Summary
Multiplex-Assays können nützliche Informationen für grundlegende zelluläre Mechanismen und beseitigen Abfälle von Reagenzien und unnötig wiederholende Experimenten. Wir beschreiben hier ein Multiplex-Caspase-3/7 Aktivitätstest unter Verwendung von fluoreszierenden und lumineszier-basierte Verfahren, um die Lebensfähigkeit der Zellen in einem in vitro Modell Hypothalamus folgenden oxidativen Herausforderung mit Palmitinsäure bestimmen.
Abstract
Die Fähigkeit, Tests in Studien von komplexen zellulären Mechanismen Multiplexen beseitigt die Notwendigkeit für wiederholte Versuche, stellt die internen Kontrollen und verringert Abfall Kosten und Reagenzien. Hier beschreiben wir die Optimierung eines Multiplex-Assays, um die Apoptose zu beurteilen Ein Palmitinsäure (PA) Herausforderung in einem in vitro-Modell des Hypothalamus, unter Verwendung von sowohl Fluoreszenz-und Lumineszenz-basierten Assays, um lebensfähige Zellzahlen und Caspase-3/7-Aktivität in einer 96-Well-Messung Mikrotiterplatten-Format. Nach PA Challenge wurden lebensfähigen Zellen durch eine Resazurin-basierte Fluoreszenztest bestimmt. Caspase-3/7 Aktivität wurde dann unter Verwendung eines luminogenen Substrat, DEVD und normalisiert auf die Zellzahl. Dieses Multiplexing Assay ist eine nützliche Technik zum Bestimmen Änderung Caspase-Aktivität nach einer apoptotischen Stimulus, wie z. B. gesättigte Fettsäure Herausforderung. Die gesättigten Fettsäuren PA Hypothalamus oxidativen Stress und Apoptose zu erhöhen, was die potenziellen Einfuhrnz der Assays wie hier beschrieben in die Untersuchung der Beziehung zwischen gesättigten Fettsäuren und neuronalen Funktion.
Introduction
Ernährung reich an gesättigten Fettsäuren, wie Palmitinsäure (PA) haben, Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes 1, 2 verbunden worden. Hohe Fett-Diäten haben auch gezeigt, dass oxidativer Stress, Apoptose und neuronale Degeneration im Hypothalamus, einem wichtigen Regulator der Appetit und Energieaufwand 3-7 erhöhen. Das Verständnis der Mechanismus, durch den hohen Fett-Diät-Exposition induziert Hypothalamus Dysregulation ist somit wichtig für die Entwicklung von pharmakologischen Behandlungen für Übergewicht. , Die zellulären Mechanismen, durch die Nahrungsfett beeinflusst die neuronale Funktion bleibt jedoch unklar. Ein besseres Verständnis, wie Fette, wie PA könnte Einsetzen der Hypothalamus-apoptotische Signalwege auslösen, ist ein notwendiger erster Schritt hin zu diesem Ziel. Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Multiplex-Assays für in-vitro-Tests der neuronalen Antwort auf PA Exposition, für den Einsatz in Studien von h entwickelt beschreibenypothalamic Neurodegeneration. Wir liefern eine detaillierte Beschreibung eines in vitro 96-well Format Multiplex-Assay zur Messung der Caspase 3/7 Aktivität pro Gesamtzahl der Zellen in einem differenzierten verewigt erwachsenen Maus Hypothalamus-Zelllinie (A12 bezeichnet) nach oxidativer Herausforderung mit PA-8.
