Introduction
In questo protocollo, si descrivono i metodi efficaci per inibire i geni in linee cellulari di macrofagi del mouse utilizzando siRNA e monitorare gli effetti di questi trattamenti sulla risposta immunitaria innata. Queste procedure vengono eseguite in formato a 96 pozzetti, consentendo schermi RNAi in modo medio o high-throughput.
In risposta alle infezioni, gli esseri umani montare una risposta immunitaria innata immediata e una risposta immunitaria adattativa lento ma più preciso. Questa rapida risposta immunitaria innata coinvolge il reclutamento e l'attivazione delle cellule immunitarie innate fagociti, tra cui i macrofagi 1. Classicamente macrofagi attivati sono coinvolti nelle risposte infiammatorie acute e producono proteine antimicrobiche e composti, citochine e chemochine, e presentano antigeni 2,3. In alternativa macrofagi attivati svolgono un ruolo nella regolazione del sistema immunitario, mantenendo la tolleranza, la riparazione dei tessuti e la guarigione delle ferite 4-8. A causa della loro vasta gamma di funzioni, I macrofagi possono svolgere un ruolo in numerose malattie tra cui l'aterosclerosi, artrite, cancro e 9. Pertanto, lo studio dei macrofagi è stata un'area chiave di ricerca per un certo tempo in un'ampia varietà di campi malattia.
Nonostante la loro importanza nella risposta immunitaria innata, i macrofagi può essere difficile cellule con cui lavorare. In particolare, è difficile ottenere trasfezione efficiente utilizzando reagenti lipidici nei macrofagi senza tossicità associata 10,11. Inoltre, anche quando siRNA è efficiente consegnato macrofagi, la robustezza del gene RNAi indotta atterramento spesso può essere abbastanza moderato e può variare da gene a gene.
Per superare queste sfide tecniche, abbiamo ottimizzato la trasfezione e tecniche di atterramento 12-16 in due linee cellulari di macrofagi del mouse, RAW264.7 17 e J774A.1 18. Questo approccio utilizza la Amaxa Nucleofector 96 pozzetti Sistema navetta per la trasfezione; questo sistemautilizza una combinazione di reagenti specializzati e elettroporazione per trasfettare cellule in formato a 96 pozzetti 19. A seguito di trasfezione, si descrivono i metodi per massimizzare il recupero delle cellule e la vitalità e per massimizzare la successiva gene knockdown siRNA-indotta. Per illustrare l'utilità di questo approccio, si descrive un protocollo per la consegna di siRNA a queste linee cellulari di macrofagi, stimolare queste cellule con lipopolisaccaride (LPS), e monitorare la risposta immunitaria innata a livello della produzione di numerose citochine pro-infiammatorie. Forniamo dati di esempio in cui TARGET famiglia dei recettori Toll-like (TLR), i cui membri percepire LPS e altri modelli molecolari patogeni associati (PAMP), per regolare l'immunità innata.
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Protocol
1. Manutenzione di macrofagi linee cellulari
- Grow RAW264.7 e linee cellulari J774A.1 in DMEM supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS), a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2. Per aiutare a mantenere la sterilità, aggiungere 1% di penicillina / streptomicina (penna / strep) ai media (anche se questo non è strettamente necessario).
- Passaggio fondamentale: Assicurarsi che i macrofagi sono in crescita in uno stato di salute per la trasfezione efficiente e siRNA-indotta knockdown gene. Utilizzare le cellule tra i passaggi 3 e 10 dopo lo scongelamento fresco, come queste righe macrofagi presentano la migliore efficienza di trasfezione e mantenere solida la sopravvivenza dopo la trasfezione in questa fase; non utilizzare un numero di brano superiore (> 20), come l'efficienza di trasfezione e Silenziamento genico entrambi diminuiscono notevolmente.
- Per ottimizzare la trasfezione di siRNA, cellule piastra a 20% di confluenza e crescere uno o due giorni fino a quando le cellule raggiungono non confluenza superiore all'80%. Cellule Overgrown non trasfettare efficposi- zione ergonomica.
2. Programmazione del 96 pozzetti sistema Shuttle per la trasfezione
- Avviare il software di navetta a 96 pozzetti sul computer collegato alla navetta. Seleziona nuovo file di parametri nel menu File in alto a sinistra.
- Selezionare i pozzetti che verranno transfettate sul visualizzata 96 pozzetti schematica. Un riquadro verde indica che i pozzi sono selezionati.
