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Neuroscience

Utilisation d'un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l'apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

doi: 10.3791/51305 Published: April 16, 2014

Summary

Les essais multiplex peuvent fournir des informations utiles pour les mécanismes cellulaires de base et d'éliminer les déchets de réactifs et d'expériences répétitives inutiles. Nous décrivons ici une caspase-3/7 dosage de l'activité de multiplexage, en utilisant des procédés fluorescents, luminescents et située, pour déterminer la viabilité cellulaire dans un modèle in vitro de l'hypothalamus après provocation par oxydation avec de l'acide palmitique.

Abstract

La capacité de multiplexer des dosages dans des études sur les mécanismes cellulaires complexes élimine la nécessité d'expériences répétitives, fournit des contrôles internes, et diminue les coûts des déchets et des réactifs. Nous décrivons ici l'optimisation d'un dosage multiplex à évaluer l'apoptose suivant un acide palmitique (PA) de défi dans un modèle hypothalamique in vitro, en utilisant à la fois fluorescent et luminescent à base de dosages pour mesurer le nombre de cellules viables et de la caspase-3/7 activité dans un 96 puits format de plaque de microtitration. Après l'épreuve PA, les cellules viables ont été déterminés par un essai fluorescent à base resazurine. Caspase-3/7, puis l'activité a été déterminée en utilisant un substrat luminescent, DEVD, et normalisée au nombre de cellules. Ce test de multiplexage est une technique utile pour déterminer les changements dans l'activité de la caspase la suite d'un stimulus apoptotique, tel que défi d'acide gras saturé. L'acide gras saturé PA peut augmenter le stress oxydatif et l'apoptose hypothalamique, indiquant l'importation potentielnce de tests tels que celui décrit ici à l'étude de la relation entre les acides gras saturés et de la fonction neuronale.

Introduction

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Les régimes riches en acides gras saturés comme l'acide palmitique (PA) ont été associés à l'obésité et d'autres comorbidités, notamment les maladies cardiovasculaires et le diabète 1, 2. On a également montré les régimes alimentaires riches en matières grasses d'augmenter le stress oxydatif, l'apoptose, et la dégénérescence des neurones de l'hypothalamus, un important régulateur de l'appétit et les dépenses énergétiques 3-7. Comprendre le mécanisme par lequel l'exposition de régime riche en graisses induit dérèglement hypothalamique est donc important pour le développement de traitements pharmacologiques de l'obésité. Toutefois, les mécanismes cellulaires à travers lequel les graisses alimentaires affecte la fonction neuronale restent floues. Une meilleure compréhension de la façon dont les graisses tels que le PA peuvent déclencher l'apparition de voies apoptotiques hypothalamiques est une première étape nécessaire vers cet objectif. Le but de cet article est de décrire un test multiplex pour les tests in vitro de la réponse neuronale à l'exposition PA, développé pour une utilisation dans les études de hneurodégénérescence ypothalamic. Nous fournissons une description détaillée d'un 96 bien le format dosage multiplex in vitro pour mesurer la caspase 3/7 activité par nombre total de cellules dans une ligne différenciée immortalisé de souris adulte hypothalamique cellulaire (désigné A12) après défi oxydatif avec PA 8.

