Introduction
इस प्रोटोकॉल में, हम siRNAs का उपयोग माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों में जीन को बाधित और सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर इन उपचार के प्रभाव पर नजर रखने के लिए कारगर तरीकों का वर्णन. इन प्रक्रियाओं मध्यम या उच्च throughput फैशन में आरएनएआई स्क्रीन के लिए अनुमति देता है, 96 अच्छी तरह प्रारूप में प्रदर्शन कर रहे हैं.
संक्रमण के जवाब में, मनुष्य एक तत्काल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एक धीमी लेकिन अधिक विशिष्ट अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट. यह तेजी से सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मैक्रोफेज 1 सहित phagocytic सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती और सक्रियण शामिल है. प्रतिष्ठित सक्रिय मैक्रोफेज तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में शामिल और रोगाणुरोधी प्रोटीन और यौगिकों, साइटोकिन्स और chemokines, और वर्तमान एंटीजन 2,3 का उत्पादन कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज सहिष्णुता, ऊतकों की मरम्मत को बनाए रखने, प्रतिरक्षा को विनियमित करने में एक भूमिका निभाते हैं, और 4-8 घाव भरने. क्योंकि कार्यों की उनके ठहरने का, मैक्रोफेज atherosclerosis, गठिया, और कैंसर 9 सहित कई बीमारियों में एक भूमिका निभा सकते हैं. इस प्रकार, मैक्रोफेज का अध्ययन रोग क्षेत्रों की एक विस्तृत विविधता में कुछ समय के लिए अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र रहा है.
सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में उनके महत्व के बावजूद, मैक्रोफेज के साथ काम करने के लिए कोशिकाओं को चुनौती देने जा सकता है. विशेष रूप से, यह जुड़े विषाक्तता 10,11 बिना मैक्रोफेज में लिपिड अभिकर्मकों का उपयोग कुशल अभिकर्मक प्राप्त करना कठिन है. इसके अलावा, siRNA कुशलता से मैक्रोफेज के लिए दिया जाता है, तब भी जब अक्सर पछाड़ना आरएनएआई प्रेरित जीन की मजबूती काफी उदार हो सकता है और जीन जीन से भिन्न हो सकती हैं.
इन तकनीकी चुनौतियों पर काबू पाने के लिए, हम दो माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों, RAW264.7 17 और J774A.1 18 में अभिकर्मक और पछाड़ना तकनीक 12-16 अनुकूलित है. यह दृष्टिकोण अभिकर्मक के लिए Amaxa Nucleofector के 96 अच्छी तरह से शटल प्रणाली का उपयोग करता है; इस प्रणाली96 अच्छी तरह प्रारूप 19 में कोशिकाओं transfect करने के लिए विशेष अभिकर्मकों और electroporation की एक संयोजन का उपयोग करता है. अभिकर्मक के बाद, हम तरीकों सेल वसूली और व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए और बाद में siRNA प्रेरित जीन पछाड़ना को अधिकतम करने का वर्णन है. इस दृष्टिकोण की उपयोगिता को वर्णन करने के लिए, हम lipopolysaccharide (LPS) के साथ इन कोशिकाओं को उत्तेजित, और कई समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन के स्तर पर सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर नजर रखने, इन बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों को siRNA वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हम जिसके सदस्य LPS और अन्य रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) भावना, सहज प्रतिरक्षा को विनियमित करने के लिए टोल की तरह रिसेप्टर (TLR) परिवार, जो लक्ष्य में नमूना डेटा प्रदान करते हैं.
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Protocol
बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों के 1. रखरखाव
- RAW264.7 बढ़ो और DMEM में J774A.1 सेल लाइनों 5% सीओ 2 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक. , बाँझपन बनाए रखने में मदद (इस सख्ती जरूरी नहीं है, हालांकि) मीडिया को 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप) जोड़ने के लिए.
