Introduction
في هذا البروتوكول، ونحن تصف أساليب فعالة لكبح الجينات في خطوط خلايا البلاعم الماوس باستخدام الرناوات siRNAs ورصد آثار هذه العلاجات على الاستجابة المناعية الفطرية. يتم تنفيذ هذه الإجراءات في شكل 96-جيدا، مما يسمح للشاشات رني في متوسطة أو عالية الإنتاجية الموضة.
ردا على إصابة البشر جبل الاستجابة المناعية الفطرية الفورية واستجابة أبطأ ولكن أكثر تحديدا المناعة التكيفية. وتتضمن هذه الاستجابة المناعية الفطرية السريعة تجنيد وتنشيط الخلايا المناعية الفطرية أكلة بما في ذلك الضامة 1. وتشارك الضامة تفعيلها كلاسيكي في الاستجابات الالتهابية الحادة وتنتج البروتينات المضادة للميكروبات والمركبات، والسيتوكينات كيموكينات، ومستضدات موجودة 2،3. الضامة تفعيلها بدلا من ذلك تلعب دورا في تنظيم الحصانة، والحفاظ على التسامح وإصلاح الأنسجة والتئام الجروح 4-8. بسبب طائفة واسعة من الوظائف الخاصةيمكن الضامة تلعب دورا في العديد من الأمراض بما في ذلك تصلب الشرايين والتهاب المفاصل والسرطان 9. وبالتالي، فإن دراسة الضامة مجالا رئيسيا للبحوث لبعض الوقت في طائفة واسعة من المجالات المرض.
على الرغم من أهميتها في الاستجابة المناعية الفطرية، الضامة يمكن أن يكون تحديا خلايا للعمل مع. على وجه الخصوص، فمن الصعب الحصول على ترنسفكأيشن كفاءة استخدام الكواشف الدهون في الضامة دون سمية المرتبطة 10،11. وعلاوة على ذلك، حتى عندما يتم تسليم سيرنا بكفاءة لالضامة، متانة الجين رني الناجم عن ضربة قاضية في كثير من الأحيان يمكن أن يكون معتدلا إلى حد ما ويمكن أن تختلف من الجينات إلى الجين.
للتغلب على هذه التحديات التقنية، قمنا الأمثل ترنسفكأيشن وتقنيات ضربة قاضية 12-16 في اثنين من خطوط الخلايا الماوس بلعم، RAW264.7 17 و 18 J774A.1. يستخدم هذا النهج AMAXA Nucleofector 96-جيدا نظام المكوك لترنسفكأيشن. هذا النظاميستخدم مزيجا من المواد الكيميائية المتخصصة و electroporation لبالنقل الخلايا في شكل 96-جيدا 19. بعد ترنسفكأيشن، نحن تصف الأساليب لتعظيم الانتعاش الخلايا وقدرتها على البقاء وتعظيم اللاحقة التي يسببها سيرنا ضربة قاضية الجينات. لتوضيح فائدة هذا النهج، نحن تصف بروتوكول للتسليم سيرنا على هذه السطور خلية بلعم، وتحفيز هذه الخلايا مع عديد السكاريد الشحمي (بي إس)، ومراقبة الاستجابة المناعية الفطرية على مستوى إنتاج العديد من السيتوكينات الموالية للالتهابات. نحن نقدم بيانات العينة التي نعمل استهداف تول مثل مستقبلات (TLR) عائلة، أفرادها الشعور LPS والممرض المرتبطة أنماط الجزيئية الأخرى (PAMPs)، لتنظيم المناعة الفطرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. صيانة خطوط الخلايا البلعمية
- تنمو RAW264.7 وخطوط الخلايا J774A.1 في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2. للمساعدة في الحفاظ العقم، إضافة 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا) في وسائل الإعلام (على الرغم من أن هذا ليس ضروريا بدقة).
- خطوة حاسمة: تأكد من أن الضامة تنمو في حالة صحية لكفاءة ترنسفكأيشن سيرنا والتي يسببها ضربة قاضية الجينات. استخدام خلايا الممرات بين 3 و 10 بعد ذوبان الجليد النقي، وهذه خطوط بلعم تظهر أفضل كفاءة ترنسفكأيشن والحفاظ على بقاء قوة بعد ترنسفكأيشن في هذه المرحلة. لا تستخدم عددا مرور العالي (> 20)، وكفاءة ترنسفكأيشن وإسقاط الموروثة على حد سواء يقلل إلى حد كبير.
