Summary
Multiplex-analyser kan ge bra information om grundläggande cellulära mekanismer och eliminera slöseri med reagenser och onödiga upprepade experiment. Vi beskriver här en multiplex-kaspas-3/7 aktivitetsanalys, genom att använda fluorescens och luminiscerande baserade metoder, för att bestämma cellviabilitet i en in vitro hypotalamisk modell följande oxidativa utmaning med palmitinsyra.
Abstract
Förmågan att multiplexa analyser i studier av komplexa cellulära mekanismer eliminerar behovet av upprepade experiment, ger den interna kontrollen, och minskar avfallet i kostnader och reagenser. Här beskriver vi en optimering av en multiplex-analys för att bedöma apoptos efter en palmitinsyra (PA) utmaning i en in vitro hypotalamisk modell, med användning av både fluorescerande och luminiscerande baserade analyser för att mäta livskraftiga celler och kaspas-3/7-aktivitet i en 96-brunnars mikrotiterplattformat. Efter PA utmaning, var livsdugliga celler bestäms av en resazurin baserat fluorescerande analys. Caspas-3/7 aktivitet var då bestämmas med hjälp av en luminogena substrat, DEVD, och normaliserade till cell nummer. Denna multiplexering analys är en användbar teknik för att bestämma förändringen av kaspas-aktivitet efter en apoptotisk stimulans, såsom mättad fettsyra utmaning. Den mättade fettsyror PA kan öka hypotalamus oxidativ stress och apoptos, vilket indikerar den potentiella importiou av analyser, såsom den som beskrivs här för att studera förhållandet mellan mättade fettsyror och neuronal funktion.
Introduction
Kost rik på mättade fettsyror såsom palmitinsyra (PA) har kopplats till fetma och andra sjukdomstillstånd, bland annat hjärt-och kärlsjukdomar och diabetes 1, 2. Fettrik kost har också visat sig öka oxidativ stress, apoptos, och neuronal degenerering i hypotalamus, en viktig regulator av aptit och energiförbrukning 3-7. Att förstå den mekanism genom vilken fettrik kost exponering inducerar hypotalamus dysregulation är därför viktigt för utvecklingen av farmakologiska behandlingar för fetma. Men de cellulära mekanismer som fett påverkar neuronal funktion fortfarande oklara. En bättre förståelse för hur fett liksom PA kan utlösa uppkomsten av hypotalamus apoptotiska vägar är ett nödvändigt första steg mot detta mål. Målet med denna artikel är att beskriva en multiplex analys för in vitro-testning av neuronal svar på PA-exponering, som utvecklats för att användas i studier av hypothalamic neurodegeneration. Vi tillhandahåller en detaljerad beskrivning av en in vitro-96-brunnsformat multiplex-analys för att mäta kaspas 3/7 aktivitet per totala antalet celler i ett differentierat immortaliserad vuxen mus hypotalamisk cellinje (betecknad A12) efter oxidativ utmaning med PA 8.
I korthet är cellviabiliteten bestäms efter PA utmaning via en resazurin baserad analys. Resazurin är en cell permeabel förening som undergår enzymatisk reduktion i metaboliskt aktiva celler, ett förfarande tros ske via mitokondrierna 9. Viabla celler omvandlar kontinuerligt resazurin till resorufin, som producerar en fluorescerande signal som är proportionell mot antalet viabla celler. Caspas-3/7 aktivitet analyseras sedan med användning av ett DEVD-baserad lumogenic assay. DEVD är en aminosyrasekvens (Asp-Glu-Val-Asp) klyvs av kaspas-3. När denna sekvens är kopplad till en lumogenic ämne, vid aktivering av intracellulär kaspas-3/7 och efterföljande klyvningav DEVD substrat, är den självlysande produkten släpps. Denna reaktion är proportionell mot kaspas-aktivitet och därmed till induktionen av apoptos. Som döda celler inte kan producera kaspas är kaspas-3/7 aktivitet av naturen övergående; Därför analys bör kompletteras mellan 30 minuter till 4 timmar efter utmaning, beroende på effektiviteten i cellstressfaktor. Cellviabilitet är omvänt proportionell mot kaspas-3/7-aktivitet och kan användas för att bestämma mekanismen av celldöd. Exempelvis har denna metod som tidigare använts för att visa att förbehandling med peptidhormonet orexin minskar apoptos i hypotalamiska celler utmanade med väteperoxid, vilket tyder på att mekanismer som påverkas av denna behandling är viktiga för att skydda mot oxidativ skada 10. Det är viktigt att notera dessa analyser är cellinje-och vävnadsberoende, eftersom de förlitar sig på mitokondriell aktivitet att minska analysreagens. Detta protokoll har optimerats för vuxen mus hypothalamus (A12)-celler; dockbeskrivna metoderna kan ändras för att passa inom ramen för liknande forskning.