En bref, la viabilité cellulaire est déterminée après l'épreuve PA via un test de resazurine base. Résazurine est un composé perméable de cellule qui subit une réduction enzymatique dans les cellules métaboliquement actives, un processus de pensée de se produire via les mitochondries 9. Les cellules viables à convertir en continu résazurine résorufine, la production d'un signal fluorescent proportionnel au nombre de cellules viables. l'activité de la caspase-3/7 est ensuite analysée en utilisant un dosage basé lumogenic-DEVD. DEVD est une séquence d'acides aminés (Asp-Glu-Val-Asp) clivée par la caspase-3. Lorsque cette séquence est couplé à une substance lumogenic, lors d'une activation intracellulaire de la caspase-3/7 et le clivage subséquentDEVD de substrat, le produit luminescent est libéré. Cette réaction est proportionnelle à l'activité des caspases et, par conséquent à l'induction de l'apoptose. Comme les cellules mortes ne peuvent pas produire la caspase, la caspase-3/7 activité est par nature transitoire; donc l'analyse doit être effectué entre 30 min à 4 h après la provocation, en fonction de l'efficacité de stress cellulaire. La viabilité des cellules est inversement proportionnelle à l'activité de la caspase-3/7 et peut être utilisé pour déterminer les mécanismes de mort cellulaire. Par exemple, ce procédé a déjà été utilisé pour montrer que le prétraitement avec l'hormone peptidique orexine réduit l'apoptose dans les cellules hypothalamiques provoquées avec du peroxyde d'hydrogène, ce qui suggère que des mécanismes affectés par ce traitement sont importants dans la protection contre les dommages oxydatifs 10. Il est important de noter que ces tests sont-line et le tissu cellulaire dépendante, car elles reposent sur l'activité mitochondriale de réduire les réactifs de dosage. Ce protocole a été optimisé pour l'hypothalamus de souris adulte (A12) des cellules; cependant,méthodes décrites peuvent être modifiées pour s'adapter dans le cadre de recherches similaires.

Essais de multiplexage d'une seule culture fournit ainsi un avantage sur la méthode traditionnelle de réaliser des dosages individuels pour plusieurs raisons. En plus d'économiser du temps, des échantillons de cellules, et les réactifs de culture, des essais de multiplexage peuvent également fournir des connaissances de la survie cellulaire et la mort, assurer des contrôles internes, et d'éliminer la nécessité d'expériences répétitives 11, 12.

Méthodes alternatives se sont appuyés sur des taches ou ELISA occidentaux, qui sont des tests fiables, mais ils sont coûteux et fastidieux (1-2 jours), en particulier lors de l'utilisation d'un format de 96 puits. À l'exclusion du temps qu'il faut pour des cellules de culture pour le test de multiplexage, la durée totale est inférieure à 3 heures. Bien que ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec les cellules A12, il peut être modifié pour une utilisation dans d'autres modèles tout en gardant à l'esprit les facteurs qui peuvent influer sur l'intégrité de la cellule. Dissuaderminier, si ce protocole travailler pour une série d'expériences dépend du nombre d'échantillons ou de conditions expérimentales et sur des expériences en aval prévues.

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Protocol

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1. Placage et entretien de culture cellulaire

  1. Modified Eagle Medium chaud Dulbecco (DMEM) des milieux de culture (DMEM + 10% FBS + 1% pénicilline / streptomycine / néomycine) à 37 ° C.
  2. Obtenir stock de cellules congelées A12 à partir de -80 ° C.
  3. Décongeler rapidement dans les cellules à 37 ° C bain d'eau; une fois décongelé, en douceur les cellules de pipette pour transférer à un évent flacon de culture de 75 cm 2 et ajouter 10 ml de milieu de culture.
  4. Incuber ballon pendant une nuit sous 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C. Aspirer le milieu après 24 h et le remplacer par du milieu frais. Continuer jusqu'à ce que la croissance de cellules 70-80% de confluence est obtenue (croissance de 2-3 jours).

2. Comptage et étalement des cellules

  1. DMEM chaud et solution 1x-trypsine-EDTA à 37 ° C.
  2. Aspirer le milieu des cellules et laver deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS).
  3. Ajouter 500 ul de solution de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 2-5 min.
  4. Détacherles cellules de ballon à l'aide d'un grattoir et suspendre les cellules dans 5 ml de milieu. Passez cellules à travers la crépine et passer à travers tamis cellulaire dans un tube de 50 ml propre. Il peut être nécessaire de passer par les cellules crépine plus d'une fois, mais ne pas répéter plus de trois fois.
  5. Compter les cellules en utilisant un hématimètre pour déterminer la quantité de cellules de culture de semences de 6000 cellules / puits dans une plaque inférieure paroi noir ou blanc 96 puits clair dans un volume final de 100 ul de milieu. Incuber la plaque à 5% de CO2 à 37 ° C pendant 24 heures.

