Summary
Ensaios Multiplex pode fornecer informações úteis para os mecanismos celulares básicos e eliminar o desperdício de reagentes e experiências repetitivas desnecessárias. Descrevemos aqui um ensaio multiplex atividade caspase-3/7, usando métodos fluorescentes e luminescentes à base, para determinar a viabilidade celular em um modelo in vitro hipotálamo seguinte desafio oxidativo com ácido palmítico.
Abstract
A capacidade de multiplexar os ensaios em estudos de mecanismos celulares complexas elimina a necessidade de experiências repetitivas, fornece os controlos internos, e diminui os custos e desperdícios de reagentes. Aqui descrevemos optimização de um ensaio multiplex para avaliar a apoptose após um ácido palmítico (PA) desafio em um modelo in vitro do hipotálamo, usando tanto fluorescentes e luminescentes baseados ensaios para medir a contagem de células viáveis e caspase-3/7 em actividade de 96 poços formato de placa de microtitulação. A seguir ao desafio PA, as células viáveis foram determinados por um ensaio fluorescente baseado em resazurina. A caspase-3/7 actividade foi determinada usando um substrato luminogenic, DEVD, e normalizada para o número de células, em seguida. Este ensaio de multiplexação é uma técnica útil para determinar as alterações na actividade da caspase após o estímulo por apoptose, tais como desafio ácido gordo saturado. O ácido gordo saturado PA pode aumentar o stress oxidativo e apoptose hipotalâmico, indicando o potencial importance de ensaios tais como os descritos aqui em estudar a relação entre os ácidos gordos saturados e função neuronal.
Introduction
Dietas ricas em ácidos graxos saturados, como o ácido palmítico (PA) têm sido associados a obesidade e outras comorbidades, como doenças cardiovasculares e diabetes 1, 2. Dietas ricas em gordura também foram mostrados para aumentar o estresse oxidativo, apoptose e degeneração neuronal no hipotálamo, um importante regulador do apetite e gasto energético 3-7. Compreender o mecanismo através do qual a exposição dieta rica em gordura induz desregulação hipotalâmica é, portanto, importante para o desenvolvimento de tratamentos farmacológicos para a obesidade. No entanto, os mecanismos celulares pelos quais a gordura na dieta afeta a função neuronal permanecem obscuros. Uma melhor compreensão de como gorduras, como PA pode desencadear o início de vias apoptóticas hipotálamo é um primeiro passo necessário em direção a esse objetivo. O objetivo deste artigo é descrever um ensaio multiplex para testes in vitro de resposta neuronal à exposição PA, desenvolvido para uso em estudos de hneurodegeneração ypothalamic. Fornecemos uma descrição detalhada de um formato de 96 poços de ensaio multiplex in vitro para medir a caspase 3/7 actividade por número total de células de uma linha imortalizada diferenciadas célula hipotalâmica do rato adulto (designado A12) após o desafio oxidativo com PA 8.
Resumidamente, a viabilidade celular é determinada após o desafio com PA através de um ensaio baseado resazurina. Resazurina é um composto permeável célula que sofre redução enzimática em células metabolicamente activas, um processo que se pensa ocorrer por meio da mitocôndria 9. As células viáveis converter continuamente resazurina a resorufina, a produção de um sinal fluorescente proporcional à quantidade de células viáveis. Actividade da caspase-3/7 é então analisado utilizando um ensaio baseado lumogenic-DEVD. DEVD é uma sequência de aminoácidos (Asp-Glu-Val-Asp) clivada pela caspase-3. Quando esta sequência é acoplado a uma substância lumogenic, aquando da activação intracelular de caspase-3/7 e subsequente clivagemde substrato DEVD, o produto luminescente é liberada. Esta reacção é proporcional à actividade da caspase e, consequentemente, para a indução de apoptose. Como as células mortas não podem produzir caspase, caspase-3/7 atividade é de natureza transitória; portanto, a análise deve ser concluída entre 30 minutos a 4 horas após o desafio, dependendo da eficácia do estressor celular. A viabilidade das células é inversamente proporcional à actividade da caspase-3/7 e pode ser usado para determinar os mecanismos de morte celular. Por exemplo, este método tem sido utilizado para demonstrar que o pré-tratamento com a hormona peptídica orexina reduz a apoptose em células do hipotálamo desafiados com peróxido de hidrogénio, o que sugere que os mecanismos afectadas por este tratamento são importantes para a protecção contra danos oxidativos 10. É importante notar estes ensaios são linha e células dependente de tecido, uma vez que dependem de actividade mitocondrial para reduzir os reagentes do ensaio. Este protocolo foi otimizado para rato adulto hipotálamo (A12) células; no entanto,métodos descritos podem ser alterados para se ajustar dentro do âmbito da investigação semelhante.
