Introduction
このプロトコルでは、siRNAを用いてマウスマクロファージ細胞株における遺伝子を抑制し、自然免疫応答におけるこれらの治療の効果をモニターするために効率的な方法を記載する。これらの手順は、中または高スループット様式でRNAiスクリーニングを可能にする、96ウェル形式で行われる。
感染に応答して、人間が直接の先天性免疫応答、より遅いが、より具体的な適応免疫応答をマウントする。この急速な自然免疫応答は、マクロファージ1を含む貪食自然免疫細胞の動員および活性化を伴う。古典的に活性化されたマクロファージは、急性炎症反応に関与し、抗菌タンパク質および化合物、サイトカイン及びケモカイン、および抗原を提示2,3を生成している。あるいは、活性化マクロファージは公差、組織修復を維持し、免疫を調節する役割を果たし、4-8創傷治癒 。理由の機能の彼らの広い配列のマクロファージは、アテローム性動脈硬化症、関節炎、および癌9を含む多数の疾患において役割を果たすことができる。したがって、マクロファージの研究では、病気の幅広い分野でいくつかの時間のための研究の重要な分野となっている。
先天性免疫応答におけるその重要性にもかかわらず、マクロファージはで動作するように細胞に挑戦することができます。特に、関連する毒性10,11なしマクロファージにおける脂質試薬を用いて効率的なトランスフェクションを得ることは困難である。 siRNAは効果的にマクロファージに送達される場合にもまた、RNAiを誘導遺伝子ノックダウンの頑健性は、多くの場合、かなり中程度であることができ、遺伝子に遺伝子を変化させることができる。
これらの技術的課題を克服するために、我々は、2つのマウスマクロファージ細胞株RAW264.7 17とJ774A.1 18でトランスフェクションし、ノックダウン技術12-16を最適化した。このアプローチは、トランスフェクションのためにAmaxa社のNucleofector 96ウェルシャトルシステムを使用しています。このシステム96ウェルフォーマット19で細胞をトランスフェクトするための特殊な試薬やエレクトロポレーションを組み合わせて使用します。トランスフェクションの後、我々は、細胞の回収および生存率を最大化するために、後続のsiRNAによる遺伝子ノックダウンを最大化するための方法を記載している。このアプローチの有用性を説明するために、リポ多糖（LPS）でこれらの細胞を刺激し、いくつかの炎症誘発性サイトカインの産生のレベルにおける先天性免疫応答をモニターし、これらのマクロファージ細胞株へのsiRNA送達のためのプロトコルを記述している。私たちはメンバー先天性免疫を調節するために、LPS及び他の病原体関連分子パターン（PAMP）を感知し、Toll様受容体（TLR）ファミリーをターゲットとしたサンプルデータを提供する。
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Protocol
マクロファージ細胞株の1メンテナンス
- RAW264.7を成長させ、DMEM中J774A.1細胞株は、5％CO 2存在下、37ºCで10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した。 （これは厳密には必要ではないが）無菌性を維持するために、メディアへの1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）を追加します。
- 重要なステップ：マクロファージは効率的なトランスフェクションおよびsiRNAによる遺伝子ノックダウンのために健全な状態で成長していることを確認します。これらのマクロファージラインは最高のトランスフェクション効率を示し、この段階で強固なトランスフェクション後の生存を維持するように、新鮮解凍後通路3と10との間の細胞を使用する。両方が大幅に減少するノックダウントランスフェクション効率および遺伝子として、高い継代数（> 20）を使用しないでください。
- 細胞には80％以上のコンフルエンスに到達しなくなるまで最適化されたsiRNAトランスフェクションのために、プレートを20％コンフルエントで細胞を1日か2日成長する。生い茂った細胞はefficトランスフェクトしませんiently。
2.トランスフェクションのための96ウェルシャトルシステムのプログラミング
- シャトルに接続されたコンピュータ上の96ウェルシャトルソフトウェアを起動します。左上のファイルメニューから新しいパラメータファイルを選択します。
- 表示された96ウェルプレート回路図にトランスフェクションされる井戸を強調表示します。緑色のボックスが選択されたウェルが示されます。
- （J774A.1ためRAW264.7またはDS-130用のDS-136）が使用されてマクロファージ細胞株に対応したプログラムを選択し、[ 適用]を選択し、図解さ96ウェルプレートの下に位置しています。プログラムを選択した後、回路図、プレート上のウェルが濃い青色に着色されることに注意してください。白丸は、プログラムを割り当てられていないとショックを受けることはありません井戸を示している。