- لالأمثل سيرنا ترنسفكأيشن، وخلايا لوحة عند 20٪ confluency وتنمو يوما أو يومين حتى تصل إلى خلايا لا يزيد عن 80٪ التقاء. وخلايا متضخمة لا بالنقل efficiently.
2. برمجة نظام المكوك 96-جيدا لترنسفكأيشن
- بدء برنامج مكوك 96-جيدا على جهاز كمبيوتر متصل المكوك. حدد ملف المعلمة الجديد من أعلى القائمة ملف اليسرى.
- تسليط الضوء على الآبار التي سيتم transfected على عرض 96 لوحة جيدا التخطيطي. سيقوم الصندوق الأخضر الذي يشير إلى الآبار ويتم اختيار.
- حدد البرنامج الذي يتوافق مع خط خلية بلعم تستخدم (DS-136 لRAW264.7 أو DS-130 لJ774A.1)، ثم حدد تطبيق، وتقع تحت diagramed وحة 96-جيدا. ملاحظة أنه بعد اختيار البرنامج، سيتم الملونة الآبار على لوحة تخطيطية الأزرق الداكن. دوائر فارغة تشير إلى الآبار التي لم يتم تعيينها برنامج ولن تكون صدمة.
3. إعداد الكواشف لترنسفكأيشن
- إعداد الحل Nucleofector ™ يعمل عن طريق خلط SF خط الخلية 96-جيدا الحل Nucleofector ™مع كامل محتويات أنبوب ملحق المغلقة. السماح للالكواشف المختلطة للتوازن في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها. تخزين الزائد الحل الكامل Nucleofector ™ في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر لاستخدامها في المستقبل.
- قبل الدافئة المالحة DMEM، RPMI-1640، 0.25٪ التربسين / EDTA، والفوسفات مخزنة (PBS) في 37 درجة مئوية قبل إعداد الضامة لترنسفكأيشن.
- إعداد سيرنا لترنسفكأيشن من قبل ذوبان على الجليد. من أجل تقليل عدد يذوب تجميد سيرنا، وتجميد الرناوات siRNAs جديدة مأخوذة في أول مرة تستخدم فيها.
- في التجارب الأولية، واستخدام سيرنا بجرعة عالية نسبيا من 2 ميكرومتر (01:10 المخفف من 20 ميكرومتر الأسهم). بعد ذلك يعاير الرناوات siRNAs التي تحفز الجينات القوي ضربة قاضية الى جرعات أقل، على الرغم من أن هناك حاجة إلى جرعات أعلى عادة لكفاءة ضربة قاضية الجينات في الضامة مقارنة مع أنواع أخرى من الخلايا.
تتوفر الرناوات siRNAs من مصادر عديدة؛ ملاحظة: إلى حد ما قوية ضربة قاضية الجينات يمكن الحصول علىباستخدام SMARTPOOLs siGenome، وهي برك من أربعة الرناوات siRNAs تستهدف كل جين. كعنصر تحكم السلبية، أي استخدام مختلف حمامات غير مستهدفة أو سيرنا الرناوات siRNAs. - لمراقبة كفاءة ترنسفكأيشن، إما بالنقل سيطرة بلازميد pmaxGFP (المقدمة في مجموعات AMAXA) أو الرناوات siRNAs fluorescently المسمى، بالتوازي مع الرناوات siRNAs التجريبية. نتوقع 30-50٪ ترنسفكأيشن من البلازميد GFP (يعاير بواسطة المجهر أو التدفق الخلوي بعد يوم من ترنسفكأيشن) و> 99٪ من ترنسفكأيشن fluorescently المسمى سيرنا (يعاير التدفق الخلوي مباشرة بعد ترنسفكأيشن والإنعاش).
4. إعداد الضامة لترنسفكأيشن
- فصل الضامة ملتصقة من أطباق زراعة الخلايا بواسطة trypsinization. نضح في وسائل الاعلام وغسل الخلايا مرتين مع 10 مل PBS. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا مع ما قبل تحسنت 0.25٪ التربسين / EDTA (1 مل / 10 سم لوحة) لمدة 1-2 دقائق حتى تبدأ الخلايا لفصل. اضغط برفق لوحة ونقل المحاليلنشوئها خلال الحضانة لتعظيم trypsinization.
