Introduction
In dit protocol beschrijven we efficiënte methoden om genen in muizen macrofaag cellijnen met siRNA remmen en de effecten van de behandelingen die de aangeboren immuunrespons. Deze procedures worden uitgevoerd in 96-well formaat, waardoor RNAi schermen in middel- of high-throughput wijze.
In reactie op infectie, mens zet onmiddellijk aangeboren immuunrespons en een trager, maar specifieker adaptieve immuunrespons. Deze snelle aangeboren immuunrespons impliceert de werving en activering van fagocyterende aangeboren immuuncellen waaronder macrofagen 1. Klassiek geactiveerde macrofagen betrokken zijn bij acute ontstekingsreacties en produceren antimicrobiële eiwitten en verbindingen, cytokinen en chemokinen, en presenteren antigenen 2,3. Alternatief geactiveerde macrofagen een rol spelen bij het reguleren van de immuniteit, het handhaven tolerantie, weefselherstel en wondgenezing 4-8. Vanwege hun gemak functies, Macrofagen een rol in talrijke ziekten zoals atherosclerose, artritis, kanker en 9 spelen. Zo is de studie van macrofagen is een belangrijk onderzoeksgebied enige tijd in diverse ziektecategorieën.
Ondanks hun belang in de aangeboren immuunrespons, kan macrofagen uitdagend cellen om mee te werken. In het bijzonder is het moeilijk om doelmatige transfectie met lipide reagentia in macrofagen te verkrijgen zonder geassocieerde toxiciteit 10,11. Zelfs wanneer siRNA efficiënt afgeleverd macrofagen, de robuustheid van RNAi-geïnduceerde gen vaak knockdown kan tamelijk gematigd zijn en kunnen variëren van gen tot gen.
Om deze technische uitdagingen te overwinnen, hebben wij transfectie en knock-down technieken 12-16 geoptimaliseerd in twee muis macrofaag cellijnen, RAW264.7 17 en J774A.1 18. Deze aanpak maakt gebruik van de Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem voor transfectie; dit systeemeen combinatie van speciale reagentia en elektroporatie cellen in 96-well formaat 19 transfecteren. Na transfectie, beschrijven we methoden om cel herstel en de levensvatbaarheid te maximaliseren en de daaropvolgende siRNA-geïnduceerde gen knockdown maximaliseren. Ter illustratie van de bruikbaarheid van deze benadering beschrijven we een protocol voor siRNA levering aan deze macrofaag cellijnen, stimuleren deze cellen met lipopolysaccharide (LPS), en bewaken de aangeboren immuunrespons op het productieniveau van verscheidene pro-inflammatoire cytokines. Wij bieden sample data in welke doelgroep we de Toll-like receptor (TLR) familie, waarvan de leden voelen LPS en andere pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), om aangeboren immuniteit te regelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Onderhoud van macrofaagcellijnen
- Groeien RAW264.7 en J774A.1 cellijnen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO2. Om steriliteit te behouden, voeg 1% penicilline / streptomycine (pen / strep) aan de media (hoewel dit niet strikt noodzakelijk).
- Kritische stap: Zorg ervoor dat de macrofagen groeien in een gezonde staat voor een efficiënte transfectie en siRNA-geïnduceerde gen-knockdown. Gebruik cellen tussen passages 3 en 10 na de verse ontdooien, omdat deze macrofagen lijnen vertonen de beste transfectie-efficiëntie en onderhouden robuuste post-transfectie overleven in deze fase; geen gebruik maken van een hogere passage aantal (> 20), zoals transfectie-efficiëntie en gen knockdown beide verminderen sterk.
- Voor optimale siRNA transfectie cellaag bij 20% confluentie groeien en één of twee dagen tot de cellen niet meer dan 80% confluentie bereiken. Overgrown cellen zullen niet transfecteren efficiently.
2. Het programmeren van de 96-well Shuttle Systeem voor Transfection
- Start de 96-well shuttle-software op de computer is aangesloten op de shuttle. Selecteer nieuwe parameter file vanaf linksboven bestand menu.
- Markeer de putjes die worden getransfecteerd op de getoonde 96-well plaat schema. Een groen vakje geeft aan welke bronnen zijn geselecteerd.