- Selezionare il programma che corrisponde alla linea cellulare di macrofagi in uso (DS-136 per RAW264.7 o DS-130 per J774A.1) e selezionare Applica, che si trova al di sotto della piastra a 96 pozzetti nel diagramma. Si noti che dopo la selezione di un programma, i pozzetti sulla piastra schematica saranno di colore blu scuro. Cerchi vuoti indicano pozzi che non è stato assegnato un programma e non saranno scioccati.
3. Preparazione dei Reagenti per la trasfezione
- Preparare la soluzione Nucleofector ™ di lavoro mescolando linea cellulare SF 96 e soluzione Nucleofector ™con l'intero contenuto della provetta supplemento allegata. Lasciare i reagenti misti equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso. Conservare la soluzione in eccesso completa Nucleofector ™ a 4 ° C per un massimo di 3 mesi per un utilizzo futuro.
- Preriscaldare il salino DMEM, RPMI-1640, 0,25% tripsina / EDTA, e tampone fosfato (PBS) a 37 ° C prima di preparare i macrofagi per la trasfezione.
- Preparare il siRNA per trasfezione di scongelamento sul ghiaccio. Per ridurre al minimo il numero di disgelo congelamento del siRNA, congelare nuovi siRNA in aliquote la prima volta che vengono utilizzati.
- In esperimenti iniziali, utilizzare siRNA ad una dose relativamente alta di 2 micron (diluito 1:10 da 20 micron scorte). Successivamente titolare siRNA che inducono robusta gene knockdown fino a dosi più basse, anche se sono necessarie dosi più elevate di solito per un efficiente atterramento gene nei macrofagi rispetto ad altri tipi di cellule.
NOTA: siRNA sono disponibili da diverse fonti; abbastanza robusto knockdown gene può essere ottenutoutilizzando SmartPools siGenome, che sono quattro piscine di siRNA mirati ogni gene. Come controllo negativo, usare una delle varie piscine non-targeting siRNA o siRNA. - Per monitorare l'efficienza di trasfezione, transfettare sia il plasmide pmaxGFP di controllo (fornito nel kit Amaxa) o siRNA fluorescenza marcata in parallelo ai siRNA sperimentali. Aspettatevi 30-50% trasfezione del plasmide GFP (analizzati mediante microscopia o citometria a flusso il giorno dopo trasfezione) e> 99% trasfezione di fluorescenza marcata siRNA (analizzati mediante citometria di flusso immediatamente dopo la trasfezione e recupero).
4. Preparazione dei macrofagi per la trasfezione
- Staccare macrofagi aderenti dalle piastre di coltura cellulare mediante tripsinizzazione. Aspirare i media e lavare le cellule due volte con 10 ml di PBS. Dopo aver rimosso la PBS, incubare le cellule con pre-riscaldato 0,25% tripsina / EDTA (1 ml / 10 cm Piatto) per 1-2 minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Agitare gentilmente la piastra e spostare la soluzione durante l'incubazione per massimizzare tripsinizzazione.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 9 ml supporto DMEM + FBS, mescolare delicatamente su e giù, e raccogliere le cellule pipettando in una provetta sterile.
- Contare il numero di macrofagi isolati utilizzando un emocitometro. Aspettatevi circa 10 milioni di macrofagi ogni 10 cm Piatto. Calcolare il numero totale di macrofagi necessari; ciascun pozzetto sulla navetta 96 pozzetti richiede 200.000 cellule. Ricordarsi di aggiungere un valore di celle a pochi pozzi in più 'per consentire perdite di pipettaggio.
- Pipettare il numero calcolato di cellule in una provetta da centrifuga. Centrifugare le cellule per 10 min a 150 xg a temperatura ambiente. Non centrifugare troppo in fretta come questo diminuirà la salute dei macrofagi e l'efficienza di trasfezione.
5. Nucleofection dei macrofagi con siRNA
- Utilizzando uno sterile a 96 pozzetti piastra rotonda inferiore (che facilita la miscelazione, riducendo al minimo la perdita di reagente), aggiungere 2 ml di ogni siRNA a ciascun pozzetto per essere trasfette.
Nota: A seconda del numero di siRNA, questo può essere effettuato durante la fase di centrifugazione macrofagi. - Aspirare il supporto dalle cellule centrifugati. Risospendere delicatamente le cellule in soluzione Nucleofector ™ SF (contenenti la soluzione supplemento), con 20 pl per 200.000 cellule pellet. Una volta risospeso, utilizzare immediatamente le cellule per la trasfezione ottimale.