- بعد الحضانة، إضافة 9 مل + سائل الاعلام DMEM FBS، مزيج بلطف صعودا وهبوطا، وجمع الخلايا بواسطة pipetting في أنبوب معقم.
- حساب عدد الضامة معزولة باستخدام عدادة الكريات. نتوقع نحو 10 مليون دولار الضامة في 10 سم لوحة. حساب العدد الإجمالي للالضامة الحاجة؛ كل بئر على متن المكوك 96-جيدا يتطلب 200،000 الخلايا. تذكر أن تضيف قيمة بضع آبار إضافية "خلايا للسماح pipetting لخسائر.
- ماصة عدد المحسوبة للخلايا في أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقيقة في 150 x ج في درجة حرارة الغرفة. لا أجهزة الطرد المركزي بسرعة كبيرة جدا لأن ذلك سوف يقلل الصحة بلعم والكفاءة ترنسفكأيشن.
5. Nucleofection الضامة مع سيرنا
- استخدام معقم 96-جيدا لوحة أسفل جولة (التي يسهل الخلط مع تقليل فقدان كاشف)، إضافة 2 ميكرولتر من كل سيرنا إلى كل بئر لتكون transfECTED.
ملاحظة: اعتمادا على عدد من الرناوات siRNAs، وهذا يمكن إنجازه خلال الخطوة بلعم الطرد المركزي. - نضح وسائل الإعلام من الخلايا بالطرد المركزي. resuspend بلطف الخلايا في حل Nucleofector ™ SF (التي تحتوي على الحل ملحق)، وذلك باستخدام 20 ميكرولتر لكل 200،000 خلايا مكعبات. مرة واحدة معلق، استخدام الخلايا فورا لترنسفكأيشن الأمثل.
- نقل الخلايا معلق في حوض معقم. باستخدام ماصة الأقنية، ونقل 20 ميكرولتر من الخليط خلية معلق في كل بئر من لوحة 96-جيدا تحتوي على الرناوات siRNAs. المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا.
- نقل 20 ميكرولتر من الخليط خلية / سيرنا في 96-جيدا Nucleocuvette ™ لوحة خطوة حاسمة: تجنب توليد فقاعات خلال خطوة نقل مثل هذه الأخطاء يمكن أن تحدث أثناء Nucleofection.
- بعد وضع جميع العينات التجريبية في لوحة ترنسفكأيشن، وتغطي لوحة 96-جيدا مع غطاء المقدمة والاصدارذ الاستفادة برفق على سطح صلب لإزالة أي فقاعات من العينات.
- وضع لوحة 96-جيدا مع غطاء جيدا في 96 المكوكية Nucleofector واختر "تحميل وبدء" على أسفل يمين الشاشة البرنامج. قبل Nucleofection، اتبع موجه برنامج لحفظ النتائج.
ملاحظة: أثناء عملية Nucleofection، سيتم تصوير الآبار tranfected بنجاح على التخطيطي 96-جيدا على الشاشة من خلال دائرة خضراء مع علامة زائد. وهناك دائرة حمراء مع وجود علامات تشير إلى ناقص خطأ، وعلى الأرجح بسبب فقاعات أو حجم الصحيح من الكواشف pipetting لسوء.
6. الإنعاش وتصفيح الضامة
- مباشرة بعد Nucleofection، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 80 ميكرولتر من قبل حرارة (37 درجة مئوية) RMP1-1640 وسائل الإعلام إلى كل بئر. إضافة وسائل الإعلام إلى جانب كل بئر، مما يتيح وسائل الإعلام لخلط ببطء مع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، والتي هي حساسة جدا في هذه المرحلة. لا تضيف وسائل الإعلام بسرعة كبيرة، وهذه الإرادةانخفاض كبير جدوى.
- وضع لوحات 96-جيدا مع عينات transfected وRPMI-1640 في الحاضنة 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 2 دقيقة. هذا أمر بالغ الأهمية لتسمح للخلايا للتعافي قبل مواصلة التلاعب.
- إزالة لوحة 96-جيدا من الحاضنة ونقل بعناية خليط من كل بئر إلى 96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة باستخدام ماصة الأقنية.