- Selecteer het programma dat overeenkomt met de macrofaag cellijn gebruikt (DS-136 voor RAW264.7 of DS-130 voor J774A.1) en selecteer toepassing, onder de diagramed 96-well plaat gelegen. Merk op dat na het selecteren van een programma, de putten op het schema plaat wordt gekleurd donkerblauw. Lege cirkels geven putten die niet zijn toegewezen aan een programma en zal niet geschokt.
3. Voorbereiden van de reagentia voor transfectie
- Bereid de werkende Nucleofector ™ oplossing door het mengen van SF-cellijn 96-well Nucleofector ™ -oplossingmet de volledige inhoud van de bijgevoegde supplement buis. Laat de gemengde reagentia equilibreren bij kamertemperatuur vóór gebruik. Slaan overtollige volledige Nucleofector ™ oplossing bij 4 ºC gedurende maximaal 3 maanden voor toekomstig gebruik.
- Voorverwarmen het DMEM, RPMI-1640, 0,25% trypsine / EDTA, en fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C alvorens met de macrofagen voor transfectie.
- Bereid de siRNA voor transfectie door ontdooien op ijs. Om het aantal vries dooi van de siRNA minimaliseren bevriezen nieuwe siRNA in aliquots de eerste keer gebruikt.
- In eerste experimenten gebruikt siRNA bij een relatief hoge dosis van 2 uM (verdund 1:10 van 20 uM voorraden). Vervolgens titreren siRNA's die robuuste gen knockdown neer op lagere doses veroorzaken, hoewel doorgaans hogere doseringen nodig zijn voor een efficiënte gen knock-down in macrofagen in vergelijking met andere soorten cellen.
OPMERKING: siRNA's zijn verkrijgbaar uit vele bronnen; vrij robuust gen knock-down kan worden verkregengebruik siGenome SMARTPOOLs die pools vier siRNAs targeting elk gen. Als negatieve controle, gebruik een van de verschillende niet-targeting siRNA zwembaden of siRNA's. - De transfectie-efficiëntie te controleren, of het transfecteren pmaxGFP controle plasmide (verschaft in de Amaxa kits) of fluorescentie-gemerkt siRNA parallel aan de experimentele siRNA. Verwacht 30-50% transfectie van het GFP plasmide (bepaald met microscopie of flowcytometrie de dag na transfectie) en> 99% transfectie van fluorescent-gelabelde siRNA (geanalyseerd door flow cytometrie onmiddellijk na transfectie en herstel).
4. Voorbereiding van de macrofagen voor Transfection
- Los aanhangend macrofagen uit de celkweek gerechten door behandeling met trypsine. Zuig het medium en was de cellen tweemaal met 10 ml PBS. Na verwijdering van het PBS, incubeer de cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine / EDTA (1 ml / 10 cm schaal) gedurende 1-2 min tot cellen beginnen te los. Tik voorzichtig de plaat en beweeg de oplostie tijdens de incubatie trypsine maximaliseren.
- Na de incubatie, voeg 9 ml DMEM + FBS media, meng voorzichtig op en neer, en verzamel de cellen door pipetteren in een steriele buis.
- Tel het aantal geïsoleerde macrofagen met behulp van een hemocytometer. Verwachten ongeveer 10 miljoen macrofagen per 10 cm plaat. Bereken het aantal macrofagen nodig; elke put op de 96-well shuttle vereist 200.000 cellen. Vergeet niet om de waarde van de cellen van een paar extra putten 'toe te staan voor pipetteren verliezen.
- Pipetteer het berekende aantal cellen in een centrifugebuis. Centrifugeer de cellen gedurende 10 min bij 150 xg bij kamertemperatuur. Wees niet te snel centrifugeren als deze macrofagen gezondheid en transfectie-efficiëntie zal afnemen.
5. Nucleofection van macrofagen met siRNA
- Met behulp van een steriele 96-well ronde bodemplaat (dat vergemakkelijkt het mengen terwijl het minimaliseren van reagens verlies), voeg 2 pi van elke siRNA aan elk putje te zijn transfweerspiegelde.
Opmerking: Afhankelijk van het aantal siRNAs, kan dit worden bereikt tijdens de macrofaag centrifugatiestap. - Zuig het medium van de cellen gecentrifugeerd. Voorzichtig resuspendeer de cellen in Nucleofector ™ oplossing SF (bevattende het supplement oplossing), met 20 gl per 200.000 cellen gepelleteerd. Eenmaal geresuspendeerd, gebruiken de cellen onmiddellijk voor optimale transfectie.
