Introduction
I detta protokoll, beskriver vi effektiva metoder för att hämma gener i musen makrofagcellinjer använder siRNA och övervaka effekterna av dessa behandlingar på det medfödda immunsvaret. Dessa procedurer utförs i 96-format som möjliggör RNAi skärmar i medel- eller hög genomströmning fashion.
Som svar på infektion, människor montera en omedelbar medfödda immunsvar och en långsammare men mer specifik adaptiva immunsvaret. Denna snabba medfödda immunsvar innefattar rekrytering och aktivering av fagocyterande medfödda immunceller inkluderande makrofager 1. Klassiskt aktiverade makrofager är inblandade i akuta inflammatoriska reaktioner och producera antimikrobiella proteiner och föreningar, cytokiner och kemokiner och presentera antigen 2,3. Alternativt aktiverade makrofager spelar en roll i regleringen av immunitet, bibehålla tolerans, vävnadsreparation, och sårläknings 4-8. På grund av deras breda utbud av funktionerKan makrofager spela en roll i ett stort antal sjukdomar inklusive ateroskleros, artrit och cancer 9. Sålunda har studier av makrofager varit ett viktigt område för forskning under en tid i en mängd olika områden sjukdoms.
Trots deras betydelse i det medfödda immunsvaret, kan makrofager vara utmanande celler att arbeta med. I synnerhet är det svårt att få en effektiv transfektion med hjälp av lipid reagens i makrofager utan tillhörande toxicitet 10,11. Även när siRNA effektivt levereras till makrofager, kan robustheten RNAi-inducerad gen knockdown ofta vara ganska måttlig och kan variera från gen till gen.
För att undanröja dessa tekniska utmaningar har vi optimerat transfektion och knockdown tekniker 12-16 i två mus makrofagcellinjer, RAW264.7 17 och J774A.1 18. Detta tillvägagångssätt använder Amaxa Nucleofector 96-brunnars Transfersystem för transfektion; detta systemanvänder en kombination av specialiserade reagens och elektroporering för att transfektera celler i 96-brunnsformat 19. Efter transfektion, vi beskriver metoder för att maximera cell återhämtning och livskraft och för att maximera efterföljande siRNA-inducerad gen knockdown. För att illustrera användbarheten av detta tillvägagångssätt, beskriver vi ett protokoll för siRNA leverans till dessa makrofagcellinjer, stimulera dessa celler med lipopolysackarid (LPS), och övervaka det medfödda immunsvaret på produktionsnivå av flera pro-inflammatoriska cytokiner. Vi tillhandahåller exempeldata där vi riktar Toll-like receptor (TLR) familj, vars medlemmar känner LPS och andra patogener associerade molekylära mönster (PAMPs), för att reglera medfödd immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Underhåll av makrofagcellinjer
- Grow RAW264.7 och J774A.1 cellinjer i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid 37 ° C i närvaro av 5% CO2. För att bidra till att upprätthålla steriliteten, tillsätt 1% penicillin / streptomycin (pen / strep) till mediet (även om detta inte är absolut nödvändigt).
- Kritiskt steg: Kontrollera att makrofagerna växer i ett hälsosamt tillstånd för effektiv transfektion och siRNA-inducerad gen knockdown. Använd celler mellan passagerna 3 och 10 efter färsk upptining, eftersom dessa makrofager linjer uppvisar den bästa transfektionseffektiviteten och upprätthålla robusta efter transfektion överlevnad i detta skede; använd inte en högre passagenummer (> 20), som transfektionseffektivitet och gen knockdown både minskar kraftigt.
- För optimerad siRNA transfektion, plåtceller vid 20% konfluens och odlar en eller två dagar tills cellerna når högst 80% sammanflöde. Förvuxna celler kommer inte att transfektera efficiently.
2. Programmering av 96 brunnar Shuttle System för transfektion
- Starta 96-bra pendel programvara på datorn som är ansluten till skytteln. Välj ny parameterfilen från övre vänstra menyn Arkiv.
- Belysa de brunnar som kommer att transfekteras på den visade 96-brunnar schematiska. En grön ruta indikerar vilka brunnar väljs.