Os ensaios de multiplexação de um único poço de cultura proporciona uma vantagem em relação ao método tradicional de realização de ensaios individuais para várias razões. Além da economia de tempo, amostras de células, e os reagentes de cultura, ensaios de multiplexação também pode proporcionar conhecimentos sobre a sobrevivência das células e a morte, fornecem controlos internos, e eliminar a necessidade de experiências repetidas 11, 12.
Métodos alternativos têm invocado borrões ou ELISAs ocidentais, que são ensaios de confiança, mas é dispendioso e consome tempo (1-2 dias), especialmente quando se utiliza um formato de 96 poços. Excluindo o tempo que leva para as células de cultura para o ensaio de multiplexagem, o tempo total é menos do que 3 horas. Embora este protocolo foi optimizado para utilização com células A12, pode ser alterada para uso em outros modelos, mantendo em mente os fatores que podem influenciar a integridade celular. Determineração se este protocolo iria trabalhar para uma série de experimentos depende do número de amostras ou condições experimentais e em experimentos a jusante planejadas.
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Protocol
1. Chapeamento e manutenção da cultura celular
- Quente de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) meio de cultura (DMEM + 10% FBS + 1% de Penicilina / Estreptomicina / Neomicina) a 37 ° C.
- Obter estoque da A12 células congeladas de -80 ° C.
- Descongelar rapidamente células em 37 ° C num banho de água; uma vez descongelado, suavemente as células de pipeta para transferir para um frasco de cultura ventilada 75 centímetros 2 e adicione 10 ml de meio de cultura.
- Incubar balão durante a noite em 5% de CO2 a 37 ° C. Aspirar a mídia após 24 horas e substitua-o por meios frescos. Continuar as células crescer até 70-80% de confluência é obtido (2-3 dias de crescimento).
2. Contando e cultivo de células
- DMEM quente e solução de 1x-tripsina-EDTA a 37 ° C.
- Aspirar a partir de meios de células e lava-se duas vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
- Adicionar 500 ul de solução de tripsina e incubar a 37 ° C durante 2-5 min.
- Separarcélulas de balão, utilizando um raspador e suspender as células em 5 ml de meio. Passe células através de filtro e passar por filtro de células em um tubo de 50 ml limpo. Que precisa passar células através de filtro mais de uma vez, mas não repetir mais do que três vezes.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro para determinar a quantidade de células de cultura para semear 6000 células / poço numa placa de preto ou branco 96 poços de fundo claro com paredes em um volume final de 100 ul de meio. Incubar a placa em 5% de CO 2, a 37 ° C durante 24 hr.
3. Determinação Viabilidade celular e caspase-3/7 Actividade
- Transferir PA para um frasco de 5 ml estéril de vidro e solubilizar em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir solução estoque PA 1:10 em DMSO e adicioná-lo ao pré-aquecido DMEM para obter uma concentração final de trabalho de 0,1 mM de PA. Para meios de controle, adicione a mesma concentração de DMSO que é adicionado à mídia contendo PA.
- Remova a mídia em cada poço e substituir com 50 ul media + / -PA. Incubar a placa durante 2 horas em 5% de CO 2, a 37 ° C. Em seguida, adicionam-se 5 ul de reagente de resazurina e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
- Usando um leitor de microplacas multimodo, ficha de fluorescência (560 EX / 590 EM) para medir a viabilidade celular. Os resultados são apresentados como unidades de fluorescência relativas (RFU).
- Para a mesma placa, adicionar 55 ul de reagente de caspase e incubar à temperatura ambiente durante 2 horas.
- Novamente usando o leitor de microplacas, ficha luminescência para medir a atividade da caspase-3/7. Os resultados são apresentados como unidades de luminescência relativa (RLU), com luminescência directamente proporcional à caspase-3/7 actividade.
- Para normalizar a atividade da caspase-3/7 para contagem de células, divida a viabilidade celular (RFU) por caspase-3/7 atividade (RLU).
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Representative Results
O protocolo acima descreve resultados na multiplexação de dois ensaios separados para determinar os mecanismos de morte celular. Figura 1 mostra uma visão geral do protocolo para determinar a viabilidade celular e caspase-3/7 atividade. Actividade de caspase foi significativamente aumentada em células desafiadas com PA após 2 horas de incubação (Figura 2A e na Tabela 1). A perda da integridade da membrana celular é uma alteração morfológica associada com a indução de apoptose, o que resulta em células depois de 2 h de exposição ao PA (Figura 2B). Figura 3 descreve a via de potencial na qual PA induz a apoptose e demonstra a importância de optimizar a incubação tempo no reagente DEVD.
Figura 1. Delineamento experimental para um ensaio multiplexpara determinar a actividade da caspase-3/7. células são semeadas numa placa de 96 poços durante 24 horas e, em seguida, incubadas na presença ou na ausência de AP. Os tempos de incubação na presença de cada reagente pode variar dependendo do modelo. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Actividade Figura 2. Caspase-3/7 é aumentada após 2 horas desafio PA. Hipotálamo A12 células foram tratadas na presença ou ausência de 0,1 mM de PA durante 2 horas. Actividade da caspase-3/7 foi significativamente aumentada em células tratadas com PA (p <0,01). Integridade da membrana celular é visivelmente perdido na presença de PA. Clique aqui para ver imagem ampliada. 
