Introduction
I denne protokol, beskriver vi effektive metoder til at hæmme gener i mus makrofagcellelinier anvender siRNAs og overvåge virkningerne af disse behandlinger på medfødte immunreaktion. Disse procedurer udføres i 96-brønds format, hvilket muliggør RNAi skærme i mellem- eller høj-throughput fashion.
Som reaktion på infektion, mennesker montere en øjeblikkelig medfødte immunreaktion og en reaktion langsommere, men mere specifikt adaptive immunrespons. Denne respons hurtig medfødte immunforsvar involverer rekruttering og aktivering af fagocytiske medfødte immunceller, herunder makrofager 1. Klassisk aktiverede makrofager er involveret i akutte inflammatoriske reaktioner og producere antimikrobielle proteiner og forbindelser, cytokiner og chemokiner, og præsentere antigener 2,3. Alternativt aktiverede makrofager spiller en rolle i reguleringen af immunitet, opretholde tolerance, vævsreparation og sårheling 4-8. På grund af deres brede vifte af funktionerKan makrofager spille en rolle i mange sygdomme, herunder atherosclerose, arthritis og cancer 9. Således har studiet af makrofager været et centralt område for forskning i nogen tid i en lang række sygdomstilstande områder.
På trods af deres betydning i medfødte immunreaktion, kan makrofager være udfordrende celler til at arbejde med. Især er det vanskeligt at opnå effektiv transfektion ved hjælp af lipid reagenser i makrofager uden associeret toksicitet 10,11. Selv når siRNA effektivt leveret til makrofager kan robustheden af RNAi-induceret gen knockdown ofte være temmelig moderat og kan variere fra gen til genet.
For at overvinde disse tekniske udfordringer har vi optimeret transfektion og knockdown teknikker 12-16 i to mus makrofagcellelinier, RAW264.7 17 og J774A.1 18. Denne fremgangsmåde bruger Amaxa Nucleofector 96 brønde Shuttle System for transfektion; dette systemanvender en kombination af specialiserede reagenser og elektroporering til at transficere celler i 96-brønds format 19. Efter transfektion beskriver vi metoder til at maksimere celle genopretning og levedygtighed og for at maksimere efterfølgende siRNA-induceret gen knockdown. For at illustrere anvendeligheden af denne tilgang, beskriver vi en protokol for siRNA levering til disse makrofagcellelinier, stimulere disse celler med lipopolysaccharid (LPS), og overvåge respons på niveau med produktion af flere pro-inflammatoriske cytokiner medfødte immunforsvar. Vi leverer prøve data, hvor vi målretter Toll-lignende receptor (TLR) familie, hvis medlemmer fornemmer LPS og andre patogen forbundet molekylære mønstre (PAMPs), at regulere medfødte immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedligeholdelse af makrofagcellelinier
- Grow RAW264.7 og J774A.1 cellelinier i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ºC i nærvær af 5% CO 2. At hjælpe med at opretholde sterilitet, tilsættes 1% penicillin / streptomycin (pen / strep) til medierne (selv om dette ikke er strengt nødvendigt).
- Kritisk trin: Sørg for, at makrofager vokser i en sund tilstand til effektiv transfektion og siRNA-induceret gen knockdown. Brug celler mellem passager 3 og 10 efter frisk optøning, da disse makrofaglinjer udviser den bedste transfektionseffektivitet og opretholde robust post-transfektion overlevelse på dette stadium; ikke bruge en højere passage nummer (> 20), som transfektion effektivitet og gen knockdown begge mindskes betydeligt.
- For optimeret siRNA transfektion plade celler ved 20% sammenflydning og vokse en eller to dage, indtil cellerne når ikke mere end 80% sammenløb. Tilgroede celler vil ikke transficere efficiently.
2. Programmering af 96 brønde Shuttle System for Transfection
- Start 96-brønds shuttle software på computeren forbundet til shuttle. Vælg ny parameter fil fra øverste venstre menuen File.
- Fremhæve de brønde, der transficeres på den viste plade med 96 brønde skematisk. En grøn boks vil angive, hvilke brønde der er valgt.
