Summary
멀티 플렉스 분석은 기본 세포 메커니즘에 대한 유익한 정보를 제공하고 시약 및 불필요한 반복 실험의 낭비를 제거 할 수 있습니다. 우리는 팔 미트 산으로 산화 반칙으로 체외 시상 하부 모델에서 세포 생존을 결정하기 위해, 형광 및 발광 기반의 방법을 사용하여, 여기에 멀티 플렉스 카스파 3 / 7 활동 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
복잡한 세포 메커니즘의 연구에서 분석을 다중화하는 능력은, 반복적 인 실험의 필요성을 없애 내부 제어를 제공하고, 비용 및 시약에 폐기물을 감소시킨다. 여기에서 우리는 96 - 웰에서 생존 세포 수와 카스파 제 3 / 7 활성을 측정하기 위해 기반 분석법을 형광체 및 발광을 모두 사용하여, 시험 관내 시상 모델의 팔 미트 산 (PA)의 반칙 아폽토시스를 평가하기 위해 멀티 플렉스 분석의 최적화를 설명 마이크로 플레이트 형식입니다. PA의 반칙으로, 가능한 세포는 레사 주린 기반의 형광 분석에 의해 결정되었다. 카스파 제 3 / 7 활성은 luminogenic 기판 DEVD 및 세포 수로 정규화를 사용하여 측정 한 다음이었다. 이 다중 분석법은 포화 지방산 도전으로 사멸 자극, 다음 카스파 제 활성의 변화를 결정하기위한 유용한 기술이다. 포화 지방산 PA는 잠재적 importa을 나타내는 시상 산화 스트레스 및 세포 사멸을 증가시킬 수있다예컨대 그와 같은 분석법의 NCE은 포화 지방산과의 연결 기능 사이의 관계를 연구하는 기재.
Introduction
팔 미트 산 (PA) 등의 포화 지방산이 풍부한 다이어트는 비만과 심장 혈관 질환과 당뇨병 1, 2 등 다른 동반 질환에 연결되어있다. 고지방 사료 또한 산화 스트레스, 아폽토시스 및 시상 하부 신경 변성, 식욕 및 에너지 비용 3-7의 중요한 레귤레이터를 증가하는 것으로 나타났다. 높은 지방 다이어트 노출 시상 하부 조절 장애를 유발 통해 메커니즘을 이해하는 것은 비만에 대한 약물 치료의 발전을 위해 이렇게 중요합니다. 그러나,식이 지방이 신경 세포의 기능에 영향을 미치는 통해 세포 메커니즘은 불분명하다. 이러한 PA 등의 지방이 시상 하부의 세포 사멸 경로의 발병을 유발하는 방법의 더 나은 이해는이 목표를 향해 필요한 첫 번째 단계입니다. 이 문서의 목적은 시간의 연구에 사용하기 위해 개발 PA 노출에 신경 반응의 시험관 테스트를위한 다중 분석을 설명하는 것입니다ypothalamic 신경 퇴행. 우리는 PA 8 산화 공격 후 (A12)의 이용 차별화 된 불후의 성인 마우스 시상 하부 세포주에서 세포의 총 수 당 3 / 7 활동 카스파를 측정하기위한 시험 관내 96 - 웰 형식의 멀티 플렉스 분석에 대한 자세한 설명을 제공한다.