- महत्वपूर्ण कदम: मैक्रोफेज कुशल अभिकर्मक और siRNA प्रेरित जीन पछाड़ना के लिए एक स्वस्थ राज्य में बढ़ रहे हैं कि सुनिश्चित करें. इन बृहतभक्षककोशिका लाइनों सबसे अच्छा अभिकर्मक दक्षता का प्रदर्शन और इस स्तर पर मजबूत बाद अभिकर्मक अस्तित्व को बनाए रखने के रूप में, ताजा विगलन के बाद मार्ग 3 और 10 के बीच कोशिकाओं का प्रयोग करें; दोनों बहुत कम पछाड़ना अभिकर्मक दक्षता और जीन के रूप में, एक उच्च बीतने संख्या (> 20) का उपयोग नहीं करते.
- कोशिकाओं कोई 80 से अधिक% संगम तक पहुंचने तक अनुकूलित siRNA अभिकर्मक के लिए, थाली 20% confluency पर कोशिकाओं और एक या दो दिन बढ़ता है. ऊंचा हो गया कोशिकाओं effic transfect नहीं होगाiently.
2. अभिकर्मक के लिए 96 अच्छी तरह से शटल प्रणाली प्रोग्रामिंग
- शटल से जुड़े कंप्यूटर पर 96 अच्छी तरह से शटल सॉफ्टवेयर शुरू करो. ऊपर छोड़ दिया फ़ाइल मेनू से नया पैरामीटर फ़ाइल का चयन करें.
- प्रदर्शित 96 अच्छी तरह से थाली योजनाबद्ध पर ट्रांसफ़ेक्ट किया जाएगा कि कुओं को हाइलाइट करें. एक हरे बॉक्स चयनित हैं जो कुओं का संकेत होगा.
- Diagramed 96 अच्छी तरह से थाली के नीचे स्थित (J774A.1 के लिए RAW264.7 या डी एस -130 के लिए DS-136) का इस्तेमाल किया जा रहा है और लागू चयन बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन, से मेल खाती है कि कार्यक्रम का चयन करें. एक कार्यक्रम के चयन के बाद, योजनाबद्ध प्लेट पर कुओं गहरे नीले रंग का हो जाएगा कि ध्यान दें. खाली हलकों एक कार्यक्रम सौंपा नहीं गया है और हैरान नहीं किया जाएगा कि कुओं से संकेत मिलता है.
3. अभिकर्मक के लिए अभिकर्मकों की तैयारी
- एस एफ सेल लाइन के मिश्रण से काम कर Nucleofector ™ समाधान तैयार 96 अच्छी तरह Nucleofector ™ समाधानसंलग्न पूरक ट्यूब की संपूर्ण सामग्री के साथ. मिश्रित अभिकर्मकों का उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर संतुलित करने की अनुमति दें. भविष्य में उपयोग के लिए ऊपर से 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त पूरा Nucleofector ™ समाधान स्टोर.
- पूर्व गर्म अभिकर्मक के लिए मैक्रोफेज की तैयारी करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर DMEM, RPMI-1640, 0.25% / trypsin EDTA, और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस).
- बर्फ पर विगलन द्वारा अभिकर्मक के लिए siRNA तैयार करें. SiRNA के फ्रीज thaws की संख्या को कम करने के लिए, aliquots में वे इस्तेमाल कर रहे हैं पहली बार नए siRNAs फ्रीज.
- प्रारंभिक प्रयोगों में, (20 माइक्रोन शेयरों से 1:10 पतला) 2 माइक्रोन का एक अपेक्षाकृत उच्च खुराक में siRNA का उपयोग करें. आम तौर पर अधिक मात्रा में अन्य प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में मैक्रोफेज में कुशल जीन पछाड़ना के लिए आवश्यक हैं, हालांकि बाद में, कम खुराक के लिए नीचे पछाड़ना मजबूत जीन प्रेरित कि siRNAs टाइट्रेट.