Multiplexing analyser från en enda odlingsbrunn erbjuder en fördel jämfört med den traditionella metoden för att utföra individuella analyser av flera skäl. Förutom att spara tid, cellprover och reagens kultur, kan multiplexering analyser också ge kunskap om cellöverlevnad och död, ge intern kontroll, och eliminerar behovet av upprepade experiment 11, 12.
Alternativa metoder har förlitat oss på Western-blottar eller ELISA, som är tillförlitliga analyser, men är dyra och tidskrävande (1-2 dagar), i synnerhet vid användning av en 96-brunnsformat. Med undantag av den tid det tar att odla celler för multiplexering analys är den totala tid mindre än 3 timmar. Även om detta protokoll har optimerats för användning med A12-celler, kan det ändras för att användas i andra modeller och samtidigt tänka på faktorer som kan påverka cellernas integritet. Detergruvdrift om detta protokoll skulle fungera för en serie experiment beror på antalet prover eller experimentella förhållanden och på efterföljande experiment planeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating och underhåll av cellodling
- Varm Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) odlingsmedium (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin / streptomycin / Neomycin) till 37 ° C.
- Skaffa lager av frysta A12 celler från -80 ° C.
- Snabbt tina celler i 37 ° C vattenbad; gång tinats, försiktigt pipett celler att överföra till en 75 cm 2 ventilerade odlingskolv och tillsätt 10 ml odlingsmedia.
- Inkubera kolv över natt i 5% CO2 inkubator vid 37 ° C. Aspirera media efter 24 timmar och ersätta med nya medier. Fortsätt att odla celler till 70-80% sammanflödet erhålls (2-3 dagar tillväxt).
2. Räkna och Plating celler
- Varm DMEM och 1x-trypsin-EDTA-lösning till 37 ° C.
- Aspirera medium från celler och tvätta två gånger med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Addera 500 pl av trypsin-lösning och inkubera vid 37 ° C under 2-5 min.
- Lossacellerna från kolven med användning av en skrapa och suspendera celler i 5 ml medium. Passera celler genom sil och passera genom cell sil i en ren 50 ml tub. Kan behöva passera celler genom sil mer än en gång, men inte upprepas mer än tre gånger.
- Räkna celler med en hemocytometer för att bestämma mängden av celler till odling för att ympa 6000 celler / brunn i en 96-brunnars klar botten svart eller vitt walled plattan i en slutvolym av 100 | il medium. Inkubera plattan i 5% CO2 vid 37 ° C under 24 timmar.
3. Fastställande Cellviabilitet och kaspas-3/7 Activity
- Överför PA till en steril 5 ml glasampuU och solubilisera i 100% dimetylsulfoxid (DMSO). Späd lager PA-lösning 01:10 i DMSO och lägga till förvärmd DMEM att erhålla en slutlig arbetskoncentration av 0,1 mM PA. För kontrollmedier, lägga till samma koncentration av DMSO som läggs till media som innehåller PA.
- Ta bort materialet i varje brunn och ersätt med 50 jul medier + / -PA. Inkubera plattan under 2 h i 5% CO2 vid 37 ° C. Tillsätt sedan 5 l resazurin reagens och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Med hjälp av en multimikroplattläsare, rekord fluorescens (560 EX / 590 EM) för att mäta cellernas livskraft. Resultaten presenteras som relativa fluorescensenheter (RFU).
- Till samma plattan, tillsätt 55 | il av kaspas-reagens och inkubera vid rumstemperatur under 2 timmar.
- Återigen med användning av mikroplattläsare, skiv luminiscensen för att mäta kaspas-3/7 aktivitet. Resultaten presenteras som relativa luminiscens heter (RLU), med luminiscens direkt proportionell mot kaspas-3/7 aktivitet.
- Att normalisera kaspas-3/7 aktivitet till celltal, dela cellviabiliteten (RFU) av kaspas-3/7 aktivitet (RLU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet ovan beskriver resultat i multiplexering två separata analyser för att fastställa mekanismer för celldöd. Figur 1 visar en översikt av protokollet för att bestämma cellviabiliteten och caspase-3/7 aktivitet. Caspase-aktivitet ökade signifikant i celler utmanades med PA efter 2 h inkubation (Figur 2A och tabell 1). Förlust av cellmembranintegritet är en morfologisk förändring i samband med framkallande av apoptos, vilket framgår i celler efter 2 h exponering för PA (Figur 2B) Figur. 3 beskriver den potentiella vägen där PA inducerar apoptos och visar betydelsen av att optimera inkubation tid i DEVD reagenset.
Figur 1. Experimentell design för en multiplex-analysatt bestämma kaspas-3/7 aktivitet. Celler sås i en 96-brunnsplatta under 24 timmar och inkuberades sedan i närvaro eller frånvaro av PA. Inkubationstider i närvaro av varje reagens kan variera beroende på modell. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Caspas-3/7-aktivitet ökade efter 2 hr PA utmaning. Hypothalamic A12-celler behandlades i närvaro eller frånvaro av 0,1 mM PA under 2 timmar. Caspas-3/7 aktivitet ökade signifikant hos celler behandlade med PA (p <0,01). Cellmembranintegritet är synligt förlorad i närvaro av PA. Klicka här för att visa en större bild. 