- Välj det program som motsvarar makrofagcellinje som används (DS-136 för RAW264.7 eller DS-130 för J774A.1) och välj tillämpas, som ligger under den i diagramform 96-brunnar. Observera att när du har valt ett program, kommer brunnarna på den schematiska plattan färgas mörkblå. Tomma cirklar indikerar brunnar som inte har tilldelats ett program och kommer inte att bli chockade.
3. Förbereda Reagenser för transfektion
- Förbered verksamt Nucleofector ™ lösning genom blandning av SF-cellinjen 96-brunnars Nucleofector ™ -lösningmed hela innehållet i den bifogade tillägget röret. Tillåta de blandade reagensen till jämvikt vid rumstemperatur före användning. Förvara överskott komplett Nucleofector ™ lösning vid 4 ° C i upp till 3 månader för framtida bruk.
- Pre-varm DMEM, RPMI-1640, 0,25% trypsin / EDTA och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 37 ° C före framställning av makrofager för transfektion.
- Förbered siRNA för transfektion genom att tina på is. För att minimera antalet frysa tinar av siRNA, frysa nya siRNA i portioner första gången de används.
- I initiala experiment, använd siRNA vid en relativt hög dos av 2 | iM (utspädd 1:10 från 20 pM stockar). Därefter titreras siRNA som inducerar robust gen knockdown ner till lägre doser, men vanligtvis högre doser behövs för effektiv gen knockdown i makrofager jämfört med andra celltyper.
OBS: siRNA är tillgängliga från många håll, ganska robust gen knockdown kan erhållasanvänder siGenome SMARTPOOLs, som är pooler av fyra siRNA inriktade varje gen. Som en negativ kontroll, använder någon av olika icke-inriktning siRNA pooler eller siRNA. - För övervakning transfektionseffektiviteten, transfektera antingen pmaxGFP kontrollplasmiden (ges i Amaxa kit) eller fluorescensmärkta siRNA parallellt med de experimentella siRNA. Räkna med 30-50% transfektion av GFP plasmid (analyseras med mikroskopi eller flödescytometri dagen efter transfektion) och> 99% transfektion av fluorescensmärkt siRNA (analyseras med flödescytometri omedelbart efter transfektion och återvinning).
4. Förbereda makrofager för transfektion
- Drag av adherenta makrofager från cellodlingsskålar genom trypsinisering. Aspirera media och tvätta cellerna två gånger med 10 ml PBS. Efter avlägsnande av PBS, inkubera cellerna med förvärmda 0,25% trypsin / EDTA (1 ml / 10 cm platta) under 1-2 min tills cellerna börjar lossna. Knacka försiktigt på plattan och flytta lösningartion under inkubationstiden för att maximera trypsinization.
- Efter inkubationen, tillsätt 9 ml DMEM + FBS-medium, blanda försiktigt upp och ner, och samla upp cellerna genom pipettering in i ett sterilt rör.
- Räkna antalet isolerade makrofager med användning av en hemocytometer. Räkna med ungefär 10 miljoner makrofager per 10 cm platta. Beräkna det totala antalet makrofager som behövs; varje brunn på 96 brunnar shuttle kräver 200.000 celler. Kom ihåg att lägga några extra brunnar värde av celler för att möjliggöra pipettering förluster.
- Pipettera den beräknade antalet celler i ett centrifugrör. Centrifugera cellerna under 10 min vid 150 xg vid rumstemperatur. Centrifugera inte för fort eftersom detta kommer att minska makrofag hälsa och transfektionseffektivitet.
5. Nucleofection av makrofager med siRNA
- Med användning av en steril 96-brunnars rundbottnad platta (vilket underlättar blandning och samtidigt minimera reagensförlust), tillsätt 2 pl av varje siRNA till varje brunn för att vara transfected.
Anmärkning: Beroende på antalet siRNA, detta kan åstadkommas under makrofag centrifugeringssteget. - Aspirera media från de centrifuge cellerna. Försiktigt resuspendera cellerna i Nucleofector ™ -lösning SF (som innehåller tillägget lösningen), med hjälp av 20 pl per 200.000 celler pelleterat. När suspenderas, använd cellerna omedelbart för optimal transfektion.
