पिघलना; एक बार thawed, धीरे पिपेट कोशिकाओं को एक 75 सेमी 2 निकाल संस्कृति फ्लास्क को हस्तांतरण और संस्कृति मीडिया के 10 एमएल जोड़ने के लिए.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कुप्पी रातोंरात सेते महाप्राण मीडिया 24 घंटे के बाद और ताजा मीडिया के साथ की जगह. 70-80% संगम (2-3 दिन विकास) प्राप्त किया जाता है जब तक कोशिकाओं से बढ़ जारी.
2. गिनती और चढ़ाना कोशिकाओं
- गर्म DMEM और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 1x-trypsin-EDTA समाधान
- कोशिकाओं से और महाप्राण मीडिया बाँझ फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के साथ दो बार धोने.
- Trypsin समाधान के 500 μl जोड़ें और 2-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- अलग करनाएक खुरचनी का उपयोग कर और मीडिया के 5 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित कुप्पी से कोशिकाओं. झरनी के माध्यम से कोशिकाओं दर्रे और एक साफ 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल झरनी के माध्यम से गुजरती हैं. एक बार से अधिक झरनी के माध्यम से कोशिकाओं को पारित करने के लिए आवश्यकता हो सकती है, लेकिन अधिक से अधिक तीन बार दोहराना नहीं है.
- मीडिया के 100 μl के अंतिम मात्रा में एक 96 अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे काले या सफेद दीवारों थाली में 6,000 सेल / अच्छी तरह से बीज के लिए संस्कृति के लिए कक्षों की राशि निर्धारित करने के लिए एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में थाली सेते हैं.
3. सेल व्यवहार्यता और कस्पासे 3/7 गतिविधि का निर्धारण
- एक बाँझ 5 एमएल कांच की शीशी को पीए स्थानांतरण और 100% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में solubilize. DMSO में शेयर पीए समाधान 01:10 पतला और 0.1 मिमी पीए के अंतिम काम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए DMEM prewarmed में जोड़ें. नियंत्रण मीडिया के लिए, पीए युक्त मीडिया को जोड़ा गया है जो DMSO के एक ही एकाग्रता जोड़ें.
- अच्छी तरह से प्रत्येक में मीडिया निकालें और के साथ की जगह 50 μl मीडिया / -पीए. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में 2 घंटे के लिए थाली सेते फिर 5 μl resazurin अभिकर्मक जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए एक बहुपद्वति microplate रीडर, रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति (560 EX / 590 ईएम) का उपयोग करना. परिणाम रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं.
- एक ही थाली के लिए, कस्पासे अभिकर्मक के 55 μl जोड़ने के लिए और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- फिर कस्पासे 3/7 गतिविधि को मापने के लिए microplate रीडर, रिकॉर्ड luminescence का उपयोग कर. परिणाम कस्पासे 3/7 गतिविधि के लिए सीधे आनुपातिक luminescence के साथ, रिश्तेदार luminescence इकाइयों (RLU) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं.
- , सेल गिनती के लिए कस्पासे 3/7 गतिविधि को सामान्य कस्पासे 3/7 गतिविधि (RLU) द्वारा सेल व्यवहार्यता (RFU) को विभाजित करने के लिए.
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Representative Results
प्रोटोकॉल ऊपर कोशिका मृत्यु के तंत्र को निर्धारित करने के लिए बहुसंकेतन दो अलग assays में परिणाम का वर्णन है. चित्रा 1 सेल व्यवहार्यता और कस्पासे 3/7 गतिविधि का निर्धारण करने के लिए प्रोटोकॉल के एक सिंहावलोकन से पता चलता है. कस्पासे गतिविधि काफी 2 घंटा ऊष्मायन (2A चित्रा और तालिका 1) के बाद अथॉरिटी के साथ चुनौती कोशिकाओं में वृद्धि की गई थी. कोशिका झिल्ली अखंडता की हानि पेंसिल्वेनिया (चित्रा 2 बी) को 2 घंटे प्रदर्शन के बाद कोशिकाओं में स्पष्ट है जो apoptosis के शामिल होने के साथ जुड़े एक रूपात्मक बदलाव है. चित्रा 3 पीए apoptosis लाती और ऊष्मायन के अनुकूलन के महत्व को दर्शाता है जिसमें संभावित मार्ग की रूपरेखा DEVD अभिकर्मक में समय.