- باستخدام ماصة متعدد القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من قبل تحسنت (37 درجة مئوية) + DMEM FBS المتوسطة إلى كل بئر.
- احتضان 96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مع العينات في حاضنة 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ ل24-36 ساعة (تحسين التوقيت الدقيق لالرناوات siRNAs الفردية، على الرغم من أن هذا النطاق الزمني يعمل بشكل جيد عموما).
7. تحفيز الضامة مع LPS
- بعد 24-36 ساعة بعد Nucleofection الحضانة، وإعداد LPS (أو غيرها من PAMPs) في وسائل الإعلام الطازجة. إعداد ما يكفي من متوسطة جديدة لجميع الآبار (200 ميكرولتر مالقانونين / بئر من لوحة 96-جيدا زائد قليلا اضافية لpipetting ل). تمييع LPS إلى تركيز النهائي من 20 نانوغرام / مل في DMEM FBS +.
- وسائل الإعلام نضح بعناية من 96 لوحة جيدا وإضافة وسائل الإعلام الطازجة تحتوي على LPS إلى الخلايا.
- مراقبة استجابة لLPS أو PAMPs أخرى في أوقات مختلفة بعد التحفيز. 6 ساعة كافية لتوليد قوة استجابة خلوى التهابات السيتوكينات لمثل IL-6 أو TNFα.
8. رصد الاستجابة المستحثة الفطرية المناعي، إسقاط الموروثة، واستمرار في الضامة
- لمراقبة يسببها LPS-إنتاج السيتوكينات، ماصة طاف من الخلايا إلى صفيحة تخزين 96-جيدا. ومن ثم يمكن قياس إنتاج السيتوكينات بواسطة ELISA.
- مرة واحدة تتم إزالة طاف، ومراقبة بقاء الخلية باستخدام فلوريسئين ثنائي الأسيتات (عندما المشقوق من قبل esterases الخلوية في الخلايا الحية، ويصبح هذا المركب الفلورسنت). تحديد الرناوات siRNAs التي تستهدف الجينات التي تتحكم في بقاء الخلية باستخدام رنهجه. ملاحظة: يجب أن يكون عملية ترنسفكأيشن نفسها تأثير قليل على جدوى إذا أجريت بشكل صحيح.
- إضافة ثنائي الأسيتات فلوريسئين (5 ملغ / مل الأسهم في الأسيتون) إلى كل بئر (1: 100 التخفيف النهائي في PBS).
- يحضن في درجة حرارة الغرفة ل1-5 دقيقة ثم مراقبة مضان في الخلايا باستخدام قارئ لوحة (460 نانومتر الإثارة، 515 الانبعاث نانومتر).
- اختياري: لضمان أن مضان في الآبار موحد، ليز الخلايا باستخدام مخازن مثل RIPA. وهذا يوفر إشارة الفلورسنت موحدة في البئر، كما يتم تكوين بعض القراء لوحة لمراقبة سوى جزء صغير من البئر. إذا لم يتم مطلي الخلايا بشكل موحد، يمكن للثنائي الأسيتات فلوريسئين تعطي قراءة غير دقيقة.
- كبديل لمراقبة بقاء الخلية، ومراقبة الجينات التي يسببها سيرنا ضربة قاضية من قبل QPCR باستخدام RNA المستمدة من الخلايا الملتصقة.
- بعد إزالة طاف من الخلايا (الخطوة 8.1 أعلاه)، إعلانعازلة د RLT (الذي يستخدم لتحلل والحفاظ على RNA) مباشرة إلى الخلايا الملتصقة إلى ليز لهم.
- عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مستحضر عدة RNA مثل RNeasy مصغرة عدة، واستخدام QPCR مع الاشعال الجينات المحددة لمراقبة الجينات ضربة قاضية بالنسبة للسيطرة على العلاج سيرنا. استخدام التمهيدي لΒactin أو GAPDH للتطبيع.
- كبديل آخر لرصد جوانب أخرى من الاستجابة المناعية الفطرية، ومراقبة القدرة أكلة من الضامة بإضافة المسمى FITC E. جسيمات القولونية مباشرة على الخلايا الملتصقة باستخدام عدة. بعد بروتوكول الشركة المصنعة، والتي تستغرق بضع ساعات فقط، ومراقبة امتصاص أكلة باستخدام قارئ لوحة أو المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتدليل على كفاءة ترنسفكأيشن باستخدام هذا النهج، فإننا مراقبة امتصاص FITC المسمى سيرنا باستخدام عداد الكريات تدفق (الشكل 1).