- Vælge det program, der svarer til den makrofag cellelinie anvendes (DS-136 for RAW264.7 eller DS-130 for J774A.1) og vælg anvendelse, placeret under et diagram 96-brønds plade. Bemærk, at efter valg af et program, vil brøndene på skematisk pladen farvet mørkeblå. Tomme cirkler angiver brønde, der ikke har fået tildelt et program og vil ikke blive chokeret.
3. Forberedelse af reagenser til transfektion
- Klargør arbejder Nucleofector ™ løsning ved at blande SF cellelinje 96 brønde Nucleofector ™ løsningmed hele indholdet af den medfølgende supplement røret. Lad den blandede reagenser til at ækvilibrere ved stuetemperatur før brug. Lagre overskydende komplet Nucleofector ™ løsning ved 4 ºC i op til 3 måneder for fremtidig brug.
- Pre-varm DMEM, RPMI-1640, 0,25% trypsin / EDTA, og phosphatpufret saltvand (PBS) ved 37 ºC før fremstilling af makrofager til transfektion.
- Forbered siRNA til transfektion af optøning på is. For at minimere antallet af fryse smelter af siRNA, fryse nye siRNAs i portioner første gang de anvendes.
- I indledende forsøg bruge siRNA ved en relativt høj dosis af 2 uM (fortyndet 1:10 fra 20 uM beholdninger). Efterfølgende titrering siRNA'er der inducerer robust gen knockdown ned til lavere doser, skønt der er behov typisk højere doser til effektiv gen knockdown i makrofager i forhold til andre celletyper.
BEMÆRK: siRNA'er er tilgængelige fra mange kilder; temmelig robust gen knockdown kan opnåshjælp siGenome SMARTPOOLs, som er puljer af fire siRNAs målrettet hvert gen. Som en negativ kontrol, bruge nogen af forskellige ikke-targeting siRNA puljer eller siRNAs. - For at overvåge transfektionseffektivitet transficere enten pmaxGFP kontrol plasmid (forudsat i Amaxa kits) eller fluorescens-mærkede siRNA'er parallelt med de eksperimentelle siRNA'er. Forvente 30-50% transfektion af GFP plasmid (analyseret ved mikroskopi eller flowcytometri dagen efter transfektion) og> 99% transfektion af fluorescens-mærket siRNA (analyseret ved flowcytometri umiddelbart efter transfektion og nyttiggørelse).
4. Forberedelse af makrofager til transfektion
- Frigør adhærente makrofager fra cellekulturskåle ved trypsinbehandling. Aspirere medierne og vaske cellerne to gange med 10 ml PBS. Efter fjernelse af PBS, inkuberes cellerne med forvarmet 0,25% trypsin / EDTA (1 ml / 10 cm plade) i 1-2 min, indtil cellerne begynder at løsne sig. Bank let på pladen, og flyt Solution under inkubationen for at maksimere trypsinbehandling.
- Efter inkuberingen tilsættes 9 ml DMEM + FBS medier, bland forsigtigt op og ned, og indsamle cellerne ved pipettering i et sterilt rør.
- Tæl antallet af isolerede makrofager ved hjælp af et hæmocytometer. Forvent omkring 10 millioner makrofager pr 10 cm plade. Beregn det samlede antal af makrofager, der er nødvendige; hver brønd på 96-brønds shuttle kræver 200.000 celler. Husk at tilføje et par ekstra brønde værd af celler til at give mulighed for pipettering tab.
- Pipettere det beregnede antal af celler i et centrifugerør. Centrifuger cellerne i 10 minutter ved 150 xg ved stuetemperatur. Må ikke centrifugeres for hurtigt, da dette vil mindske makrofag sundhed og transfektionseffektivitet.
5. nucleofection af makrofager med siRNA
- Anvendelse af en steril 96-brønds rundbundet plade (hvilket letter blanding og samtidig minimere tab af reagens), tilsættes 2 pi af hver siRNA til hver brønd for at være transfected.
Bemærk: Afhængigt af antallet af siRNAs, dette kan ske under makrofag centrifugering. - Aspirer mediet fra de centrifugerede celler. Forsigtigt opblande cellerne i Nucleofector ™ løsning SF (indeholdende tillægget løsning), ved hjælp af 20 pi per 200.000 celler pelleteret. Når resuspenderes bruge cellerne straks for optimal transfektion.