Kurz gesagt, wird die Lebensfähigkeit der Zellen nach PA Herausforderung über ein Resazurin basierte Assays bestimmt. Resazurin ist eine Zelle durchlässige Verbindung, die enzymatische Reduktion in metabolisch aktiven Zellen unterzogen, um ein Verfahren, dachte über die Mitochondrien 9 auftreten. Lebensfähige Zellen kontinuierlich Resazurin zu Resorufin zu konvertieren, wodurch ein Fluoreszenzsignal proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen. Caspase-3/7 Aktivität wird dann unter Verwendung eines DEVD-basierten Assay lumogenic. DEVD eine Aminosäure-Sequenz (Asp-Glu-Val-Asp) von Caspase-3 gespalten wird. Wenn diese Sequenz mit einer lumogenic Substanz bei Aktivierung des intrazellulären Caspase-3/7 und anschließende Spaltung gekoppelt ist,DEVD von Substrat wird die lumineszierende Produkt freigesetzt. Diese Reaktion ist proportional zu Caspase-Aktivität und damit zur Induktion von Apoptose. Da tote Zellen nicht Caspase zu erzeugen, ist Caspase-3/7 Aktivität von Natur aus vergänglich; Analyse daher sollte zwischen 30 min bis 4 Stunden nach der Herausforderung, je nach Wirksamkeit der Zell Stressor abgeschlossen werden. Zelllebensfähigkeit ist umgekehrt proportional zu der Caspase-3/7 Aktivität und kann verwendet werden, um zu bestimmen Mechanismen des Zelltods. Beispielsweise wurde dieses Verfahren bisher verwendet worden, um diese Vorbehandlung mit dem Peptidhormon Orexin verringert die Apoptose in Zellen des Hypothalamus mit Wasserstoffperoxid in Frage, was darauf hindeutet, dass die Mechanismen durch diese Behandlung nicht betroffen sind beim Schutz gegen oxidative Schädigung 10 wichtig zu zeigen. Es ist wichtig zu beachten, diese Tests sind Zelllinie-und gewebeabhängig, wie sie verlassen sich auf die mitochondriale Aktivität Assay-Reagenzien zu reduzieren. Dieses Protokoll wurde für erwachsene Maus Hypothalamus (A12) Zellen optimiert; jedochbeschriebenen Verfahren geändert werden, um im Rahmen der Forschung ähnlich zu passen.
Multiplexing-Tests aus einer einzigen Kultur und bietet einen Vorteil gegenüber der traditionellen Methode der Durchführung einzelner Tests aus mehreren Gründen. Neben der Zeitersparnis, Zellproben, Reagenzien und Kultur kann auch Multiplex-Assays Wissen des Zellüberlebens und Tod, stellen interne Kontrollen, und die Notwendigkeit für Wiederholungsversuche 11, 12.
Alternative Methoden haben sich auf Western-Blots oder ELISAs, die zuverlässig sind Tests verlassen, sind aber teuer und zeitaufwändig (1-2 Tage), insbesondere bei der Verwendung eines 96-Well-Format. Außer der Zeit, die zur Kultivierung von Zellen für die Multiplexassay, ist die Gesamtzeit von weniger als 3 Stunden. Während dieses Protokoll wurde für die Verwendung mit A12-Zellen optimiert wurde, kann es für den Einsatz in anderen Modellen verändert werden, ohne dass dabei Faktoren, die die Integrität der Zelle beeinflussen können. AbschreckenBergbau, wenn dieses Protokoll für eine Reihe von Experimenten funktionieren würde, hängt von der Anzahl der Proben oder experimentellen Bedingungen und über geplante nachgeschalteten Experimenten.
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Protocol
1. Überzug und Pflege von Zellkultur
- Warme Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM), Kulturmedien (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin / Neomycin) bis 37 ° C
- Erhalten Lager von gefrorenen Zellen A12 von -80 ° C
- Schnell auftauen Zellen in 37 ° C Wasserbad; einmal aufgetaut, sanft Pipette Zellen auf eine 75 cm 2 entlüftet Kulturflasche übertragen und 10 ml der Kulturmedien.
- Inkubieren Kolben über Nacht in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Saugen Medien nach 24 Stunden und ersetzen mit frischen Medien. Weiterhin wachsende Zellen, bis 70-80% Konfluenz erreicht ist (2-3 Tagen Wachstum).
2. Zählen und Überzug Cells
- Warmen DMEM und 1x-Trypsin-EDTA-Lösung auf 37 ° C
- Aspirat Medien von Zellen und Waschen zweimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- Gib 500 ul Trypsin-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 2-5 min.
- TrennenZellen von der Flasche mit einem Schaber und Zellen zu suspendieren in 5 ml Medium. Pass-Zellen durch Sieb und durch Zell Sieb in einen sauberen 50-ml-Tube. Möglicherweise müssen Sie Zellen durch Sieb mehr als einmal passieren, aber nicht mehr als drei Mal zu wiederholen.
- Zählen von Zellen mit einer Zählkammer nach Menge der Zellen zu bestimmen, die Kultur in einer 96-well klar unten schwarz oder weiß ummauerten Platte in einem Gesamtvolumen von 100 ul Medium Saatgut 6.000 Zellen / gut. Inkubieren Platte in 5% CO 2 bei 37 ° C für 24 Stunden.