नोट: siRNAs कई स्रोतों से उपलब्ध हैं; काफी मजबूत जीन पछाड़ना प्राप्त किया जा सकता हैप्रत्येक जीन को लक्षित चार siRNAs की पूल हैं जो siGenome SMARTPOOLs, का उपयोग कर. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, विभिन्न गैर लक्षित कर siRNA पूल या siRNAs की किसी भी उपयोग करें. - , अभिकर्मक दक्षता की निगरानी प्रयोगात्मक siRNAs के समानांतर में pmaxGFP नियंत्रण (Amaxa किट में प्रदान की) प्लाज्मिड या fluorescently लेबल siRNAs या तो transfect करने के लिए. GFP प्लाज्मिड के 30-50% अभिकर्मक (माइक्रोस्कोपी द्वारा assayed या अभिकर्मक के बाद दिन प्रवाह cytometry) और (अभिकर्मक और वसूली के बाद cytometry के तुरंत प्रवाह द्वारा assayed) fluorescently लेबल siRNA के> 99% अभिकर्मक की अपेक्षा करें.
4. अभिकर्मक के लिए मैक्रोफेज की तैयारी
- Trypsinization द्वारा सेल संस्कृति व्यंजन से पक्षपाती मैक्रोफेज अलग करें. मीडिया Aspirate और 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लो. पीबीएस हटाने के बाद, साथ कोशिकाओं को सेते कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू तक 1-2 मिनट के लिए 0.25% / trypsin EDTA (1 मिलीग्राम / 10 सेमी प्लेट) पूर्व गर्म. धीरे थाली नल और समाधान के लिए कदमऊष्मायन के दौरान tion के trypsinization को अधिकतम करने के लिए.
- ऊष्मायन के बाद, एक बाँझ ट्यूब में pipetting द्वारा कोशिकाओं, 9 मिलीलीटर DMEM + FBS के मीडिया जोड़ने के ऊपर और नीचे धीरे मिश्रण, और इकट्ठा.
- एक hemocytometer का उपयोग पृथक मैक्रोफेज की संख्या की गणना. 10 सेमी प्लेट प्रति मोटे तौर पर 10 लाख मैक्रोफेज की अपेक्षा करें. जरूरत मैक्रोफेज की कुल संख्या की गणना; अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से शटल पर प्रत्येक 200,000 कोशिकाओं की आवश्यकता है. Pipetting के नुकसान के लिए अनुमति देने के लिए कोशिकाओं का कुछ अतिरिक्त कुओं की कीमत जोड़ने के लिए याद रखें.
- एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं की गणना की संख्या पिपेट. कमरे के तापमान पर 150 XG पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. इस बृहतभक्षककोशिका स्वास्थ्य और अभिकर्मक दक्षता कम हो जाएगा के रूप में भी जल्दी अपकेंद्रित्र न करें.
SiRNA साथ मैक्रोफेज की 5. nucleofection
- (अभिकर्मक नुकसान को कम करते हुए मिश्रण की सुविधा) एक बाँझ 96 अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट का उपयोग करना, प्रत्येक अच्छी तरह से हो transf के लिए प्रत्येक siRNA के 2 μl जोड़नेected.
नोट: siRNAs की संख्या पर निर्भर करता है, इस बृहतभक्षककोशिका centrifugation कदम के दौरान पूरा किया जा सकता है. - Centrifuged कोशिकाओं से मीडिया aspirate. धीरे pelleted 200,000 कोशिकाओं प्रति 20 μl का उपयोग कर, (पूरक समाधान युक्त) Nucleofector ™ समाधान एस एफ में कोशिकाओं resuspend. Resuspended एक बार, इष्टतम अभिकर्मक के लिए तुरंत कोशिकाओं का उपयोग करें.
- एक बाँझ गर्त में resuspended कोशिकाओं स्थानांतरण; siRNAs युक्त 96 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में स्थानांतरण resuspended सेल मिश्रण की 20 μl, एक multichannel विंदुक का उपयोग. धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण.
- स्थानांतरण 96 अच्छी तरह Nucleocuvette ™ थाली में सेल / siRNA मिश्रण के 20 μl महत्वपूर्ण कदम:. इस nucleofection दौरान त्रुटियों को प्रेरित कर सकते हैं के रूप में स्थानांतरण चरण के दौरान बुलबुले पैदा करने से बचें.
- अभिकर्मक थाली में प्रयोगात्मक नमूने के सभी रखने के बाद, बशर्ते ढक्कन और देखें के साथ 96 अच्छी तरह से थाली कवरY धीरे नमूनों से किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए एक कठिन सतह पर नल.