- Overfør resuspenderede celler i en steril trug; ved anvendelse af en multikanal pipette 20 pi af den resuspenderede celler blandingen i hver brønd af 96-brønds plade indeholdende siRNAs. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned.
- Overfør 20 ul af celle / siRNA blandingen i 96-brønds Nucleocuvette ™ plade Kritisk trin:. Undgå at skabe bobler under trin overførslen, da dette kan fremkalde fejl under nucleofection.
- Efter at placere alle de eksperimentelle prøver i transfektion plade, dække 96-brønds plade med den medfølgende låg og very forsigtigt trykke på en hård overflade for at fjerne eventuelle bobler fra prøverne.
- Anbring 96-brønds plade med låg i 96-godt Nucleofector shuttle og vælg 'uploade og starte' nederst til højre på skærmen program. Forud for nucleofection, følge programmet bedt om at gemme resultaterne.
Bemærk: Under nucleofection processen brønde held tranfekterede vil blive afbildet på 96-godt skematisk på skærmen med en grøn cirkel med et plustegn. En rød cirkel med minustegn angiver en fejl, sandsynligvis på grund af bobler eller mis afpipettering den korrekte mængde af reagenser.
6. Inddrivelse og Plating af makrofager
- Umiddelbart efter nucleofection anvendelse af en multikanalpipette, tilsættes 80 pi foropvarmede (37 ° C) RMP1-1640 medier til hver brønd. Tilsæt medier på siden af hver brønd, så medierne langsomt blandes med de transficerede celler, som er meget delikat på dette stadium. Tilsæt ikke mediet for hurtigt, da dette vili høj grad reducere levedygtighed.
- Placer 96-brønds plader med transficerede prøver og RPMI 1640 i en 37 ºC inkubator med 5% CO 2 for 2 min; dette er kritisk for at tillade cellerne at inddrive inden yderligere manipulation.
- Fjern 96-brønds plade fra inkubatoren og omhyggeligt overføre blandingen fra hver brønd i en 96-brønds vævskulturplade hjælp af en multikanalpipette.
- Ved hjælp af en multikanal pipette tilsættes 100 pi forvarmet (37 ºC) DMEM + FBS medium til hver brønd.
- Inkubér 96-brønds vævskulturplade med prøver i et 37 ° C inkubator med 5% CO 2 for 24-36 timer (optimere den nøjagtige timing for individuelle siRNAs, skønt dette tidsinterval generelt fungerer godt).
7. Stimulering af makrofager med LPS
- Efter 24-36 timer efter nucleofection inkubation forberede LPS (eller andre PAMPs) i frisk medium. Forbered nok frisk medium for alle brønde (200 pi medier / brønd af 96-brønds plade plus lidt ekstra for pipettering). Fortynd LPS til en endelig koncentration på 20 ng / ml i DMEM + FBS.
- Omhyggeligt aspiratprøver medier fra 96-brønds plade og tilsæt friske medier, der indeholder LPS til cellerne.
- Overvåg reaktion på LPS eller andre PAMPs på forskellige tidspunkter efter stimulering. 6 timer er tilstrækkelig til at frembringe en robust inflammatoriske cytokin respons for cytokiner, såsom IL-6 eller TNFa.
8. Overvågning af induceret Innate immunrespons, Gene Knockdown og levedygtighed i makrofager
- At overvåge LPS-induceret cytokinproduktion afpipettér supernatanten fra cellerne i en 96-brønds plade opbevaring. Cytokinproduktion kan derefter målt ved ELISA.
- Når supernatanten fjernet, overvåge cellelevedygtighed hjælp fluoresceindiacetat (ved spaltning ved cellulære esteraser i levende celler, bliver denne forbindelse fluorescerende). Identificere siRNAs der er målrettet mod gener, der styrer cellelevedygtighed under anvendelse af thans tilgang. Bemærk: transfektionsblandingen selve processen bør have ringe effekt på levedygtighed, hvis udført korrekt.
- Tilføj fluoresceindiacetat (5 mg / ml stamopløsning i acetone) til hver brønd (1: 100 endelig fortynding i PBS).
- Der inkuberes ved stuetemperatur i 1-5 minutter og derefter overvåge fluorescens i cellerne under anvendelse af en pladelæser (460 nm excitation, 515 nm emission).