لتوضيح فائدة نهجنا لرصد الاستجابة المناعية الفطرية، فإننا transfected الرناوات siRNAs استهداف الجينات التنظيمية المناعية الفطرية المعروفة في خط خلايا البلاعم RAW264.7، وحفز الخلايا مع LPS، ومن ثم مراقبة إنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات ايل 6 وTNFα. TLRs مختلفة تعترف PAMPs مختلفة، مع LPS من البكتيريا سالبة الجرام التي تعترف بها TLR4 20، lipopeptides مثل PAM3CSK4 معترف بها من قبل TLR2 21، والرنا المزدوج الجديلة من الفيروسات مثل بولي تقليد (I: C) معترف بها من قبل TLR3 22،23. كما هو مبين في الشكل 2، وتثبيط TLR4 (ولكن ليس TLRs أخرى باستخدام سيرنا) يقلل بشدة من إنتاج LPS يسببها IL-6 و TNFα. وعلاوة على ذلك، تثبيط IL-6 مع سيرنا يقلل أيضا ايل6 إنتاج في حين لا تؤثر على الإنتاج TNFα (قارن لوحة A إلى B في الشكل 2).
الشكل 1: يتم transfected FITC المسمى سيرنا بكفاءة في الماوس بلعم خط الخلية J774A.1 باستخدام الأساليب المذكورة مباشرة بعد ترنسفكأيشن، تم غسلها الخلايا عدة مرات، ثابتة في امتصاص العرق، وتم رصد مضان بواسطة التدفق الخلوي. الرقم يقارن الخلايا المحتضنة في وجود FITC سيرنا و transfected إما أن (المنحنى الأزرق) أو لا (المنحنى الأحمر).
الشكل 2: فعالية وخصوصية سيرنا في البلاعم الماوسو transfected خط الخلية RAW264.7. خلايا RAW264.7 مع الرناوات siRNAs أشار (إما السيطرة غير استهداف مجمعات سيرنا # 1 أو 2 أو الرناوات siRNAs التي تستهدف TLR4، TLR3، TLR2، أو IL-6 كما هو مبين). بعد 24 ساعة، تم تحفيز الخلايا مع 20 نانوغرام / مل LPS لمدة 6 ساعة و خلوى إنتاج (إما IL-6 في لوحة A أو B TNFα في لوحة تم رصدها في وقت لاحق من قبل ELISA. النجمية تشير إلى قيمة مختلفة كثيرا عن معاملة السيطرة (P <0.05 ، اختبار t).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد نشرت العديد من الدراسات التي تم فيها استهداف الجينات الفردية عن طريق سيرنا في الضامة الفئران. بينما الدهون بوساطة ترنسفكأيشن تم استخدامها لتقديم سيرنا على خطوط خلايا البلاعم على أساس فردي، وهذه الأساليب تعاني من الآثار المحتملة على قدرتها على البقاء، ضربة قاضية الجينات محدودة، وتقلبه من الجين لجينات. لتطوير فحوصات أكثر قوة التي يمكن استخدامها لاستهداف الجينات في متوسطة أو عالية الإنتاجية الأزياء، نحن الأمثل باستخدام تقنيات AMAXA nucleofector نظام المكوك 96-جيدا، والذي يسلك مزيد من الاتساق في ضربة قاضية الجينات وآثار محدودة على جدوى (هذا أكثر قوة النظام هو أكثر تكلفة من النهج بوساطة الدهون). تم اختبار العديد من المتغيرات من أجل تحسين هذه الإجراءات. كنا قادرين على استخدام هذا النظام لتقديم بكفاءة سيرنا إلى العديد من الضامة الأولية المختلفة، وخلد خطوط الخلايا البلاعم (في بعض الحالات وهذا استلزم استخدام AMAXA 96-جيدا خط الخلية الأمثل عدة). أنان اختبارات أولية مع مختلف هذه الخطوط الماوس بلعم الخلية (RAW264.7، J774A.1، وMH-S) والخلايا الأولية (أثار-thioglycollate والبلاعم المشتقة نخاع العظام)، وجدنا أن الخلايا RAW264.7 وJ774A.1 عرضت في أقوى ضربة قاضية الجينات التي يسببها سيرنا (تليها MH-S والخلايا الأولية، على التوالي، لا تظهر البيانات). كما تستخدم هذه خطين خلية بلعم خلد عادة للدراسة، نحن الأمثل إجراءات رني لدينا مزيد من استخدام هذه الخطوط.