- Överför resuspenderade cellerna i en steril tråg; med hjälp av en flerkanalig pipett 20 ul av den suspenderade cellblandningen i varje brunn på 96-brunnar innehåller siRNA. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned.
- Transfer 20 pl av cell / siRNA blandningen i 96-brunnars Nucleocuvette ™ platta Kritisk steg:. Undvika alstring bubblor under överföringssteget, eftersom detta kan inducera fel under Nucleofection.
- Efter att ha placerat alla experimentella prov i transfektion plattan, täcker 96-brunnar med medföljande lock och very knacka försiktigt mot en hård yta för att avlägsna eventuella bubblor från proverna.
- Placera 96-brunnar med lock i 96 brunnar Nucleofector shuttle och välj "ladda upp och börja" längst ner till höger på programskärmen. Före Nucleofection, följa programmet prompten för att spara resultatet.
Obs: Under Nucleofection processen brunnar framgångsrikt transfekterade kommer att avbildas på 96-väl schematiskt på skärmen med en grön cirkel med ett plustecken. En röd cirkel med minustecken indikerar ett fel, mest sannolikt på grund av bubblor eller mis-pipettering korrekt volym av reagenser.
6. Återvinning och plätering av makrofager
- Omedelbart efter Nucleofection, med användning av en multikanalpipett, tillsätt 80 | il av förvärmt (37 ° C) RMP1-1640 media till varje brunn. Lägg media att den sida av varje brunn, så att medierna att långsamt blanda med de transfekterade cellerna, som är mycket känslig i detta skede. Lägg inte till media för fort, eftersom detta kommerkraftigt minskar lönsamheten.
- Placera de 96-brunnars plattor med transfekterade prover och RPMI-1640 i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 2 min; detta är avgörande för att tillåta cellerna att återhämta sig före ytterligare manipulering.
- Avlägsna 96-brunnar från inkubatorn och noggrant överföra blandningen från varje brunn i en 96-brunnars vävnadsodlingsplatta med hjälp av en flerkanalspipett.
- Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt 100 ìl av förvärmda (37 ºC) DMEM + FBS medium till varje brunn.
- Inkubera 96-brunnars vävnadsodlingsplatta med proverna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 24-36 h (optimera den exakta tidpunkten för enskilda siRNA, även om detta tidsområde i allmänhet fungerar bra).
7. Stimulering av makrofager med LPS
- Efter 24 till 36 h efter Nucleofection inkubation förbereda LPS (eller annan PAMPs) i färskt medium. Förbered tillräckligt färskt medium för alla brunnar (200 ^ media / brunn av 96-brunnar plus lite extra för pipettering). Späd LPS till en slutkoncentration av 20 ng / ml i DMEM + FBS.
- Försiktigt aspirera media från 96-brunnar och tillsätt färskt medium innehållande LPS till cellerna.
- Övervaka svar på LPS eller andra PAMPs vid olika tidpunkter efter stimulering. 6 h är tillräcklig för att generera en robust inflammatoriska cytokinet respons för cytokiner, såsom IL-6 eller TNFa.
8. Övervakning av Induced Innate immunsvar, Gene Knockdown och livskraft i makrofager
- Att övervaka LPS-inducerad cytokinproduktion, pipettera supernatanten från cellerna in i en 96-brunnars lagringsplattan. Cytokinproduktion kan sedan mätas genom ELISA.
- När supernatanten avlägsnats, övervaka cellviabiliteten med användning av fluorescein-diacetat (när spaltas genom cellulära esteraser i levande celler, blir denna förening fluorescerande). Identifiera siRNA som riktar gener som styr cellernas livsduglighet med hjälp av thans inställning. Notera: transfektionsbehandlingen själv borde ha liten effekt på lönsamheten om det utförs på rätt sätt.
- Lägg fluoresceindiacetat (5 mg / ml lager i aceton) till varje brunn (1: 100 slutlig spädning i PBS).