- Transfer geresuspendeerd cellen in een steriele trog; met een multichannel pipet 20 ul van de geresuspendeerde cellen mengsel in elk putje van de 96-well plaat met de siRNA. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren.
- Overdracht 20 ul van de cel / siRNA mengsel in de 96-well Nucleocuvette ™ plaat Kritische stap:. Vermijd genereren bubbels tijdens de overdracht stap als deze fouten tijdens Nucleofection kan induceren.
- Na het plaatsen van alle experimentele monsters in de transfectie, bovenkap de 96-well plaat met de ontvangen deksel en very tik zachtjes op een hard oppervlak om eventuele luchtbellen uit de monsters te verwijderen.
- Plaats 96-well plaat met deksel in de 96-well Nucleofector shuttle en selecteer 'uploaden en start' in de rechterbenedenhoek van het scherm programma. Voorafgaand aan Nucleofection, volgt het programma prompt om de resultaten op te slaan.
Opmerking: Bij het Nucleofection proces putjes succes getransfecteerd worden afgebeeld op de 96-well schema op het scherm een groene cirkel met een plusteken. Een rode cirkel met mintekens een fout aangeeft, waarschijnlijk door luchtbellen of verkeerd pipetteren de juiste hoeveelheid reagentia.
6. Herstel en Plating van macrofagen
- Onmiddellijk na Nucleofection, met een multichannel pipet wordt 80 ul voorverwarmde (37 ° C) RMP1-1640 medium aan elk putje. Voeg de media aan de zijkant van elk putje, waarbij de media langzaam mengen met de getransfecteerde cellen, die zeer gevoelig in dit stadium. Laat de media niet toe te snel, want dit zalsterk verminderen levensvatbaarheid.
- Plaats de 96-well platen met getransfecteerde monsters en RPMI-1640 in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 2 min; Dit is essentieel om de cellen voorafgaand aan manipulatie verdere herstellen.
- Verwijder de 96-well plaat uit de incubator en zorgvuldig overbrengen van het mengsel uit elk putje in een 96-well weefselkweek plaat met een multichannel pipet.
- Met een multichannel pipet, voeg 100 ul voorverwarmde (37 ° C) DMEM + FBS medium in elk putje.
- Incubeer de 96-well weefselkweek plaat met monsters in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 24-36 uur (optimaliseren precieze timing individuele siRNA, hoewel dit tijdsbereik algemeen goed werkt).
7. Stimulatie van macrofagen met LPS
- Na de 24-36 uur na Nucleofection incubatie, bereiden LPS (of andere PAMPs) in vers medium. Bereid voldoende vers medium van alle putjes (200 ul media / putje van de 96-well plaat plus een beetje extra voor pipetteren). LPS verdunnen tot een eindconcentratie van 20 ng / ml in DMEM + FBS.
- Zorgvuldig aspireren media van de 96-well plaat en voeg de vers medium met de LPS aan de cellen.
- Monitor de respons op LPS of andere PAMPs op verschillende tijdstippen na stimulatie. 6 uur is voldoende om een robuuste inflammatoire cytokine respons op cytokinen zoals IL-6 en TNFa genereren.
8. Controle op de Induced aangeboren immuunrespons, Gene Knockdown en levensvatbaarheid in macrofagen
- Bewaken LPS geïnduceerde cytokineproductie, pipet het supernatant van de cellen in een 96-wells plaat. Cytokineproductie kan dan gemeten door ELISA.
- Nadat de supernatant wordt verwijderd, monitoren cellevensvatbaarheid met fluoresceïne diacetaat (indien gesplitst door cellulaire esterasen in levende cellen, deze verbinding wordt fluorescerend). Identificeer siRNA's die genen te richten dat de levensvatbaarheid van cellen te controleren met behulp van de tzijn aanpak. Opmerking: de transfectie proces zelf moet weinig effect hebben op de levensvatbaarheid indien goed uitgevoerd.
- Voeg fluoresceïne diacetaat (5 mg / ml voorraad in aceton) aan elke well (1: 100 eindverdunning in PBS).
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende één tot vijf minuten en vervolgens controleren fluorescentie in de cellen met behulp van een plaatlezer (460 nm excitatie, 515 nm emissie).