Figura 3. Caminho potencial de morte celular induzida PA. Clique aqui para ver imagem ampliada.
| Controle | PA 0.1 mM | ||||
| Células viáveis | Caspase 3/7 | relação | Células viáveis | Caspase 3/7 | relação |
| A fluorescência (560 EX / 590 EM) | Luminescência 650 nm de pico | Caspase / células viáveis | A fluorescência (560 EX / 590 EM) | Luminescência 650 nm de pico | Caspase / Viável Cvaras |
| 1.951,8 | 45,488 | 0,023305667 | 808,78 | 16.731 | 0,020686713 |
| 1.647,0 | 46,011 | 0,027936248 | 788,84 | 22.080 | 0,027990467 |
| 1.911,0 | 34,508 | 0,018057561 | 777,68 | 28,234 | 0,036305421 |
| 1.792,5 | 14.183 | 0,007912413 | 807,45 | 20,457 | 0,025335315 |
| 1.965,7 | 19,868 | 0,010107341 | 829,14 | 17,777 | 0,021440288 |
| 1.803,0 | 20,229 | 0,011219634 | 742,35 | 29,280 | 0,039442312 |
| 1.804,8 | 27,188 | 0,015064273 | 761,77 | 17,777 | 0,023336440 |
| 1.890,1 | 40,7825 | 0,021576901 | 756,66 | 20,914 | 0,027639891 |
Tabela 1. Exemplo de dados coletados e rácios calculados.
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Discussion
O ensaio multiplex é uma técnica bem aceite que tem sido utilizado por cientistas em numerosas aplicações tais como PCR, microarrays de imunodetecção, e outros métodos de detecção baseados em proteínas de 13, 14. Recentemente, ensaios de multiplexagem tornaram-se cada vez mais utilizado em experiências in vitro, baseados em placa e foram validados como um método acurado para avaliar a citotoxicidade e viabilidade 12. No protocolo anterior, que demonstram a eficácia de lâmpadas fluorescentes e luminescentes ensaios de multiplexagem para determinar a actividade da caspase-3/7 e a viabilidade das células em células A12 seguintes desafio PA. A viabilidade das células foi determinado após 10 min de insulto PA inicial, permitindo uma representação rápida e fiável de células viáveis. Deve notar-se que o reagente à base de rezasurin é um ensaio de células vivas que permite parâmetros suplementares a serem medidos; no entanto, optimizando o tempo de incubação para determinar a actividade da caspase-3/7 é essêncial para obter resultados utilizáveis 15.
A apoptose pode ser activada por estímulos externos, os sinais celulares internos, e receptores de superfície, resultando em mudanças morfológicas e bioquímicas distintas. O aumento da actividade da caspase 3, a fragmentação do ADN, a perda da integridade da membrana celular, a condensação da cromatina, e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) clivagem são alguns marcadores específicos de apoptose que podem ser investigados 16. A ativação de caspase 3 e 7 são moduladores primárias de apoptose, fazendo-os marcadores essenciais para apreciar em manipulações farmacológicas destinadas a reduzir os danos causados por apoptose 17. As células em apoptose prolongada acabará por sofrer necrose secundária, observáveis por lise celular, ressaltando a importância de escolher um período de tempo apropriado para determinar a atividade da caspase-3/7 11. Como mencionado anteriormente, a caspase-3/7 actividade é transiente; Portanto, dependendo da eficácia do estressor célula, determinando ªe momento adequado para analisar a atividade caspase pode demorar algum esforço. Além disso, as principais limitações para o nosso protocolo de multiplexação são de que a actividade de caspase-3/7 pode determinar, mas não quantificada, e o lisado resultante não pode ser utilizado para ensaios a jusante (isto é, manchas Western ou de expressão de genes).
Compreender as características do ciclo celular do modelo escolhido e como ele pode responder a estressores designados ao aplicar esta técnica é fundamental para a obtenção de resultados válidos. Considerações adicionais ao planejar os estudos que irão avaliar as vias de apoptose são: 1) determinar a densidade adequada de células que são semeados por poço; 2) concentração e incubação do estressor ou drogas usadas; e 3) o tempo de incubação apropriado para os reagentes usados no ensaio. A falta de padronização ou de estudos preliminares que abordam estas considerações geralmente resultará em dados errados. O tempo eo esforço utilizado para padronizar ªensaio de multiplexação e descrevemos aqui fornece uma técnica valiosa, confiável e economia de tempo para os estudos de apoptose 10.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de divulgar.
Acknowledgments
O trabalho aqui descrito foi financiado pelo Departamento de Assuntos de Veteranos EUA Biomédica Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento BX001686-1A1 e VA Reabilitação de Investigação e Desenvolvimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
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