간단히, 세포 생존 능력은 레사 주린 기반 분석을 통해 PA의 반칙으로 결정된다. 레사 주린은 대사 활성 세포에있는 효소의 감소를 겪는 세포 투과성 화합물, 생각 프로세스는 미토콘드리아 (9)를 통해 발생합니다. 생존 세포는 지속적으로 생존 세포의 수에 비례하여 형광 신호를 생성하는, 레조 루핀 (resorufin) 레사 주린하는 변환. 카스파 제 3 / 7 활성은 다음 DEVD lumogenic 기반 분석을 사용하여 분석된다. DEVD는 카스파 제 -3에 의해 절단 아미노산 서열 (ASP-글루 - 발-ASP)이다. 이 서열은 세포 내 카스파 3 / 7의 활성화 및 후속 절단시 lumogenic 물질에 결합되면DEVD 기판으로, 발광 제품이 해제됩니다. 이 반응은 카스파 제 활성에 따라서 세포 자멸사의 유도에 비례한다. 사균은 카스파 제를 생산할 수 없기 때문에, 카스파 제 3 / 7 활성은 천연 과도로이고; 따라서 분석은 세포 스트레스의 효과에 따라, 4 시간 후 - 도전 30 분 사이에 완료되어야한다. 세포 생존율은 카스파 제 3 / 7 활성에 반비례하고 세포 사멸의 메카니즘을 결정하는데 사용될 수있다. 예를 들어,이 방법은 이전에 오렉신이 처리에 의해 영향을받는 메커니즘이 산화 손상 (10)에 대한 보호에 중요하다는 것을 시사 과산화수소 도전 시상 세포에서 세포 사멸을 감소 펩타이드 호르몬이 전처리를 표시하는 데 사용되었다. 그것은 그들이 분석 시약을 줄이기 위해 미토콘드리아 활성에 의존하는 이러한 어 세이는 세포주 및 조직 의존하는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 성인 마우스의 시상 하부 (A12) 셀에 최적화되어 있습니다; 그러나,기재된 방법은 유사한 연구의 범위에 맞도록 변경 될 수있다.
단일 문화권에서 다중화 분석법 확실히 여러 가지 이유로 개별 분석을 수행하는 기존의 방법보다 이점을 제공한다. 시간, 세포 샘플 및 배양 시약을 저장하는 것 외에도, 다중화 분석법은 또한, 세포의 생존 및 사망의 지식을 제공 내부 제어를 제공하고, 반복적 인 실험 11, 12에 대한 필요성을 제거 할 수있다.
다른 방법은 96 - 웰 형식을 사용하여 특히, 신뢰할 수있는 분석이다 서양 말이나 ELISA를,에 의존하지만, 비용과 시간이 많이 소요 (1-2 일간)입니다있다. 이 다중화 분석을위한 세포 배양에 소요되는 시간을 제외하고, 전체 시간은 3 시간 미만이다. 이 프로토콜은 A12 세포와 함께 사용하기 위해 최적화되어 있지만 셀의 무결성에 영향을 미칠 수있는 요인 염두에 유지하면서, 다른 모델에서 사용하기 위해 변경 될 수있다. 제지이 프로토콜은 일련의 실험을 위해 일하면 마이닝은 샘플이나 실험 조건의 수에 계획된 다운 스트림 실험에 따라 달라집니다.
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Protocol
세포 배양 1. 도금 및 유지
- 따뜻한 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM) 배지 (DMEM + 10 % FBS + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 네오 마이신) 37 ° C까지
- -80 ° C.에서 냉동 A12 세포의 주식을 확보
- 빠른 속도로 37 ° C의 물을 욕조에 세포를 해동; 한 번 해동, 부드럽게 피펫 세포는 75cm 2 배출 문화 플라스크에 전송하고 배양 배지 10 ㎖를 추가 할 수 있습니다.
- 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 플라스크 하룻밤을 품어 미디어를 대기음 24 시간 후 신선한 용지로 교체합니다. 70-80% 합류는 (2 ~ 3 일 성장)을 얻을 때까지 세포 성장을 계속합니다.
2. 계수 및 도금 세포
- 따뜻한 DMEM 37 ° C.에 1X-트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션
- 세포와 미디어를 대기음은 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 2 회 세척한다.
- 트립신 용액 500 μl를 추가하고 2-5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- 분리스크레이퍼를 사용하여 미디어의 5 ML에있는 세포를 일시 중단 플라스크의 세포. 스트레이너를 통해 세포에 전달하고 깨끗한 50 ㎖ 튜브에 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 한 번 이상 스트레이너를 통해 세포를 통과 할 필요가 있습니다 만, 3 회 이상 반복하지 않습니다.
- 미디어 100 μL의 최종 볼륨의 96 - 웰 분명 바닥 검은 색이나 흰색 벽으로 둘러싸인 플레이트에 6,000 세포 / 웰 시드 문화에 세포의 양을 결정하는 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 24 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 판을 품어.