- Valgfrit: For at sikre, at fluorescens i brøndene er ensartet, lyserer cellerne under anvendelse af buffere, såsom RIPA; dette giver en ensartet fluorescerende signal i brønden, som nogle pladeaflæsere er konfigureret til at overvåge kun en lille del af brønden; Hvis cellerne ikke er belagt ensartet, kan fluoresceindiacetat giver en unøjagtig aflæsning.
- Som et alternativ til overvågning af cellelevedygtighed overvåge siRNA-induceret gen knockdown af qPCR anvendelse af RNA afledt af de adhærerende celler.
- Efter at supernatanten er fjernet fra cellerne (trin 8.1), add RLT buffer (som anvendes til lysis og bevarelse af RNA) direkte til de adhærente celler til at lysere dem.
- Isolere RNA under anvendelse af et RNA-præparat kit såsom RNeasy mini-kit, og bruge qPCR med genspecifikke primere til at overvåge gen knockdown forhold til kontrol siRNA behandling. Brug primere til Βactin eller GAPDH til normalisering.
- Som et andet alternativ til at overvåge andre aspekter af den medfødte immunreaktion overvåge den fagocytiske evne til makrofager ved tilsætning af FITC-mærket E. coli partikler direkte på de adhærerende celler ved anvendelse af et kit. Efter producentens protokol, som tager kun et par timer, overvåge fagocytisk optagelse ved hjælp af en pladelæser eller mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere effektiviteten af transfektion ved anvendelse af denne fremgangsmåde, monitorerede vi optagelse af FITC-mærket siRNA anvendelse af et flowcytometer (figur 1).
For at illustrere anvendeligheden af vores fremgangsmåde til overvågning af medfødte immunreaktion, transficerede vi siRNA'er rettet mod kendte medfødte immun regulerende gener i RAW264.7 makrofag cellelinie stimulerede cellerne med LPS, og derefter overvåges produktionen af de pro-inflammatoriske cytokiner IL 6 og TNFa. Forskellige TLRs genkende forskellige PAMPs, med LPS fra Gram-negative bakterier er anerkendt af TLR4 20 lipopeptider såsom PAM3CSK4 anerkendt af TLR2 21 og dsRNA fra vira, såsom mimic poly (I: C) anerkendt af TLR3 22,23. Som vist i figur 2, hæmning af TLR4 (men ikke andre TLR'er hjælp siRNA) kraftigt formindsker produktion af LPS-induceret IL-6 og TNFa. Desuden hæmning af IL-6 med siRNA også mindsker IL6-produktion og ikke påvirker TNFa-produktion (sammenlign panel A til B i figur 2).
Figur 1: FITC-mærket siRNA effektivt transficeres i muse-makrofag cellelinje J774A.1 anvendelse af de beskrevne metoder Umiddelbart efter transfektion blev cellerne vasket adskillige gange, fikseret i paraformaldehyd, og fluorescens blev monitoreret ved flowcytometri.. Figuren sammenligner celler inkuberet i nærvær af FITC-siRNA, der enten blev transficeret (blå kurve) eller ej (røde kurve).