لمراقبة كفاءة ترنسفكأيشن، نحن إما استخدام البلازميد السيطرة GFP في مجموعات nucleofector أو FITC المسمى سيرنا. البلازميد GFP المعارض مضان قوي اليوم بعد ترنسفكأيشن، مع كفاءة ترنسفكأيشن من 30-50٪ كما يعاير مجهريا أو عن طريق التدفق الخلوي (لا تظهر البيانات). مع FITC المسمى سيرنا، نلاحظ> 99٪ كفاءة ترنسفكأيشن كما يعاير بواسطة التدفق الخلوي (الرنا المزدوج الجديلة transfects أفضل من DNA البلازميد). في حين أنه من المهم أن ننتظر لمضانتطوير عند استخدام البلازميد GFP، يجب مراقبة سيرنا الفلورسنت قريبا نسبيا بعد ترنسفكأيشن لأن إشارة الفلورسنت تضعف مع مرور الوقت.
لم يقم ترنسفكأيشن تحت الشروط الموضحة لها تأثير كبير على بقاء الخلية. نحن نراقب عادة بقاء الخلية التالية علاجات سيرنا لدينا باستخدام فلوريسئين ثنائي الأسيتات. هذا المركب ليس الفلورسنت. ومع ذلك، عندما المشقوق من قبل esterases الخلوية في الخلايا الحية، يصبح من الفلورسنت. وعلاوة على ذلك، ثم يتم الاحتفاظ شكل فلوري في الخلايا مع غشاء البلازما 24 سليمة. هذا الاختبار القائم على مضان هو فحص بسيط نسبيا وسريعة ورخيصة لمراقبة بقاء الخلية، على الرغم من أن هناك فحوصات أخرى أكثر تطورا التي على سبيل المثال رصد مستويات ATP الخلوية.
نحن عادة مقايسة خلايانا لالمناعة الفطرية وظيفة 24-36 ساعة بعد ترنسفكأيشن، التي تقع على الجانب المبكر للرني بالمقارنة مع خطوط الخلايا الأخرى. WHواحد إيل لديه لانتظار البروتينات الذاتية لتسليم لتسهيل ضربة قاضية الجين، لا بد من موازنة هذا مع فقدان سيرنا رجولية، ونجد ضربة قاضية أكثر قوة في هذه السطور بلعم في أوقات مبكرة قليلا من 48-72 ساعة المعتادة المستخدمة في الآخر أنواع الخلايا. في حين أنه من الأفضل لرصد مستويات البروتين لطخة غربية، نحن عادة رصد مستويات مرنا من قبل QPCR، بهدف دراسة جينات متعددة في وقت واحد، والتي أجسام متعددة والبقع الغربية قد لا يكون عمليا. نستخدم LPS على جرعة ضئيلة أن يزيد إنتاج السيتوكينات الالتهابية.
عندما تستهدف جينات جديدة مع سيرنا، ونحن نبدأ مع جرعة عالية نسبيا سيرنا موضح في البروتوكول وثم يعاير أسفل الرناوات siRNAs التي تحفز على النمط الظاهري. وتشمل ضوابط لاحقة تهدف إلى تفادي خارج الهدف آثار استخدام الدوبلكس سيرنا متعددة لتحديد ما إذا كان سيرنا أكثر من واحد يمكن أن تحدث نفس النمط الظاهري، والتحقق من إسقاط الموروثة من قبل QPCR أو لطخة غربية، واستخدام جنرال الكتريكدراسات شمال شرق overexpression لاستكمال النهج رني. يجب أن تسمح هذه الطرق لتحديد السريع للجينات التي تنظم الحصانة الفطرية في الضامة الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة. وقد رعت هذه المادة من قبل ونزا، وشركة
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electroporation | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFα Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. The macrophage. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. Methods in Cellular Immunology. 8, CRC Press. 8 (2001).