चित्रा 1. एक मल्टीप्लेक्स परख के लिए प्रायोगिक डिजाइनकस्पासे 3/7 गतिविधि का निर्धारण करने के लिए. प्रकोष्ठों 24 घंटे के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त और फिर पीए की उपस्थिति या अनुपस्थिति में incubated हैं. प्रत्येक अभिकर्मक की उपस्थिति में ऊष्मायन बार मॉडल के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. कस्पासे 3/7 गतिविधि 2 घंटा पा चैलेंज निम्न वृद्धि हुई है. Hypothalamic A12 कोशिकाओं 2 घंटे के लिए 0.1 मिमी पीए की उपस्थिति या अनुपस्थिति में इलाज किया गया. कस्पासे 3/7 गतिविधि काफी पेंसिल्वेनिया (पी <0.01) के साथ इलाज किया कोशिकाओं में वृद्धि की गई थी. कोशिका झिल्ली अखंडता दिख पीए की उपस्थिति में खो जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें. 
चित्रा 3. पीए प्रेरित कोशिका मृत्यु का संभावित मार्ग. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| नियंत्रण | 0.1 मिमी पीए | ||||
| व्यवहार्य कोशिकाओं | कस्पासे 3/7 | अनुपात | व्यवहार्य कोशिकाओं | कस्पासे 3/7 | अनुपात |
| प्रतिदीप्ति (560 EX / 590 ईएम) | 650 एनएम चोटी luminescence | कस्पासे / व्यवहार्य कोशिकाओं | प्रतिदीप्ति (560 EX / 590 ईएम) | 650 एनएम चोटी luminescence | कस्पासे / व्यवहार्य सीएल्स |
| 1951.8 | 45.488 | 0.०२३३०५६६७ | 808.78 | 16.731 | ०.०२०६८६७१३ |
| 1647.0 | 46.011 | ०.०२७९३६२४८ | 788.84 | 22.080 | ०.०२,७९,९०,४६७ |
| 1911.0 | 34.508 | .०१८०५७५६१ | 777.68 | 28.234 | .०३,६३,०५,४२१ |
| 1792.5 | 14.183 | ०.००७९१२४१३ | 807.45 | 20.457 | .०२५३३५३१५ |
| 1965.7 | 19.868 | 0.०१,०१,०७,३४१ | 829.14 | 17.777 | .०२१४४०२८८ |
| 1803.0 | 20.229 | ०.०१,१२,१९,६३४ | 742.35 | 29.280 | ०.०३,९४,४२,३१२ |
| 1804.8 | 27.188 | .०१५०६४२७३ | 761.77 | 17.777 | 0.०२,३३,३६,४४० |
| 1890.1 | 40.7825 | ०.०२,१५,७६,९०१ | 756.66 | 20.914 | ०.०२,७६,३९,८९१ |
एकत्र आंकड़ों और गणना के अनुपात की तालिका 1. उदाहरण.
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Discussion
मल्टीप्लेक्स परख ऐसी पीसीआर प्रोटीन, immunodetection, और अन्य प्रोटीन आधारित तरीकों का पता लगाने 13, 14 के रूप में कई अनुप्रयोगों में वैज्ञानिकों द्वारा इस्तेमाल किया गया है कि एक अच्छी तरह से स्वीकार तकनीक है. हाल ही में, बहुसंकेतन assays तेजी से इन विट्रो थाली आधारित प्रयोगों में इस्तेमाल किया और cytotoxicity का आकलन करने के लिए एक सटीक पद्धति के रूप में मान्य है और 12 व्यवहार्यता किया गया है बन गए हैं. ऊपर प्रोटोकॉल में, हम पा चैलेंज निम्नलिखित A12 कोशिकाओं में कस्पासे 3/7 गतिविधि और सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए बहुसंकेतन फ्लोरोसेंट और luminescent assays के प्रभाव को प्रदर्शित करता है. सेल व्यवहार्यता व्यवहार्य कोशिकाओं की एक तेजी से और विश्वसनीय प्रतिनिधित्व के लिए अनुमति देता है, प्रारंभिक पीए अपमान के 10 मिनट के भीतर निर्धारित किया गया था. यह rezasurin आधारित अभिकर्मक मापा जा आगे endpoints के लिए अनुमति देता है कि एक जीवित कोशिका परख है कि ध्यान दिया जाना चाहिए; हालांकि, कस्पासे 3/7 गतिविधि का निर्धारण करने के लिए ऊष्मायन समय के अनुकूलन के लिए आवश्यक तत्व हैउपयोगी परिणाम 15 प्राप्त करने के लिए एल.