- Trasferire cellule risospese in un trogolo sterili; usando una pipetta multicanale, trasferimento 20 microlitri della miscela cellulare risospeso in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente la siRNA. Mescolare delicatamente pipettando su e giù.
- Trasferire 20 ml di miscela di cellule / siRNA in ben 96 piastra Nucleocuvette ™ passaggio fondamentale:. Evitare la generazione di bolle durante la fase di trasferimento in quanto ciò può indurre errori durante Nucleofection.
- Dopo aver posizionato tutti i campioni sperimentali nella piastra trasfezione, coprire la piastra a 96 pozzetti con il coperchio in dotazione e very toccare delicatamente su una superficie dura per rimuovere eventuali bolle dai campioni.
- Posizionare piastra a 96 pozzetti con coperchio in ben 96 navetta Nucleofector e selezionare 'caricare e avviare' in basso a destra della finestra del programma. Prima di Nucleofection, seguire la richiesta del programma per salvare i risultati.
Nota: Durante il processo di Nucleofection, pozzi tranfected con successo saranno raffigurati sul 96 pozzetti schema sullo schermo da un cerchio verde con un segno più. Un cerchio rosso con segno meno indica un errore, molto probabilmente a causa di bolle o mis-stato aggiunto il corretto volume di reagenti.
6. Recupero e placcatura dei macrofagi
- Subito dopo Nucleofection, con una pipetta multicanale, aggiungere 80 ml di pre-riscaldato (37 ° C) RMP1-1640 media per ciascun pozzetto. Aggiungere il supporto al lato di ogni pozzetto, consentendo al supporto di mescolare lentamente con le cellule trasfettate, che sono molto delicati in questa fase. Non aggiungere i media troppo in fretta, in modo daridurre notevolmente la redditività.
- Posizionare le piastre a 96 pozzetti con campioni trasfettati e RPMI-1640 in un incubatore 37 ° C con il 5% di CO 2 per 2 min; questo è fondamentale per permettere alle cellule di recuperare prima di ulteriori manipolazioni.
- Rimuovere la piastra a 96 pozzetti dall'incubatore e trasferire accuratamente la miscela da ciascun pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale.
- Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di pre-riscaldato (37 ° C) DMEM + FBS medio in ciascun pozzetto.
- Incubare la piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti con i campioni in un incubatore 37 ° C con il 5% di CO 2 per 24-36 ore (ottimizzare i tempi esatti per i singoli siRNA, anche se questo intervallo di tempo in generale funziona bene).
7. La stimolazione dei macrofagi con LPS
- Dopo il 24-36 ore post-Nucleofection incubazione, preparare LPS (o altro PAMPs) in mezzi freschi. Preparare abbastanza terreno fresco per tutti i pozzi (200 ml media / pozzetto della piastra a 96 pozzetti, più un piccolo extra per il pipettaggio). Diluire LPS ad una concentrazione finale di 20 ng / ml in DMEM + FBS.
- Supporti con attenzione aspirare dalla piastra a 96 pozzetti e aggiungere il supporto di fresco contenente LPS alle cellule.
- Monitorare la risposta a LPS o altri PAMPs in vari momenti dopo la stimolazione. 6 ore è sufficiente a generare una robusta risposta citochina infiammatoria di citochine come IL-6 e TNFa.
8. Monitoraggio della risposta immunitaria indotta Innata, Gene Knockdown e vitalità nei macrofagi
- Per monitorare LPS-indotta la produzione di citochine, pipettare il surnatante dalle cellule in una piastra di archiviazione da 96 pozzetti. La produzione di citochine può essere misurato con ELISA.
- Una volta che il surnatante viene rimosso, monitorare la vitalità cellulare con diacetato di fluoresceina (quando spaccati dalle esterasi cellulari in cellule vive, questo composto diventa fluorescente). Identificare siRNA che hanno come target i geni che controllano la vitalità cellulare tramite til suo approccio. Nota: il processo di transfezione stesso dovrebbe avere scarso effetto sulla vitalità se eseguita correttamente.
- Aggiungere fluoresceina diacetato (5 mg / ml magazzino in acetone) a ciascun pozzetto (diluizione 1: 100 in PBS finale).