3. Bestimmung Zelllebensfähigkeit und Caspase-3/7 Aktivität
- PA übertragen, um eine sterile 5 ml Glasfläschchen und löslich in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO). Verdünnen Lager PA-Lösung 1:10 in DMSO und fügen Sie es DMEM vorgewärmt, um eine endgültige Arbeitskonzentration von 0,1 mM PA erhalten. Für Kontrollmedien, fügen die gleiche Konzentration an DMSO, die Medien, die PA hinzugefügt.
- Entfernen Sie die Medien in jede Vertiefung und ersetzen mit 50 ul Medien + / -PA. Inkubiere die Platte für 2 Stunden in 5% CO 2 bei 37 ° C. Daraufhin 5 ul Resazurin Reagenz und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
- Mit einem Multimode-Mikroplatten-Reader, Platten Fluoreszenz (560 EX / 590 EM) auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen. Die Ergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) dargestellt.
- Auf die gleiche Platte, fügen Sie 55 ul von Caspase-Reagenz und bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
- Auch mit Hilfe der Mikroplatten-Reader, Platten Lumineszenz Caspase-3/7 Aktivität zu messen. Die Ergebnisse sind als relative Lumineszenz-Einheiten (RLU) dargestellt, mit Lumineszenz direkt proportional zur Caspase-3/7 Aktivität.
- Um normalisieren Caspase-3/7 Aktivität Zellzahl, teilen die Lebensfähigkeit der Zellen (RFU) durch Caspase-3/7 Aktivität (RLU).
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Representative Results
Das Protokoll oben beschrieben, führt Multiplexen zwei Assays zur Bestimmung Mechanismen des Zelltods. Fig. 1 zeigt eine Übersicht über das Protokoll zur Zelllebensfähigkeit und Caspase-3/7-Aktivität zu bestimmen. Caspase-Aktivität wurde in Zellen, die mit PA nach 2 h Inkubation (Fig. 2A und Tabelle 1) in Frage deutlich erhöht. Verlust der Zellmembranintegrität ist eine morphologische Veränderung mit der Induktion von Apoptose, die nach 2 Stunden Einwirkung PA (2B) ersichtlich in Zellen assoziiert. Fig. 3 skizziert die potentielle Bahn in dem PA induziert Apoptose und zeigt die Bedeutung der Optimierung der Inkubationszeit Zeit im DEVD Reagenz.
Abbildung 1. Experimentelles Design für ein Multiplex-AssayCaspase-3/7-Aktivität zu bestimmen. Zellen werden in einer Platte mit 96 Vertiefungen 24 h geimpft und dann in Gegenwart oder Abwesenheit von PA inkubiert. Inkubationszeiten in Gegenwart von jedem Reagenz kann je nach Modell variieren. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Caspase-3/7 Aktivität nach 2 h PA Herausforderung erhöht. Hypothalamus-A12-Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 mM PA für 2 h behandelt. Caspase-3/7-Aktivität wurde in Zellen, die mit PA (p <0,01) behandelt, deutlich erhöht. Integrität der Zellmembran sichtbar in der Gegenwart von PA verloren. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. 
Abbildung 3. Mögliche Weg von PA-induzierten Zelltod. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
| Kontrolle | 0,1 mM PA | ||||
| Lebensfähige Zellen | Caspase 3/7 | Verhältnis | Lebensfähige Zellen | Caspase 3/7 | Verhältnis |
| Fluoreszenz (560 EX / 590 EM) | Lumineszenz-650 nm-Spitze | Caspase / lebensfähigen Zellen | Fluoreszenz (560 EX / 590 EM) | Lumineszenz-650 nm-Spitze | Caspase / Lebensfähige CEllen |
| 1951,8 | 45,488 | 0,023305667 | 808,78 | 16,731 | 0,020686713 |
| 1647,0 | 46,011 | 0,027936248 | 788,84 | 22,080 | 0,027990467 |
| 1911,0 | 34,508 | 0,018057561 | 777,68 | 28,234 | 0,036305421 |
| 1792,5 | 14,183 | 0,007912413 | 807,45 | 20,457 | 0,025335315 |
| 1965,7 | 19,868 | 0,010107341 | 829,14 | 17,777 | 0,021440288 |
| 1803,0 | 20,229 | 0,011219634 | 742,35 | 29,280 | 0,039442312 |
| 1804,8 | 27,188 | 0,015064273 | 761,77 | 17,777 | 0,023336440 |
| 1890,1 | 40,7825 | 0,021576901 | 756,66 | 20,914 | 0,027639891 |
Tabelle 1. Beispiel der gesammelten Daten und berechneten Verhältnisse.