- Optioneel: Om de fluorescentie in de putten uniform, lyseren van de cellen met buffers zoals RIPA; Dit verschaft een uniform fluorescent signaal in de put, zoals sommige plaatlezers zijn geconfigureerd om slechts een klein deel van de put te controleren; als de cellen niet gelijkmatig zijn bedekt, zou de fluoresceïnediacetaat een onjuiste lezing te geven.
- Als alternatief voor controle cellevensvatbaarheid, monitor-siRNA geïnduceerd gen knockdown door qPCR met RNA afkomstig van de hechtende cellen.
- Nadat het supernatant van de cellen verwijderd (stap 8.1), add RLT buffer (die wordt gebruikt voor lysis en conservering van RNA) direct aan de hechtende cellen te lyseren.
- Isoleer RNA met een RNA-preparaat kit zoals de RNeasy mini-kit en gebruik qPCR met genspecifieke primers bewaken gen knockdown opzichte van siRNA behandeling controleren. Gebruik primers Βactin of GAPDH voor normalisatie.
- Als een ander alternatief voor andere aspecten van de aangeboren immuunrespons controleren, bewaken de fagocytische capaciteit van macrofagen door toevoeging van FITC-gelabelde E. coli deeltjes direct op de hechtende cellen met een kit. Naar aanleiding van de fabrikant protocol, dat slechts een paar uur duurt, bewaken fagocyterende opname met behulp van een plaat lezer of microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de efficiëntie van transfectie deze aanpak demonstreren we gevolgd opname van FITC-gemerkt siRNA met een flow cytometer (figuur 1).
Ter illustratie van het nut van onze aanpak voor het bewaken van de aangeboren immuunrespons, transfecteerden wij siRNAs targeting bekend aangeboren immuun regulerende genen in de RAW264.7 macrofaag cellijn, de cellen gestimuleerd met LPS, en vervolgens gecontroleerd productie van pro-inflammatoire cytokines IL 6 en TNFa. Verschillende TLR's herkennen verschillende PAMPs, met LPS van Gram-negatieve bacteriën erkend door TLR4 20, lipopeptiden zoals PAM3CSK4 door TLR2 21, en dsRNA tegen virussen herkend zoals het nabootsen poly (I: C) erkend door TLR3 22,23. Zoals getoond in figuur 2, remming van TLR4 (maar niet andere TLR met siRNA) vermindert sterk de productie van LPS geïnduceerde IL-6 en TNFa. Bovendien remming van IL-6 met siRNA vermindert ook IL6 productie zonder dat afgeweken wordt TNFa productie (vergelijk paneel A naar B in figuur 2).
Figuur 1: FITC-gelabelde siRNA efficiënt getransfecteerd in de muizen macrofaag cellijn J774A.1 met de beschreven werkwijzen Onmiddellijk na transfectie werden de cellen herhaaldelijk gewassen, gefixeerd in paraformaldehyde, en fluorescentie werd gevolgd door flowcytometrie.. De figuur vergelijkt de cellen geïncubeerd in de aanwezigheid van FITC-siRNA getransfecteerde die ofwel zijn (blauwe curve) of niet (rode curve).
Figuur 2: Werkzaamheid en specificiteit van siRNA in de muis macrofaagcellijn RAW264.7. RAW264.7 cellen werden getransfecteerd met de aangegeven siRNAs (deze knoppen niet gericht siRNA pools # 1 of 2 of siRNA dat TLR4, TLR3, TLR2 of IL-6 aangegeven doel). 24 uur later werden de cellen gestimuleerd met 20 ng / ml LPS gedurende 6 uur en cytokineproductie (hetzij IL-6 in panel A of TNFa in paneel B werd vervolgens gecontroleerd door ELISA. Sterretjes geven waarde significant verschillend van controlebehandeling (p <0.05 , t-test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Talrijke studies gepubliceerd waarin individuele genen zijn het doelwit van siRNA in murine macrofagen. Terwijl lipide gemedieerde transfectie is gebruikt om siRNA leveren macrofaagcellijnen individueel, deze methoden lijden mogelijke effecten op de levensduur beperkt gen knockdown en variabiliteit van gen tot gen. Robuustere assays die kunnen worden gebruikt om genen in middel- of high-throughput fashion gericht ontwikkelen, optimaliseerden we technieken met de Amaxa Nucleofector 96 putjes pendelsysteem, die meer samenhang in gen knockdown en beperkte effecten op de levensvatbaarheid (deze robuuster vertoont systeem is duurder dan lipide mediumbenaderingen). Veel variabelen werden getest om deze te optimaliseren. We waren in staat om dit systeem te gebruiken om efficiënte wijze siRNA vele verschillende primaire macrofagen en macrofaag geïmmortaliseerde cellijnen (in sommige gevallen noodzakelijk met de Amaxa 96 putjes cellijn optimalisatie kit). Ikn voorproeven met deze verschillende muis macrofaag cellijnen (RAW264.7, J774A.1 en MH-S) en primaire cellen (thioglycollaat-opgewekte en beenmerg-afgeleide macrofagen), vonden we dat RAW264.7 cellen en J774A.1 vertoonde de meest robuuste siRNA geïnduceerde gen knockdown (gevolgd door MH-S en primaire cellen, respectievelijk, gegevens niet getoond). Zoals deze twee vereeuwigd macrofaagcellijnen vaak worden gebruikt voor studie, we geoptimaliseerd onze RNAi procedures verder met behulp van deze lijnen.