Apoptosis बाहरी stimulations, आंतरिक सेल का संकेत है, और अलग रूपात्मक और जैव रासायनिक घटनाओं में जिसके परिणामस्वरूप सतह रिसेप्टर्स से सक्रिय किया जा सकता है. कस्पासे 3 गतिविधि, डीएनए विखंडन, कोशिका झिल्ली अखंडता की हानि, chromatin संघनन, और पाली में वृद्धि (ADP-ribose) पोलीमर्स (PARP) दरार 16 की जांच की जा सकती है कि apoptosis के कुछ विशिष्ट मार्करों हैं. कस्पासे 3 और 7 के सक्रियण apoptotic क्षति 17 को कम करने के उद्देश्य से औषधीय जोड़तोड़ में आकलन करने के लिए उन्हें आवश्यक मार्करों बनाने, apoptosis की प्राथमिक modulators हैं. लंबे समय तक apoptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं अंततः कस्पासे 3/7 गतिविधि 11 निर्धारित करने के लिए एक उचित समय सीमा को चुनने के महत्व को रेखांकित, सेल द्वारा नमूदार माध्यमिक गल जाना, गुजरना होगा. जैसा कि पहले उल्लेख, कस्पासे 3/7 गतिविधि क्षणिक है; इसलिए, निर्धारित करने, सेल तनाव के प्रभाव पर निर्भर करता है वेंकस्पासे गतिविधि परख करने के लिए ई उपयुक्त समय कुछ प्रयास ले सकते हैं. इसके अतिरिक्त, हमारे बहुसंकेतन प्रोटोकॉल के लिए मुख्य सीमाओं कस्पासे 3/7 गतिविधि निर्धारित लेकिन मात्रा निर्धारित नहीं है, और जिसके परिणामस्वरूप lysate नीचे की ओर assays (यानी पश्चिमी blots या जीन अभिव्यक्ति) के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है कि कर सकते हैं.
सेल चुना मॉडल का चक्र और कैसे इस तकनीक को लागू करने जब यह नामित तनाव का जवाब हो सकता है की विशेषताओं को समझना मान्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. मूल्यांकन करेंगे कि पढ़ाई की योजना बनाते समय अतिरिक्त विचार apoptotic रास्ते हैं: 1) अच्छी तरह से प्रति वरीयता प्राप्त कर रहे हैं कि कोशिकाओं का उचित घनत्व का निर्धारण; 2) एकाग्रता और इस्तेमाल तनाव या दवा की ऊष्मायन; और 3) एक परख में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के लिए उपयुक्त ऊष्मायन समय. मानकीकरण की या इन बातों का पता है कि प्रारंभिक अध्ययन की कमी आम तौर पर गलत डेटा में परिणाम होगा. वें मानकीकृत करने के लिए प्रयोग किया जाता समय और प्रयासहम यहाँ वर्णन ई बहुसंकेतन परख apoptotic पढ़ाई 10 के लिए एक मूल्यवान विश्वसनीय, और timesaving तकनीक प्रदान करता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष है.
Acknowledgments
यहाँ वर्णित काम दिग्गजों मामलों के अमेरिकी विभाग बायोमेडिकल प्रयोगशाला अनुसंधान और विकास BX001686-1A1 और वीए पुनर्वास अनुसंधान और विकास द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
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