Figur 2: Effekt og specificitet siRNA i muse makrofagcellelinie RAW264.7. RAW264.7-celler blev transfekteret med de angivne siRNAs (enten styre ikke-targetting siRNA pools # 1 eller 2 eller siRNAs, der er målrettet TLR4, TLR3, TLR2, eller IL-6 som angivet). 24 timer senere blev celler stimuleret med 20 ng / ml LPS i 6 timer og cytokinproduktion (enten IL-6 i panel A eller TNFa i panel B blev efterfølgende overvåget ved ELISA. Stjerner angiver værdien signifikant forskellig fra kontrol behandling (p <0,05 , t-test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Talrige undersøgelser er blevet offentliggjort i de enkelte gener er blevet rettet af siRNA i murine makrofager. Mens lipidmedieret transfektion er blevet brugt til at levere siRNA til makrofagcellelinier på et individuelt grundlag, disse metoder lider potentielle virkninger på levedygtighed, begrænset gen knockdown, og variabilitet fra gen til gen. At udvikle mere robuste analyser, der kunne bruges til at målrette gener i mellem- eller high-throughput fashion, vi optimerede teknikker, der anvender den Amaxa nucleofector 96 brønde shuttle system, som udviser mere konsekvens i gen knockdown og begrænsede virkninger på levedygtighed (dette mere robust system er dyrere end lipid-medierede fremgangsmåder). Mange variabler blev testet for at optimere disse procedurer. Vi var i stand til at bruge dette system til effektivt at levere siRNA til mange forskellige primære makrofager og udødeliggjort makrofagcellelinier (i nogle tilfælde nødvendiggjorde vha Amaxa 96 brønde cellelinie optimering kit). Jegn indledende forsøg med disse forskellige mus makrofagcellelinier (RAW264.7, J774A.1 og MH-S) og primære celler (thioglycollat-fremkaldte og knoglemarv-afledte makrofager), fandt vi, at RAW264.7 og J774A.1 celler udviste den mest robuste siRNA-induceret gen knockdown (efterfulgt af MH-S og primære celler, henholdsvis data ikke vist). Da disse to udødeliggjort makrofagcellelinier er almindeligt anvendt for at studere, vi optimeret vores RNAi procedurer yderligere ved hjælp af disse linjer.
For at overvåge transfektionseffektivitet vi enten bruge kontrol GFP plasmid i nucleofector kits eller FITC-mærket siRNA. GFP plasmid udviser stærk fluorescens dagen efter transfektion med transfektionseffektivitet på 30-50% som analyseret mikroskopisk eller ved flowcytometri (data ikke vist). Med FITC-mærket siRNA, observere vi> 99% transfektionseffektivitet som analyseret ved flowcytometri (dsRNA transfects bedre end plasmid DNA). Selv om det er vigtigt at vente for fluorescensudvikle ved brug af GFP plasmid, skal den fluorescerende siRNA overvåges relativt hurtigt efter transfektion, fordi det fluorescerende signal svækker med tiden.
Transfektion under de beskrevne betingelser ikke har en væsentlig indvirkning på cellernes levedygtighed. Vi overvåger typisk cellelevedygtighed efter vores siRNA behandlinger ved hjælp fluoresceindiacetat. Denne forbindelse er ikke fluorescerende; men når spaltes af cellulære esteraser i levende celler, bliver fluorescerende. Desuden er den fluorescerende form, så forbliver i cellerne med en intakt plasmamembran 24. Denne fluorescens-baseret assay er en forholdsvis enkel, hurtig og billig analysen til overvågning cellelevedygtighed, selv om der er andre mere avancerede assays, for eksempel overvåge cellulære ATP-niveauer.
Vi typisk assay vores celler for medfødte immunfunktion 24-36 timer efter transfektion, hvilket er på den tidlige side for RNAi sammenlignet med andre cellelinjer. While man skal vente på endogene proteiner at slå over til at lette gen knockdown, må man afbalancere dette med tab af siRNA potens, og vi finder mere robust knockdown i disse makrofaglinjer på lidt tidlige tider end den typiske 48-72 timer brugt på en anden celletyper. Selv om det er at foretrække at overvåge proteinniveauer ved Western blot, vi typisk overvåge mRNA-niveauer af qPCR, med det formål at studere multiple gener på en gang, som flere antistoffer og western blots ikke kan være praktisk. Vi bruger LPS på den minimale dosis, der maksimerer inflammatorisk cytokinproduktion.
Når du målretter nye gener med siRNA, vi starter med den relativt høje siRNA dosis beskrevet i protokollen og derefter titreres ned siRNAs der inducerer en fænotype. Efterfølgende kontrol med henblik på at undgå ikke-tilsigtede virkninger omfatter brug af flere siRNA-duplexer at afgøre, om mere end én siRNA kan fremkalde den samme fænotype, kontrol gen knockdown af qPCR eller western blot, og ved hjælp af GEne overekspression undersøgelser til at supplere RNAi tilgang. Disse tiltag skal give mulighed for hurtig identifikation af gener, der regulerer medfødte immunitet i musemakrofager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser. Denne artikel blev sponsoreret af Lonza, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electroporation | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFα Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. The macrophage. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. Methods in Cellular Immunology. 8, CRC Press. 8 (2001).