- Incubare a temperatura ambiente per 1-5 minuti e quindi monitorare la fluorescenza nelle cellule utilizzando un lettore di piastre (460 nm di eccitazione, emissione 515 nm).
- Opzionale: Per garantire che la fluorescenza nei pozzetti è uniforme, lisare le cellule utilizzando tamponi, come RIPA; ciò fornisce un segnale fluorescente uniforme nel pozzo, come alcuni lettori di piastre sono configurati per controllare solo una piccola parte del pozzo; se le cellule non sono placcati uniformemente, la fluoresceina diacetato potrebbe dare una lettura imprecisa.
- In alternativa al monitoraggio vitalità cellulare, monitorare gene siRNA indotta knockdown da qPCR utilizzando RNA derivato dalle cellule aderenti.
- Dopo il surnatante viene rimosso dalle cellule (punto 8.1), pubblicitàd Buffer RLT (che viene utilizzato per la lisi e la conservazione di RNA) direttamente alle cellule aderenti per lisare loro.
- Isolare RNA utilizzando un kit di preparazione RNA come il RNeasy mini-kit, e utilizzare qPCR con primer gene-specifici per monitorare gene knockdown rispetto al trattamento di controllo siRNA. Utilizzare primer per Βactin o GAPDH per la normalizzazione.
- Come ulteriore alternativa per monitorare altri aspetti della risposta immunitaria innata, monitorare la capacità fagocitica dei macrofagi aggiungendo marcato con FITC E. particelle coli direttamente sulla cellule aderenti con un kit. In seguito il protocollo del produttore, che richiede solo un paio d'ore, monitorare l'assorbimento fagocitaria utilizzando un lettore di piastre o microscopia.
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Representative Results
Per dimostrare l'efficienza di trasfezione usando questo approccio, abbiamo monitorato assorbimento di marcata con FITC siRNA usando un citometro a flusso (Figura 1).
Per illustrare l'utilità del nostro approccio per il monitoraggio della risposta immunitaria innata, abbiamo trasfettato siRNA mirate note innate geni regolatori del sistema immunitario nella linea cellulare di macrofagi RAW264.7, stimolato le cellule con LPS, e poi monitorato la produzione delle citochine pro-infiammatorie IL- 6 e TNF. Diversi TLR riconoscono diversi PAMPs, con LPS da batteri Gram negativi riconosciuti da TLR4 20, lipopeptidi quali PAM3CSK4 riconosciuti da TLR2 21, e dsRNA da virus, come il poli mimica (I: C) riconosciuto da TLR3 22,23. Come mostrato in Figura 2, l'inibizione del TLR4 (ma non altri TLR utilizzando siRNA) riduce notevolmente la produzione di LPS-indotta di IL-6 e TNFa. Inoltre, l'inibizione di IL-6 con siRNA diminuisce anche IL-6 produzione senza influenzare la produzione TNFa (confrontare pannello A a B in Figura 2).
Figura 1: marcata con FITC siRNA viene efficacemente trasfettato nel mouse macrofagi linea cellulare J774A.1 utilizzando i metodi descritti Subito dopo la trasfezione, le cellule sono state lavate diverse volte, fissati in paraformaldeide, e la fluorescenza è stata monitorata mediante citometria di flusso.. La figura confronta cellule incubate in presenza di FITC-siRNA erano o trasfettate (curva blu) oppure no (curva rossa).
Figura 2: L'efficacia e la specificità di siRNA in macrofagi del mousecellule RAW264.7 linea cellulare RAW264.7. sono state trasfettate con i siRNA indicati (o controllare non destinati a piscine siRNA # 1 o 2 o siRNA che hanno come target TLR4, TLR3, TLR2, o IL-6 come indicato). 24 ore più tardi, le cellule sono state stimolate con LPS 20 ng / ml per 6 ore e la produzione di citochine (IL-6 sia nel pannello A o TNF-alfa nel pannello B è stato successivamente monitorati mediante ELISA. Gli asterischi indicano valori significativamente diversi da trattamento di controllo (p <0,05 , t-test).