- Inkubera vid rumstemperatur under 1 till 5 min och sedan övervaka fluorescens i cellerna med användning av en plattläsare (460 nm excitation, 515 nm emission).
- Valfritt: För att säkerställa att fluorescensen i brunnarna är likformig, lyserar cellerna med användning av buffertar såsom RIPA; Detta ger en enhetlig fluorescerande signal i brunnen, som vissa plattläsare är konfigurerade för att övervaka endast en liten del av den väl; om cellerna inte är pläterade likformigt kunde fluoresceindiacetat ge en felaktig avläsning.
- Som ett alternativ till övervakning av cellviabilitet, övervaka siRNA-inducerad gen knockdown av qPCR användning av RNA härlett från de vidhäftande cellerna.
- Efter det att supernatanten avlägsnats från cellerna (steg 8,1 ovan), add RLT-buffert (som används för lys och bevarande av RNA) direkt till de vidhäftande cellerna för att lysera dem.
- Isolera RNA med användning av en RNA-preparation kit såsom RNeasy mini-kit, och använder qPCR med genspecifika primrar för att övervaka genen knockdown i förhållande till kontroll siRNA-behandling. Använd primers till Βactin eller GAPDH för normalisering.
- Som ett annat alternativ för att övervaka andra aspekter av den medfödda immunsvar, övervaka den fagocytiska förmågan hos makrofager genom tillsats av FITC-märkt E. coli-partiklar direkt på de vidhäftande cellerna med hjälp av ett kit. Efter tillverkarens protokoll, vilket bara tar några timmar, övervaka fagocytisk upptagning med hjälp av en plattläsare eller mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera effektiviteten för transfektion med användning av detta tillvägagångssätt, övervakas vi upptag av FITC-märkt siRNA med användning av en flödescytometer (Figur 1).
För att illustrera användbarheten av vår strategi för att övervaka det medfödda immunsvar, transfekterade vi siRNA riktade mot kända medfödda immun regulatoriska gener i RAW264.7 makrofagcellinje, stimulerades cellerna med LPS, och övervakas därefter produktion av proinflammatoriska cytokiner IL- 6 och TNFa. Olika TLRs känner igen olika PAMPs, med LPS från gramnegativa bakterier som erkänns av TLR4 20, lipopeptider såsom PAM3CSK4 erkänts av TLR2 21, och dsRNA från virus såsom härma poly (I: C) som erkänns av TLR3 22,23. Såsom visas i figur 2, hämning av TLR4 (men inte andra TLRs använder siRNA) avtar starkt produktion av LPS-inducerad IL-6 och TNFa. Dessutom minskar även inhibition av IL-6 med siRNA IL-6 produktion utan att påverka TNFa-produktion (jämför panel A till B i figur 2).
Figur 1: FITC-märkt siRNA effektivt transfekteras in i mus-makrofagcellinje J774A.1 med användning av de beskrivna metoderna Omedelbart efter transfektion tvättades cellerna flera gånger, fixerades i paraformaldehyd, och fluorescens övervakades genom flödescytometri.. Figuren jämför celler inkuberade i närvaro av FITC-siRNA som antingen transfekterades (blå kurva) eller inte (röd kurva).