- कार्यक्रम स्क्रीन के नीचे सही पर 'अपलोड करें और शुरू' 96 अच्छी तरह Nucleofector शटल में ढक्कन के साथ 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और चयन करें. Nucleofection से पहले, परिणाम को बचाने के लिए कार्यक्रम शीघ्र पालन करें.
नोट: nucleofection प्रक्रिया के दौरान, सफलतापूर्वक tranfected कुओं एक प्लस पर हस्ताक्षर के साथ एक हरे रंग चक्र से स्क्रीन पर 96 अच्छी तरह से योजनाबद्ध पर चित्रित किया जाएगा. शून्य से संकेत के साथ एक लाल वृत्त कारण बुलबुले या गलत pipetting अभिकर्मकों की सही मात्रा के लिए, सबसे अधिक संभावना एक त्रुटि इंगित करता है.
6. रिकवरी और मैक्रोफेज की चढ़ाना
- इसके तत्काल बाद nucleofection के बाद, एक multichannel विंदुक का उपयोग कर, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए RMP1-1640 मीडिया पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) के 80 μl जोड़ें. मीडिया धीरे धीरे इस स्तर पर बहुत नाजुक हैं जो ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ मिश्रण करने के लिए अनुमति देता है, प्रत्येक कुएं की तरफ से मीडिया जोड़ें. इस वसीयत के रूप में भी तेजी से मीडिया को न जोड़ेंबहुत व्यवहार्यता कमी.
- 2 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ट्रांसफ़ेक्ट नमूने और RPMI-1640 के साथ 96 अच्छी तरह प्लेटें प्लेस; यह कोशिकाओं में गड़बड़ी को आगे करने से पहले ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है.
- इनक्यूबेटर से 96 अच्छी तरह से थाली निकालें और ध्यान से एक multichannel विंदुक का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण हस्तांतरण.
- एक multichannel विंदुक का प्रयोग, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) DMEM + FBS के माध्यम के 100 μl जोड़ें.
- 24-36 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में नमूने के साथ 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट (इस समय सीमा आम तौर पर अच्छी तरह से काम करता है, हालांकि, व्यक्तिगत siRNAs के लिए सही समय का अनुकूलन) सेते हैं.
LPS के साथ मैक्रोफेज की 7. उत्तेजना
- 24-36 घंटे के बाद nucleofection ऊष्मायन के बाद, ताजा मीडिया में LPS (या अन्य PAMPs) तैयार करते हैं. सभी कुओं के लिए पर्याप्त ताजा मध्यम तैयार (200 μl एमedia / अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से थाली प्लस pipetting के लिए एक छोटे से अतिरिक्त). DMEM + FBS में 20 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता LPS पतला.
- 96 अच्छी तरह से थाली से ध्यान से महाप्राण मीडिया और कोशिकाओं को LPS युक्त ताजा मीडिया जोड़ें.
- उत्तेजना के बाद विभिन्न समय पर LPS या अन्य PAMPs के जवाब मॉनिटर. 6 घंटा ऐसे आईएल -6 या TNFα रूप साइटोकिन्स के लिए एक मजबूत भड़काऊ साइटोकाइन प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है.
8. मैक्रोफेज में प्रेरित सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, जीन पछाड़ना, और व्यवहार्यता निगरानी
- LPS प्रेरित साइटोकाइन उत्पादन पर नजर रखने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से भंडारण की थाली में कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला पिपेट. साइटोकाइन उत्पादन तो एलिसा द्वारा मापा जा सकता है.
- सतह पर तैरनेवाला निकाले जाने के बाद, fluorescein Diacetate का उपयोग सेल व्यवहार्यता की निगरानी (जीवित कोशिकाओं में सेलुलर esterases द्वारा cleaved जब, इस परिसर फ्लोरोसेंट हो जाता है). टी का उपयोग सेल व्यवहार्यता पर नियंत्रण जीन है कि लक्ष्य है कि siRNAs पहचानेंअपने दृष्टिकोण. नोट: ठीक से प्रदर्शन अगर अभिकर्मक प्रक्रिया ही व्यवहार्यता पर खास असर नहीं होना चाहिए.