Figur 3. Potentiella vägen för PA inducerad celldöd. Klicka här för att visa en större bild.
| Kontroll | 0,1 mM PA | ||||
| Viabla celler | Caspase 3/7 | förhållande | Viabla celler | Caspase 3/7 | förhållande |
| Fluorescens (560 EX / 590 EM) | Luminiscens 650 nm topp | Kaspas / levande celler | Fluorescens (560 EX / 590 EM) | Luminiscens 650 nm topp | Caspas / Livskraftiga Calnar |
| 1951,8 | 45,488 | 0,023305667 | 808,78 | 16,731 | 0,020686713 |
| 1647,0 | 46,011 | 0,027936248 | 788,84 | 22,080 | 0,027990467 |
| 1911,0 | 34,508 | 0,018057561 | 777,68 | 28,234 | 0,036305421 |
| 1792,5 | 14,183 | 0,007912413 | 807,45 | 20,457 | 0,025335315 |
| 1965,7 | 19,868 | 0,010107341 | 829,14 | 17,777 | 0,021440288 |
| 1803,0 | 20,229 | 0,011219634 | 742,35 | 29,280 | 0,039442312 |
| 1804,8 | 27,188 | 0,015064273 | 761,77 | 17,777 | 0,023336440 |
| 1890,1 | 40,7825 | 0,021576901 | 756,66 | 20,914 | 0,027639891 |
Tabell 1. Exempel på insamlade data och beräknade nyckeltal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den multiplex analys är en väl accepterad teknik som har använts av forskare i ett flertal applikationer som PCR-microarrays, immunodetection och andra proteinbaserade detektionsmetoder 13, 14. Nyligen har multiplexering analyser blivit alltmer utnyttjas i in vitro plattbaserade experiment och har validerats som en säker metod för att bedöma cytotoxicitet och viabilitet 12. I ovanstående protokoll, visar vi hur effektiv multiplexering lysrör och självlysande analyser för att bestämma caspase-3/7 aktivitet och cellviabiliteten i A12 celler efter PA utmaning. Cellernas livsduglighet bestämdes inom 10 min av initiala PA insult, vilket möjliggör en snabb och tillförlitlig representation av viabla celler. Det bör noteras att den rezasurin baserade reagens är ett levande cellanalys som möjliggör ytterligare slutpunkter som skall mätas; emellertid optimera inkubationstiden för att bestämma kaspas-3/7 aktivitet är essential för att få användbara resultat 15.
Apoptos kan aktiveras av externa stimuli, interna cellsignaler och ytreceptorer leder till distinkta morfologiska och biokemiska händelser. Ökade kaspas 3-aktivitet, DNA-fragmentation, förlust av cellmembranintegritet, kromatin kondensation och poly (ADP-ribos)-polymeras (PARP)-klyvning finns några specifika markörer för apoptos som kan undersökas 16. Aktivering av kaspas 3 och 7 är primära modulatorer av apoptos, vilket gör dem viktiga markörer för att bedöma i farmakologiska manipulationer som syftar till att minska apoptotiska skada 17. Celler som genomgår långvarig apoptos kommer så småningom att genomgå sekundär nekros, observeras av cell-lys, understryker vikten av att välja en lämplig tidsram för att bestämma caspase-3/7 aktivitet 11. Såsom tidigare nämnts är kaspas-3/7 aktivitet transient; därför, beroende på effektiviteten i cellstressfaktor, bestämma the lämplig tidpunkt för analys caspase aktivitet kan ta lite ansträngning. Dessutom är de huvudsakliga begränsningarna för vår multiplexering protokollet är att kaspas-3/7 aktivitet kan bestämmas, men inte kvantitativt, och det resulterande lysatet kan inte användas för efterföljande analyser (t.ex. Western blöt eller genuttryck).
Förstå egenskaper för cellcykeln för den valda modellen och hur den skulle kunna svara på utsedda stressorer vid tillämpningen av denna teknik är avgörande för att erhålla giltiga resultat. Ytterligare överväganden vid planering av studier som ska utvärdera apoptotiska vägar är: 1) att bestämma lämplig täthet av celler som är seedade per brunn; 2)-koncentration och inkubering av stressfaktor eller läkemedel som används; och 3) den lämpliga inkuberingstiden för de reagens som används i en analys. Bristen på standardisering eller förstudier som tar dessa överväganden kommer i allmänhet att resultera i felaktiga uppgifter. Den tid och ansträngning som används för att standardisera the multiplexering analys beskriver vi här ger en värdefull, tillförlitlig och tidsbesparande teknik för apoptotiska studier 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Arbetet beskrivs här har finansierats av US Department of Veterans Affairs Biomedicinsk laboratorie forskning och utveckling BX001686-1A1 och VA rehabiliteringsforskning och utveckling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
- Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
- Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
- Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
- Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
- Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
- Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
- Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