Figur 2: Effekt och specificitet siRNA i mus makrofagcellinje RAW264.7. RAW264.7-celler transfekterades med de angivna siRNA (antingen styra icke-riktat siRNA pooler # 1 eller 2 eller siRNA som riktar TLR4, TLR3, TLR2, eller IL-6 såsom indikeras). 24 h senare, stimulerades cellerna med 20 ng / ml LPS för 6 h och cytokinproduktion (antingen IL-6 i panel A eller TNFa i panel B därefter övervakas med ELISA. Asterisker indikerar värdet signifikant skilt från kontrollbehandling (p <0,05 , t-test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett flertal studier har publicerats där enskilda gener har måltavla siRNA i murina makrofager. Även lipid-medierad transfektion har använts för att leverera siRNA till makrofagcellinjer på individuell basis, dessa metoder lider potentiella effekter på lönsamheten, begränsad gen knockdown, och variationen från gen till gen. För att utveckla mer robusta analyser som kan användas för att rikta in gener i medel- eller hög genomströmning mode, optimerad vi tekniker som använder den Amaxa Nucleofector 96-brunnars pendelsystem, som uppvisar en mer konsekvent genen knockdown och begränsade effekter på viabilitet (detta mer robust Systemet är dyrare än lipid-medierade metoder). Många variabler testades för att optimera dessa förfaranden. Vi skulle kunna använda detta system för att effektivt leverera siRNA till många olika primära makrofager och odödlig makrofagcellinjer (i vissa fall nödvändiga använder Amaxa 96 brunnar cellinje optimeringssats). Jagn preliminära tester med dessa olika mus makrofagcellinjer (RAW264.7, J774A.1 och MH-S) och primära celler (tioglykollat-framkallade och benmärg makrofager), fann vi att RAW264.7 och J774A.1 celler uppvisade den mest robusta siRNA-inducerad gen knockdown (följt av MH-S och primära celler, respektive inte data visas). Eftersom dessa två immortaliserade makrofagcellinjer används vanligen för studie, optimerad vi våra RNAi förfarandena ytterligare med hjälp av dessa linjer.
För övervakning transfektionseffektiviteten använder vi antingen kontrollen GFP plasmid i Nucleofector kit eller FITC-märkt siRNA. GFP-plasmiden uppvisar stark fluorescens dagen efter transfektion med transfektionseffektiviteten av 30-50% såsom analyserades mikroskopiskt eller med flödescytometri (data ej visade). Med FITC-märkt siRNA, observerar vi> 99% transfektionseffektivitet enligt analys med flödescytometri (dsRNA transfects bättre än plasmid-DNA). Medan det är viktigt att vänta på fluorescens tilluppstå vid användning av GFP plasmid, bör den fluorescerande siRNA övervakas relativt snart efter transfektion eftersom den fluorescerande signalen försvagas med tiden.
Transfektion under de beskrivna förhållandena inte har en betydande inverkan på cellernas livskraft. Vi följer vanligtvis cellviabiliteten följa våra siRNA behandlingar med fluoresceindiacetat. Denna förening är inte fluorescerande; emellertid då klyvas genom cellulära esteraser i levande celler, blir det fluorescerande. Dessutom är den fluorescerande formen därefter kvarhållas i celler med ett intakt plasmamembranet 24. Denna fluorescens-baserad analys är en relativt enkel, snabb och billig analys för att övervaka cellviabilitet, även om det finns andra mer sofistikerade analyser som till exempel övervakar cellulära ATP-nivåer.
Vi analys vanligtvis våra celler för medfödda immunförsvar 24-36 timmar efter transfektion, som ligger på den tidiga sidan för RNAi jämfört med andra cellinjer. While man måste vänta på att endogena proteiner att lämna över för att underlätta gen knockdown, måste man balansera detta med förlust av siRNA potens, och vi finner mer robust knockdown i dessa makrofager rader på något tidiga tider än den typiska 48-72 tim används i andra celltyper. Även om det är att föredra att övervaka proteinnivåer av western blot, vi vanligtvis övervakar mRNA-nivåer av qPCR, med målet att studera flera gener samtidigt, där flera antikroppar och western blotting kanske inte praktiskt. Vi använder LPS vid den minimala dos som maximerar produktion av inflammatorisk cytokin.
När du riktar nya gener med siRNA, börjar vi med den relativt höga siRNA dos som beskrivs i protokollet och sedan titreras ned siRNA som inducerar en fenotyp. Efterföljande kontroller som syftar till att undvika ej åsyftade effekter inkluderar användning av flera siRNA duplex för att avgöra om fler än en siRNA kan framkalla samma fenotyp, verifiera gen knockdown av qPCR eller western blot, och med hjälp av GEne överuttryck studier för att komplettera RNAi synsätt. Dessa tillvägagångssätt bör göra det möjligt för snabb identifiering av gener som reglerar medfödd immunitet i musmakrofager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Denna artikel var sponsrad av Lonza, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electroporation | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFα Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. The macrophage. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. Methods in Cellular Immunology. 8, CRC Press. 8 (2001).