- (: पीबीएस में 100 अंतिम कमजोर पड़ने 1) प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए fluorescein Diacetate (एसीटोन में 5 मिलीग्राम / एमएल शेयर) जोड़ें.
- पांच मिनट के लिए एक कमरे के तापमान पर सेते हैं और फिर एक प्लेट पाठक (460 एनएम उत्तेजना, 515 एनएम उत्सर्जन) का उपयोग कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति की निगरानी.
- वैकल्पिक: कुओं में प्रतिदीप्ति वर्दी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, ऐसे RIPA रूप buffers का उपयोग Lyse कोशिकाओं; कुछ थाली पाठकों अच्छी तरह के केवल एक छोटे से हिस्से की निगरानी करने के लिए विन्यस्त किया गया है, क्योंकि यह अच्छी तरह से में एक वर्दी फ्लोरोसेंट संकेत प्रदान करता है; कोशिकाओं समान रूप से चढ़ाया नहीं कर रहे हैं, fluorescein Diacetate एक गलत रीडिंग दे सकता है.
- सेल व्यवहार्यता की निगरानी के लिए एक विकल्प के रूप में, पक्षपाती कोशिकाओं से व्युत्पन्न शाही सेना का उपयोग qPCR द्वारा पछाड़ना siRNA प्रेरित जीन की निगरानी.
- सतह पर तैरनेवाला कोशिकाओं से निकाले जाने के बाद, विज्ञापन (ऊपर 8.1 कदम)उन्हें lyse सीधे पक्षपाती कोशिकाओं को (सेल और शाही सेना के संरक्षण के लिए प्रयोग किया जाता है) डी RLT बफर.
- ऐसे RNeasy मिनी किट के रूप में एक शाही सेना तैयारी किट का उपयोग कर शाही सेना को अलग, और जीन siRNA उपचार नियंत्रित करने के लिए पछाड़ना रिश्तेदार की निगरानी के लिए जीन विशिष्ट प्राइमरों के साथ qPCR का उपयोग करें. सामान्य बनाने के लिए Βactin को प्राइमरों या GAPDH का प्रयोग करें.
- एक अन्य विकल्प सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अन्य पहलुओं पर नजर रखने के रूप में, FITC लेबल ई जोड़कर मैक्रोफेज की phagocytic क्षमता की निगरानी सीधे एक किट का उपयोग कर पक्षपाती कोशिकाओं पर कोलाई कणों. केवल कुछ ही घंटे लगते हैं जो निर्माता प्रोटोकॉल, के बाद, एक थाली पाठक या माइक्रोस्कोपी का उपयोग phagocytic तेज की निगरानी.
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Representative Results
इस दृष्टिकोण का उपयोग अभिकर्मक की दक्षता प्रदर्शित करने के लिए, हम एक प्रवाह कोशिकामापी (चित्रा 1) का उपयोग FITC लेबल siRNA के तेज नजर रखी.
सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए हमारे दृष्टिकोण की उपयोगिता को वर्णन करने के लिए, हम, RAW264.7 मैक्रोफेज सेल लाइन में जाना जाता सहज प्रतिरक्षा नियामक जीन लक्ष्यीकरण siRNAs ट्रांसफ़ेक्ट LPS के साथ कोशिकाओं को प्रेरित किया, और उसके समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन नजर रखी IL- 6 और TNFα. TLR3 22,23 द्वारा मान्यता: (सी आई) विभिन्न TLRs TLR4 20 द्वारा मान्यता प्राप्त ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से LPS के साथ, इस तरह के PAM3CSK4 रूप lipopeptides ऐसी नकल पाली के रूप में वायरस से TLR2 21, और dsRNA द्वारा मान्यता प्राप्त है, अलग PAMPs पहचाना. चित्रा 2 में दिखाया गया है, TLR4 (लेकिन siRNA का उपयोग अन्य नहीं TLRs) का निषेध जोरदार LPS प्रेरित आईएल -6 और TNFα का उत्पादन कम हो. इसके अलावा, siRNA साथ आईएल -6 का निषेध भी IL- घटता है6 उत्पादन TNFα उत्पादन (चित्रा 2 में बी करने के लिए एक पैनल की तुलना) को प्रभावित नहीं करता है.