Om transfectie-efficiëntie te monitoren, we ofwel gebruik maken van de controle GFP plasmide in de Nucleofector kits of FITC-gelabeld siRNA. De GFP plasmide vertoont sterke fluorescentie de dag na transfectie met transfectie-efficiëntie van 30-50% als microscopisch of door flow cytometrie geanalyseerd (gegevens niet getoond). Met FITC-gemerkt siRNA, zien we> 99% transfectie efficiëntie bepaald door flow cytometrie (dsRNA transfects beter dan plasmide-DNA). Hoewel het belangrijk is om te wachten op fluorescentieontwikkelen bij gebruik van de GFP plasmide, moet de fluorescerende siRNA relatief snel worden gecontroleerd na transfectie omdat het fluorescentiesignaal met tijd verminderen.
Transfectie onder de beschreven omstandigheden geen significant effect op de levensvatbaarheid van de cellen niet. We monitoren doorgaans cel levensvatbaarheid na onze siRNA behandelingen met behulp fluoresceïnediacetaat. Deze verbinding is niet tl; echter, als gesplitst door cellulaire esterasen in levende cellen wordt fluorescerend. Bovendien wordt de fluorescente vorm dan vastgehouden in cellen met een intact plasmamembraan 24. Deze fluorescentie gebaseerde assay is een relatief eenvoudige, snelle en goedkope test levensvatbaarheid van de cellen te controleren, maar er zijn andere meer geavanceerde assays die bijvoorbeeld monitoren cellulaire ATP niveaus.
We assay typisch onze cellen aangeboren immuunsysteem 24-36 uur na transfectie, die op de eerste zijde van RNAi vergelijking met andere cellijnen. While men moet wachten op endogene eiwitten om te draaien om gen knock-down te vergemakkelijken, moet men dit evenwicht te brengen met het verlies van siRNA potentie, en vinden we meer robuuste knock-down in deze macrofagen lijnen op iets vroegere tijden dan de typische 48-72 hr gebruikt in andere celtypen. Hoewel het de voorkeur om eiwitniveaus door western blot volgen, wij doorgaans controleren mRNA niveaus door qPCR, met als doel het bestuderen van meerdere genen tegelijk, waarbij meerdere antilichamen en Western blots kan niet praktisch zijn. We gebruiken LPS aan de minimale dosis die inflammatoire cytokine productie maximaliseert.
Wanneer de doelgroep nieuwe genen met siRNA, beginnen we met de relatief hoge siRNA dosis in het protocol beschreven en titreer vervolgens neer siRNA's die een fenotype te induceren. Latere controles instellen om off-target effecten te voorkomen omvatten het gebruik van meerdere siRNA duplexen te bepalen of meer dan één siRNA hetzelfde fenotype kunnen veroorzaken, controle gen knockdown door qPCR of western blot en met gene overexpressie studies om de RNAi aanpak aan te vullen. Deze benaderingen moet het mogelijk maken voor de snelle identificatie van genen die aangeboren immuniteit in muizen macrofagen regelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. Dit artikel werd gesponsord door Lonza, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electroporation | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFα Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. The macrophage. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. Methods in Cellular Immunology. 8, CRC Press. 8 (2001).