3. Détermination de la viabilité cellulaire et la caspase-3/7 Activité

  1. PA transférer à un flacon de 5 ml en verre stérile et solubiliser dans 100% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Diluer la solution mère PA 01h10 dans le DMSO et l'ajouter à préchauffé DMEM pour obtenir une concentration finale de travail mM PA 0,1. Pour les milieux témoins, ajouter la même concentration de DMSO, qui est ajouté à des milieux contenant du PA.
  2. Retirez le support dans chaque puits et les remplacer par 50 médias pl + / -PA. Incuber la plaque pendant 2 heures dans 5% de CO2 à 37 ° C. Ajouter ensuite 5 pi réactif REMA et incuber pendant 10 min à température ambiante.
  3. En utilisant un lecteur de microplaques multimode, record fluorescence (560 EX / 590 EM) pour mesurer la viabilité cellulaire. Les résultats sont présentés sous forme d'unités relatives de fluorescence (RFU).
  4. Pour la même plaque, ajouter 55 ul de réactif de la caspase et incuber à température ambiante pendant 2 h.
  5. Encore une fois à l'aide du lecteur de microplaques, record luminescence pour mesurer l'activité de la caspase-3/7. Les résultats sont présentés sous forme d'unités relatives de luminescence (RLU), avec une luminescence directement proportionnelle à la caspase-3/7 activité.
  6. Pour normaliser l'activité de la caspase-3/7 de la numération cellulaire, la viabilité des cellules diviser (RFU) par la caspase-3/7 activité (RLU).

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Representative Results

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Le protocole ci-dessus présente les résultats de multiplexage deux essais distincts pour déterminer les mécanismes de la mort cellulaire. Figure 1 montre une vue d'ensemble du protocole pour déterminer la viabilité cellulaire et de la caspase-3/7 activité. l'activité de la caspase était significativement augmentée dans les cellules provoqués avec PA après 2 heures d'incubation (figure 2A et le tableau 1). La perte d'intégrité de la membrane cellulaire est une modification morphologique associé à l'induction de l'apoptose, ce qui est apparent dans les cellules après deux exposition hr de PA (figure 2B). Figure 3 illustre la voie potentielle dans laquelle PA induit l'apoptose et démontre l'importance de l'optimisation de l'incubation temps dans le réactif de DEVD.

Figure 1
Figure 1. Expérimentale de conception pour un test multiplexà déterminer l'activité de la caspase-3/7. cellules sont ensemencées dans une plaque à 96 puits pendant 24 heures, puis incubées en présence ou en l'absence de PA. Les temps d'incubation en présence de chaque réactif peuvent varier selon le modèle. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Activité Figure 2. D'Caspase-3/7 est accrue après la provocation de PA 2 h. Hypothalamiques A12 cellules ont été traitées en présence ou en absence de 0,1 mM de PA pendant 2 h. l'activité de la caspase-3/7 était significativement augmentée dans les cellules traitées avec du PA (p <0,01). intégrité de la membrane cellulaire est visiblement perdu dans la présence de PA. Cliquez ici pour agrandir l'image. Figure 3
Figure 3. Du chemin potentiel de la mort cellulaire induite par PA. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Contrôle MM PA 0,1
Les cellules viables Caspase 3/7 rapport Les cellules viables Caspase 3/7 rapport
Fluorescence (560 EX / 590 EM) Luminescence 650 nm pic Caspase / cellules viables Fluorescence (560 EX / 590 EM) Luminescence 650 nm pic Caspase / viable Caunes
1951,8 45,488 0,023305667 808,78 16,731 0,020686713
1647,0 46,011 0,027936248 788,84 22.080 0,027990467
1911,0 34,508 0,018057561 777,68 28,234 0,036305421
1792,5 14.183 0,007912413 807,45 20,457 0,025335315
1965,7 19,868 0,010107341 829,14 17,777 0,021440288
1803,0 20,229 0,011219634 742,35 29.280 0,039442312
1804,8 27,188 0,015064273 761,77 17,777 0,023336440
1890,1 40,7825 0,021576901 756,66 20,914 0,027639891

Tableau 1. Exemple de données collectées et ratios calculés.