चित्रा 1:. FITC लेबल siRNA कुशलता से तत्काल अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं paraformaldehyde में तय की, कई बार धोया गया वर्णित तरीकों का उपयोग माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन J774A.1 में ट्रांसफ़ेक्ट है, और प्रतिदीप्ति प्रवाह cytometry द्वारा नजर रखी थी. आंकड़ा या तो ट्रांसफ़ेक्ट गया कि FITC-siRNA के उपस्थिति (नीला वक्र) या नहीं (लाल वक्र) में incubated कोशिकाओं तुलना.
माउस बृहतभक्षककोशिका में siRNA के प्रभावकारिता और विशिष्टता: चित्रा 2सेल लाइन RAW264.7. RAW264.7 कोशिकाओं (नियंत्रण या तो गैर लक्षित siRNA पूल # 1 या 2 या TLR4, TLR3, TLR2, या आईएल -6 के रूप में संकेत है कि लक्ष्य siRNAs) संकेत siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. 24 घंटे बाद, कोशिकाओं बाद में एलिसा द्वारा नजर रखी थी 6 घंटा और साइटोकाइन उत्पादन के लिए 20 एनजी / एमएल LPS (या तो आईएल -6 पैनल बी में पैनल में या TNFα साथ प्रेरित किया गया. तारों नियंत्रण उपचार (P से काफी अलग मूल्य <0.05 से संकेत मिलता है , टी परीक्षण).
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Discussion
कई अध्ययनों में जो व्यक्ति जीन murine मैक्रोफेज में siRNA द्वारा लक्षित किया गया है प्रकाशित किया गया है. लिपिड की मध्यस्थता अभिकर्मक एक व्यक्ति के आधार पर बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों को siRNA देने के लिए इस्तेमाल किया गया है, इन तरीकों जीन से जीन के लिए व्यवहार्यता, सीमित जीन पछाड़ना, और परिवर्तनशीलता पर संभावित प्रभावों से पीड़ित हैं. मध्यम या उच्च throughput फैशन में जीन को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि और अधिक मजबूत assays के विकास, हम जीन पछाड़ना में अधिक निरंतरता और व्यवहार्यता पर सीमित प्रभाव (यह और अधिक मजबूत दर्शाती है जो Amaxa Nucleofector 96 अच्छी तरह से शटल प्रणाली, तकनीक का उपयोग कर अनुकूलित सिस्टम) लिपिड की मध्यस्थता दृष्टिकोण की तुलना में महंगा है. कई चर इन प्रक्रियाओं का अनुकूलन करने के क्रम में परीक्षण किया गया. हम कुशलतापूर्वक कई अलग अलग प्राथमिक मैक्रोफेज को siRNA देने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने में सक्षम थे और बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों अमर (इस Amaxa 96 अच्छी तरह से सेल लाइन अनुकूलन किट का उपयोग जरूरी कुछ मामलों में). मैंएन इन विभिन्न माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों (RAW264.7, J774A.1, और महाराष्ट्र-एस) और प्राथमिक कोशिकाओं के साथ प्रारंभिक परीक्षण (thioglycollate-हासिल और हड्डी मैक्रोफेज मज्जा व्युत्पन्न), हमने पाया RAW264.7 और J774A.1 कोशिकाओं कि सबसे मजबूत siRNA प्रेरित जीन पछाड़ना का प्रदर्शन (महाराष्ट्र-एस और प्राथमिक कोशिकाओं द्वारा पीछा किया, क्रमशः, नहीं दिखाया डेटा). इन दो अमर बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों आमतौर पर अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, हम आगे इन लाइनों का उपयोग हमारे आरएनएआई प्रक्रियाओं अनुकूलित.