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Discussion
Numerosi studi sono stati pubblicati in cui i singoli geni sono stati presi di mira da siRNA in macrofagi murini. Mentre trasfezione lipidico-mediata è stato utilizzato per fornire siRNA di linee cellulari di macrofagi su base individuale, questi metodi soffrono di potenziali effetti sulla vitalità, limitata knockdown gene, e la variabilità da gene a gene. Per sviluppare analisi più robusti che potrebbero essere utilizzati ai geni della moda medio o alto-rendimento obiettivo, abbiamo ottimizzato le tecniche che utilizzano il Amaxa Nucleofector sistema di navetta a 96 pozzetti, che presenta una maggiore coerenza nel gene knockdown e limitati effetti sulla vitalità (questo più robusto sistema è più costoso di approcci lipidiche-mediata). Molte variabili sono stati testati per ottimizzare queste procedure. Siamo stati in grado di utilizzare questo sistema per fornire in modo efficiente siRNA a molti diversi macrofagi primari e immortalata linee cellulari di macrofagi (in alcuni casi Ciò ha richiesto utilizzando il Amaxa 96 pozzetti kit di ottimizzazione della linea cellulare). Ion prove preliminari con queste diverse linee cellulari (macrofagi del mouse RAW264.7, J774A.1, e MH-S) e le cellule primarie (tioglicolato-suscitato e macrofagi di midollo osseo-derivato), abbiamo scoperto che le cellule RAW264.7 e J774A.1 esposto il più robusto knockdown gene siRNA-indotta (seguita da MH-S e cellule primarie, rispettivamente, dati non mostrati). Poiché queste due linee cellulari di macrofagi immortalato sono comunemente usati per lo studio, abbiamo ottimizzato le nostre procedure RNAi ulteriormente con queste righe.
Per monitorare l'efficienza di trasfezione, si sia utilizzato il plasmide di controllo GFP nei kit Nucleofector o coniugati con fluoresceina siRNA. Il plasmide GFP presenta una forte fluorescenza giorno dopo la transfezione, con efficienza di trasfezione del 30-50% come dosati microscopio o mediante citometria di flusso (dati non mostrati). Con coniugati con fluoresceina siRNA, osserviamo> 99% efficienza di trasfezione come analizzati mediante citometria di flusso (dsRNA transfects meglio di DNA plasmidico). Mentre è importante attendere fluorescenzasviluppa quando si utilizza il plasmide GFP, il siRNA fluorescenza deve essere monitorato relativamente presto dopo trasfezione perché il segnale fluorescente indebolisce con il tempo.
La trasfezione nelle condizioni descritte non ha un impatto significativo sulla vitalità cellulare. Noi di solito monitorare la vitalità delle cellule dopo i nostri trattamenti siRNA con fluoresceina diacetato. Questo composto non è fluorescente; tuttavia, quando spaccati dalle esterasi cellulari in cellule vive, diventa fluorescente. Inoltre, il modulo fluorescenza viene poi mantenuta in cellule con una membrana plasmatica intatta 24. Questo test basato sulla fluorescenza è un test relativamente semplice, veloce, ed economico per monitorare la vitalità cellulare, anche se ci sono altri metodi più sofisticati che, per esempio monitorare i livelli di ATP cellulare.
Noi di solito saggio di nostre cellule per innate immune funzione 24-36 ore dopo la transfezione, che si trova sul lato presto per RNAi rispetto ad altre linee cellulari. Whuno ile deve aspettare proteine endogene di girare per facilitare gene knockdown, si deve bilanciare questo con la perdita di siRNA potenza, e troviamo più robusto atterramento in queste righe macrofagi, a volte un po 'presto rispetto al tipico 48-72 hr utilizzato in altri tipi di cellule. Anche se è preferibile monitorare i livelli di proteina mediante Western blot, di solito monitorare i livelli di mRNA di qPCR, con l'obiettivo di studiare geni multipli in una sola volta, per il quale più gli anticorpi e le macchie occidentali potrebbero non essere pratico. Usiamo LPS alla dose minima in grado di massimizzare la produzione di citochine infiammatorie.
Quando ci si rivolge nuovi geni con siRNA, si comincia con la dose relativamente alta siRNA descritto nel protocollo e poi titolare giù siRNA che inducono un fenotipo. Controlli successivi volti a evitare effetti off-target comprendono l'utilizzo di più duplex siRNA per determinare se più di un siRNA in grado di indurre lo stesso fenotipo, verificando gene knockdown da qPCR o western blot, e l'utilizzo di gestudi ne iperespressione per completare l'approccio RNAi. Questi approcci dovrebbero consentire una rapida identificazione di geni che regolano l'immunità innata nei macrofagi del mouse.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Questo articolo è stato sponsorizzato da Lonza, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electroporation | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFα Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
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