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Discussion

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Le test multiplex est une technique bien acceptée qui a été utilisé par les scientifiques dans de nombreuses applications telles que les puces à ADN de PCR, immunodétection, et d'autres méthodes de détection à base de protéines de 13, 14. Récemment, des tests de multiplexage sont devenus de plus en plus utilisés dans des expériences in vitro sur la base de plaque et ont été validées comme une méthode précise pour évaluer la cytotoxicité et de la viabilité 12. Dans le protocole ci-dessus, on démontre l'efficacité des fluorescents et luminescents multiplexage des dosages pour déterminer l'activité de la caspase-3/7 et la viabilité cellulaire dans les cellules A12 suivantes défi PA. La viabilité cellulaire a été déterminée à 10 min de l'insulte initiale PA, permettant ainsi une représentation rapide et fiable de cellules viables. Il est à noter que le réactif à base rezasurin-est un dosage de cellules vivantes qui prévoit d'autres paramètres à mesurer; toutefois, l'optimisation de la durée d'incubation pour déterminer l'activité de la caspase-3/7 est essential pour obtenir des résultats utilisables 15.

L'apoptose peut être activé par des stimulations externes, les signaux internes des cellules, et les récepteurs de surface résultant des événements morphologiques et biochimiques distinctes. Augmentation de l'activité de la caspase 3, la fragmentation de l'ADN, une perte d'intégrité de la membrane cellulaire, une condensation de la chromatine, et la poly (ADP-ribose) polymérase (PARP) clivage sont des marqueurs spécifiques de l'apoptose qui peuvent être étudiés 16. Activation de la caspase 3 et 7 sont des modulateurs primaires de l'apoptose, ce qui en fait des marqueurs essentiels pour évaluer les manipulations pharmacologiques visant à réduire les dommages causés par apoptose 17. Les cellules en apoptose prolongée finira par se nécroser secondaire, observable par la lyse des cellules, ce qui souligne l'importance de choisir un délai approprié pour déterminer l'activité de la caspase-3/7 11. Comme mentionné précédemment, la caspase-3/7 activité est transitoire; Par conséquent, en fonction de l'efficacité de facteur de stress de la cellule, la détermination de ee moment approprié pour déterminer l'activité de la caspase peut prendre un certain effort. En outre, les principales limites de notre protocole de multiplexage sont que l'activité de la caspase-3/7 peut déterminer, mais non quantifiée, et le lysat résultant ne peut pas être utilisé pour les essais en aval (c.-à-blots occidentaux ou l'expression des gènes).

Comprendre les caractéristiques du cycle cellulaire du modèle choisi et comment il pourrait réagir aux facteurs de stress désignés lors de l'application de cette technique est essentielle pour obtenir des résultats valides. Autres considérations relatives à la planification des études qui évalueront les voies apoptotiques sont: 1) la détermination de la densité appropriée de cellules qui sont ensemencées par puits; 2) la concentration et l'incubation du stress ou médicament utilisé; et 3) le temps d'incubation approprié pour les réactifs utilisés dans un dosage. Le manque de standardisation ou d'études préliminaires qui répondent à ces considérations se traduira généralement par des données erronées. Le temps et l'effort utilisé pour normaliser ee multiplexage test que nous décrivons ici fournit une technique précieuse, fiable, et un gain de temps pour les études apoptotiques 10.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun conflit de divulguer.

Acknowledgments

Le travail décrit ici a été financé par le département américain des Anciens Combattants recherche biomédicale en laboratoire et développement BX001686-1A1 et VA réhabilitation de recherche et de développement.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2  Cellutions Biosystems Inc. CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Invitrogen 10313-039
Fetal Bovine Serum  PAA Labs A15-751
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15070-063
Palmitic Acid Sigma-Aldrich P0500
Dimethy Sulfoxide  Sigma-Aldrich D2650

PrestoBlue Cell Viability Reagent
Invitrogen A13262
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems Promega G8091
96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile Thermo Fisher Scientific 165305
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Molecular Devices

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References

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Utilisation d&#39;un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l&#39;apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique
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Cite this Article

Butterick, T. A., Duffy, C. M., Lee, R. E., Billington, C. J., Kotz, C. M., Nixon, J. P. Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model. J. Vis. Exp. (86), e51305, doi:10.3791/51305 (2014).More

Butterick, T. A., Duffy, C. M., Lee, R. E., Billington, C. J., Kotz, C. M., Nixon, J. P. Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model. J. Vis. Exp. (86), e51305, doi:10.3791/51305 (2014).

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