3. 세포 생존과 카스파 3 / 7 활동을 결정
- 살균 5 ㎖의 유리제 바이알에 PA를 전송하고 100 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 용해. DMSO의 주식 PA 솔루션 1:10 희석하고 0.1 ㎜ PA의 최종 작업 농도를 얻기 위해 DMEM을 데워진에 추가합니다. 제어 매체의 경우, PA를 포함하는 미디어에 추가됩니다 DMSO의 동일한 농도를 추가합니다.
- 물론 각각의 용지를 제거하고로 교체 50 μL 미디어 + / -PA. 37 ° C에서 5 % CO 2에서 2 시간 동안 접시를 품어 이어서 5 μL의 레사 주린 시약을 추가하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다.
- 세포 생존 능력을 측정하기 위해 멀티 모드 마이크로 플레이트 판독기, 형광 기록 (560 EX / 590 EM) 사용. 결과는 상대 형광 단위 (RFU)으로 표시하고 있습니다.
- 같은 판에, 카스파 시약의 55 μl를 추가하고 실온에서 2 시간 동안 배양한다.
- 다시 카스파 3 / 7 활성을 측정하기 위해 마이크로 플레이트 리더, 기록 발광을 사용. 결과는 카스파 3 / 7 활동에 직접적으로 비례 발광으로, 상대의 발광 장치 (RLU)로 표현된다.
- , 세포 수에 카스파 제 3 / 7 활동을 정상화 카스파 3 / 7 활동 (RLU)에 의해 세포 생존 능력 (RFU)를 나눕니다.
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Representative Results
프로토콜은 위 세포 죽음의 메커니즘을 결정하는 다중 두 개의 분석 결과를 설명합니다. 그림 1 세포 생존 및 카스파 제 3 / 7 활동을 결정하는 프로토콜에 대한 개요를 보여줍니다. 카스파의 활동은 크게 2 시간 배양 (그림 2A 표 1) 후 PA에 도전 세포에서 증가했다. 세포막의 무결성의 손실은 PA (그림 2B)에 2 시간 노출 후 세포에서 명백한 세포 사멸 유도와 관련된 형태 학적 변화이다. 그림 3은 PA가 세포 사멸을 유도 배양 최적화의 중요성을 설명하는 잠재적 인 경로를 설명 DEVD 시약의 시간.
그림 1. 멀티 플렉스 분석을위한 실험 설계카스파 제 3 / 7 활성을 측정하기. 세포를 24 시간 동안 96 - 웰 플레이트에 접종 한 후 PA의 존재 또는 부재하에 인큐베이션된다. 각 시약의 존재 배양 시간은 모델에 따라 다를 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 카스파 3 / 7 활동이 2 시간의 PA의 반칙으로 증가한다. 시상 하부 A12 셀은 2 시간 동안 0.1 ㎜ PA의 존재 또는 부재에 처리 하였다. 카스파 제 3 / 7 활성은 크게 PA (p <0.01)으로 처리 된 세포에서 증가 하였다. 세포막의 무결성은 눈에 띄게 PA의 존재에 손실됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 3. PA에 의한 세포 죽음의 잠재적 인 통로. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 제어 | 0.1 ㎜ PA | ||||
| 가능한 세포 | 카스파 3 / 7 | 비 | 가능한 세포 | 카스파 3 / 7 | 비 |
| 형광 (560 EX / 590 EM) | 650 nm의 피크 발광 | 카스파 / 가능한 세포 | 형광 (560 EX / 590 EM) | 650 nm의 피크 발광 | 카스파 / 실행 가능한 CELL 학생 |
| 1951.8 | 45.488 | 0.023305667 | 808.78 | 16.731 | 0.020686713 |
| 1647.0 | 46.011 | 0.027936248 | 788.84 | 22.080 | 0.027990467 |
| 1911.0 | 34.508 | 0.018057561 | 777.68 | 28.234 | 0.036305421 |
| 1792.5 | 14.183 | 0.007912413 | 807.45 | 20.457 | 0.025335315 |
| 1965.7 | 19.868 | 0.010107341 | 829.14 | 17.777 | 0.021440288 |
| 1803.0 | 20.229 | 0.011219634 | 742.35 | 29.280 | 0.039442312 |
| 1804.8 | 27.188 | 0.015064273 | 761.77 | 17.777 | 0.023336440 |
| 1890.1 | 40.7825 | 0.021576901 | 756.66 | 20.914 | 0.027639891 |
수집 된 데이터와 계산 된 비율 표 1. 예.