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Discussion
Das Multiplex-Assay ist ein gut anerkanntes Verfahren, die von Wissenschaftlern in zahlreichen Anwendungen wie PCR-Mikroarrays, Immun und andere Protein-basierten Nachweismethoden 13, 14 verwendet wurde. Kürzlich, Multiplexing-Tests haben sich in den in-vitro-Platte-basierte Experimente zunehmend genutzt und haben als eine genaue Methode zur Bewertung der Zytotoxizität validiert und Lebensfähigkeit 12. In dem obigen Protokoll zeigen wir die Wirksamkeit der Multiplex-Fluoreszenz-und Lumineszenz-Assays zur Caspase-3/7 Aktivität und die Lebensfähigkeit der Zellen in A12-Zellen nach PA Herausforderung zu bestimmen. Lebensfähigkeit der Zellen wurde innerhalb von 10 min von Anfangs PA Beleidigung ermittelt, so dass für eine schnelle und zuverlässige Darstellung der lebensfähigen Zellen. Es sei darauf hingewiesen, dass die rezasurin-Reagens ist ein Lebendzell-Assay, der für die weitere Endpunkte gemessen werden können; jedoch, die Optimierung der Inkubationszeit auf Caspase-3/7 Aktivität zu bestimmen ist essential um brauchbare Ergebnisse zu erhalten 15.
Apoptose kann durch externe Reize, interne Zellensignale und Oberflächenrezeptoren, was zu deutlichen morphologischen und biochemischen Ereignisse aktiviert werden. Erhöhte Caspase-3-Aktivität, DNA-Fragmentierung, Verlust der Integrität der Zellmembran, Chromatin-Kondensation und Poly (ADP-Ribose)-Polymerase (PARP) Spaltung sind einige spezifische Marker der Apoptose, die untersucht werden kann 16. Aktivierung von Caspase 3 und 7 sind primäre Modulatoren der Apoptose, so dass sie wesentlich Marker in der pharmakologischen Manipulationen zu verringern apoptotischen Schaden 17 ausgerichtet beurteilen. Zellen, die eine Apoptose verlängert wird schließlich unterziehen sekundären Nekrose, beobachtbaren durch Zell-Lyse, unterstreicht die Bedeutung der Wahl eines geeigneten Zeitrahmen, um Caspase-3/7 Aktivität 11 bestimmen. Wie zuvor erwähnt, ist Caspase-3/7 transiente Aktivität; daher je nach Wirksamkeit der Zellstressfaktor, Bestimmung thE geeigneten Zeitpunkt zu Caspase-Aktivität zu testen kann einige Mühe. Außerdem sind die wichtigsten Einschränkungen für unsere Multiplex-Protokoll, dass Caspase-3/7 Aktivität bestimmt, aber nicht quantifiziert, und das resultierende Lysat kann nicht für nachfolgende Assays (zB Western-Blots oder Genexpression) verwendet werden.
Verständnis Eigenschaften des Zellzyklus von dem gewählten Modell und wie sie an bestimmte Belastungen bei der Anwendung dieser Technik zu reagieren, ist wichtig, um gültige Ergebnisse zu erhalten. Weitere Überlegungen bei der Planung von Studien, die prüft, apoptotischen Signalwege sind: 1) die Bestimmung der angemessenen Dichte der Zellen, die pro Well ausgesät werden; 2) Konzentration und Inkubation der Stressor oder Drogen verwendet werden; und 3) die entsprechende Inkubationszeit für die in einem Test verwendeten Reagenzien. Die fehlende Standardisierung oder von Vorstudien, die diese Überlegungen Adresse wird in der Regel zu fehlerhaften Daten führen. Die Zeit und Mühe zur Standardisierung thE-Multiplexing-Test beschreiben wir hier eine wertvolle, zuverlässige und zeitsparende Technik für die apoptotische 10 Studien.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Die hier beschriebene Arbeit wurde durch das US Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory Forschung und Entwicklung BX001686-1A1 und VA Rehabilitation Forschung und Entwicklung finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
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