अभिकर्मक दक्षता पर नजर रखने के लिए, हम या तो Nucleofector किट या FITC लेबल siRNA में नियंत्रण GFP प्लाज्मिड का उपयोग करें. Microscopically या फ्लो द्वारा assayed के रूप में GFP प्लाज्मिड 30-50% की अभिकर्मक दक्षता के साथ, अभिकर्मक के बाद दिन मजबूत प्रतिदीप्ति दर्शाती (नहीं दिखाया डेटा). SiRNA FITC लेबल के साथ फ्लो द्वारा assayed के रूप में, हम> 99% अभिकर्मक दक्षता का निरीक्षण (dsRNA प्लास्मिड डीएनए की तुलना में बेहतर transfects). यह करने के लिए प्रतिदीप्ति के लिए प्रतीक्षा करने के लिए महत्वपूर्ण हैफ्लोरोसेंट संकेत समय के साथ कमजोर क्योंकि GFP प्लाज्मिड का उपयोग करते समय विकसित, फ्लोरोसेंट siRNA अभिकर्मक के बाद अपेक्षाकृत जल्द ही निगरानी की जानी चाहिए.
वर्णित शर्तों के तहत अभिकर्मक सेल व्यवहार्यता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं है. आम तौर पर हम fluorescein Diacetate का उपयोग हमारे siRNA उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता की निगरानी. इस यौगिक फ्लोरोसेंट नहीं है; जीवित कोशिकाओं में सेलुलर esterases द्वारा cleaved हालांकि, जब यह फ्लोरोसेंट हो जाता है. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट फार्म तो एक अक्षुण्ण प्लाज्मा झिल्ली 24 के साथ कोशिकाओं में बनाए रखा है. उदाहरण के लिए सेलुलर एटीपी के स्तर की निगरानी कि अन्य अधिक परिष्कृत assays के कुछ कर रहे हैं, हालांकि इस प्रतिदीप्ति आधारित परख, सेल व्यवहार्यता पर नजर रखने के लिए एक अपेक्षाकृत, सीधा तेजी से, और सस्ते परख है.
आम तौर पर हम अन्य सेल लाइनों की तुलना में आरएनएआई के लिए जल्दी तरफ है जो अभिकर्मक निम्नलिखित सहज प्रतिरक्षा समारोह 24-36 घंटा, के लिए हमारी कोशिकाओं परख. कइले एक जीन पछाड़ना की सुविधा के लिए मोड़ पर अंतर्जात प्रोटीन के लिए इंतजार करना पड़ता है, एक siRNA शक्ति के नुकसान के साथ यह संतुलन होना चाहिए, और हम अन्य में प्रयुक्त ठेठ 48-72 घंटा की तुलना में थोड़ा जल्दी समय पर इन बृहतभक्षककोशिका लाइनों में और अधिक मजबूत पछाड़ना लगता है सेल प्रकार के. यह पश्चिमी धब्बा द्वारा प्रोटीन के स्तर की निगरानी करने के लिए बेहतर है, हम आम तौर पर कई एंटीबॉडी और पश्चिमी blots व्यावहारिक नहीं हो सकता है, जिसके लिए एक ही बार में कई जीनों का अध्ययन करने के लक्ष्य के साथ, qPCR द्वारा mRNA के स्तर की निगरानी. हम भड़काऊ साइटोकाइन उत्पादन है कि अधिकतम न्यूनतम खुराक पर LPS का उपयोग करें.
SiRNA साथ नए जीनों को लक्ष्य करते समय हम प्रोटोकॉल में वर्णित अपेक्षाकृत उच्च siRNA खुराक के साथ शुरू और फिर एक phenotype प्रेरित कि siRNAs नीचे टाइट्रेट. बंद लक्ष्य प्रभाव से बचने के लिए डिज़ाइन बाद नियंत्रण जीई qPCR या वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा पछाड़ना जीन की पुष्टि, और का उपयोग कर, एक से अधिक siRNA ही फेनोटाइप पैदा कर सकते हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए कई siRNA duplexes के उपयोग में शामिलपूर्वोत्तर overexpression पढ़ाई आरएनएआई दृष्टिकोण के पूरक हैं. इन तरीकों माउस मैक्रोफेज में सहज प्रतिरक्षा को विनियमित कि जीन की तेजी से पहचान के लिए अनुमति चाहिए.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा. यह लेख Lonza, इंक द्वारा प्रायोजित किया गया था
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electroporation | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFα Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
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