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Discussion
멀티 플렉스 분석은 PCR 마이크로 어레이, 면역 및 기타 단백질 기반 검출 방법 13, 14 등 다양한 응용 프로그램에서 과학자들에 의해 사용 된 잘 받아 기술이다. 최근, 다중 분석이 점점 체외 플레이트 기반의 실험에 이용하고 세포 독성을 평가하는 정확한 방법으로 검증하고 12 생존 한되었다. 위의 프로토콜에서는, 우리는 PA의 반칙으로 A12 세포에서 카스파 제 3 / 7 활동과 세포 생존을 결정하는 다중 형광 및 발광 분석법의 효과를 보여줍니다. 세포 생존이 가능한 세포의 신속하고 신뢰할 수있는 표현을 허용, 초기 PA 모욕의 10 분 이내에 결정 하였다. 그것은 rezasurin 기반 시약 측정 할 상기 끝점을 허용 생균 분석법임을 주목해야한다; 그러나, 카스파 제 3 / 7 활성을 측정하기 배양 시간을 최적화 된 essentia입니다유용한 결과 15를 얻기 위해 L.
아폽토시스는 외부 자극, 전지 내부 신호와 구별되는 형태 학적 및 생화학 적 사건의 결과로 표면 수용체에 의해 활성화 될 수있다. 카스파 제 3 활동, DNA 단편화, 세포막의 무결성의 손실, 염색질 응축 및 폴리 증가 (ADP-리보스) 중합 효소 (PARP) 분열 (16)를 조사 할 수있는 세포 사멸의 일부 특정 마커입니다. 카스파 제 3과 7의 활성화는 세포 사멸 손상 17를 감소하기위한 약리 조작에 평가하는 그들에게 필수적인 마커를 만들고, 세포 사멸의 주 변조기이다. 장기간 사멸을 겪는 세포는 결국 카스파 3 / 7 (11)의 활동을 결정하기 위해 적절한 시간 프레임 선택의 중요성을 강조하고, 세포 용해에 의한 관찰 이차 괴사를 거칠 것이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 카스파 3 / 7 활동은 일시적인; 따라서, 결정, 세포 스트레스의 효과에 따라 일카스파 활동을 분석 실험에 전자 적절한 타이밍은 어떤 노력을 할 수 있습니다. 또한 우리의 다중 프로토콜을위한 주요 제한은 카스파 제 3 / 7 활성은 결정되지만 정량화하지, 얻어진 파쇄물은 하류 분석법 (즉 서부 말 또는 유전자 발현)에 사용할 수없는 것을 수있다.
셀 선택 모델의주기 및 방법이 기술을 적용했을 때 지정된 스트레스에 응답 할 수있는 특성을 이해하는 것은 유효한 결과를 얻는 것이 중요합니다. 평가합니다 연구를 계획 할 때 추가 고려 사항 세포 사멸 경로는 다음과 같습니다 : 1) 잘마다 씨앗을 품고있다 세포의 적절한 밀도를 결정하는 단계; 2) 농도와 사용 된 스트레스 나 약물의 배양; 3) 시험에 사용 된 시약에 대한 적절한 배양 시간을. 표준화 또는 이러한 고려 사항을 해결 예비 연구의 부족은 일반적으로 데이터 오류가 발생합니다. 회를 표준화하는 데 시간과 노력우리가 여기에서 설명하는 전자 다중화 분석은 세포 사멸 연구 10, 가치, 신뢰성, 시간 절약 기술을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
여기에 설명 된 작업은 재향 군인의 업무의 미국학과 생물 의학 연구소 연구 개발 BX001686-1A1와 VA 재활 연구 및 개발에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
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