3.トランスフェクションのための試薬を調製する
- SF細胞株を、96ウェルのNucleofector™溶液を混合することにより、作業のNucleofector™溶液を調製囲まれた補助チューブの全内容を持つ。混合試薬は使用前に室温で平衡化させる。将来の使用のために、最大3ヶ月間4ºCでの過剰完全なヌクレオ™ソリューションに保管してください。
- 前加温トランスフェクションのためにマクロファージを準備する前に、37ºCでDMEM、RPMI-1640、0.25％トリプシン/ EDTA、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。
- 氷上で解凍し、トランスフェクションのためのsiRNAを準備します。 siRNAの凍結融雪の数を最小限にするために、一定分量でそれらが使用されて初めて、新たなsiRNAを凍結する。
- 最初の実験では、（20μMストックから1:10に希釈）2μmの比較的高い用量でのsiRNAを使用しています。一般的に、より高い用量が他の細胞型に比べてマクロファージにおける効率的な遺伝子ノックダウンのために必要とされているがその後、より低用量までノックダウン強固な遺伝子を誘導するsiRNAを滴定。
注：siRNAは、多くの供給源から入手可能である。かなり強固な遺伝子ノックダウンを得ることができる各遺伝子を標的と4 siRNAのプールですsiGenome SMARTPOOLsを使用。陰性対照として、様々な非標的とするsiRNAプールまたはsiRNAのいずれかを使用します。 - トランスフェクション効率を監視するには、実験的なsiRNAと並列にpmaxGFP制御（Amaxa社キットで提供される）プラスミドまたは蛍光標識されたsiRNAのいずれかをトランスフェクト。 GFPプラスミド（顕微鏡によってアッセイまたはトランスフェクションの翌日フローサイトメトリー）および蛍光標識されたsiRNA（すぐにトランスフェクションおよび復旧後、フローサイトメトリーによってアッセイ）の> 99％のトランスフェクションの30〜50％のトランスフェクションを期待しています。
4.トランスフェクションのためのマクロファージの準備
- トリプシン処理により細胞培養皿から付着したマクロファージを外します。培地を吸引除去し、10mlのPBSで細胞を2回洗浄します。細胞がデタッチし始めるまで、PBSを除去した後、1~2分間予め温めておいた0.25％トリプシン/ EDTA（1ミリリットル/ 10cmプレート）で細胞をインキュベートする。優しくプレートをタップして、ソリューを移動トリプシン処理を最大化するインキュベーション中る。
- インキュベーション後、滅菌チューブにピペッティングして細胞を、9ミリリットルのDMEM + FBS培地を追加し、上下穏やかに混合し、収集します。
- 血球計数器を用いて、単離されたマクロファージの数を数える。 10cmプレートあたりおよそ千万マクロファージを期待しています。必要なマクロファージの総数を計算する。 96ウェルシャトルの各は200,000細胞を必要とします。ピペッティングの損失を可能にするために、細胞のいくつかの余分な井戸」の価値を追加することを忘れないでください。
- 遠心管に細胞の計算された数をピペット。室温で150×gで10分間細胞を遠心します。これはマクロファージの健康とトランスフェクション効率を低下させるよう早すぎる遠心しないでください。
siRNAによるマクロファージの5ヌクレオ
- （試薬の損失を最小限に抑えながら、混合促進する）丸底プレートの無菌の96ウェルを使用して、転送ように各ウェルに各siRNAの2μlを添加する精製カートリッジ。
注：siRNAの数に応じて、これはマクロファージ遠心分離工程の間に達成することができる。 - 遠心分離した細胞から培地を吸引除去する。静かにペレット化した200,000個の細胞あたり20μlのを使用して、ヌクレオ™ソリューションSF（サプリメント溶液を含む）で細胞を懸濁します。再懸濁した後、最適なトランスフェクションのためにすぐに細胞を使用しています。
- 無菌トラフに再懸濁した細胞を移す。 siRNAを含む96ウェルプレートの各ウェルにマルチチャンネルピペット、転送再懸濁細胞混合物の20μlのを使用して。優しく上下にピペッティングして混ぜる。
- 転送96ウェルNucleocuvette™プレートへの細胞/ siRNAの混合物20μlを重要なステップ：これはヌクレオ中にエラーを誘発することができるように転写工程中に気泡を発生しないようにしてください。
- トランスフェクションプレートの実験試料のすべてを配置した後に、設けられた蓋と版で96ウェルプレートをカバーyが優しくサンプルから任意の気泡を除去するために硬い表面の上をタップします。
- 96ウェルヌクレオシャトルに蓋をし、96ウェルプレートを置き、「アップロードおよび開始」プログラム画面の右下に選択します。ヌクレオに先立ち、結果を保存するためにプログラムのプロンプトに従ってください。
注：クレオプロセスの間に、首尾よくトランスフェクトウェルは、プラス記号を持つ緑の円で画面上の96ウェル回路図に描かれます。マイナス記号を持つ赤い円は、気泡や誤ペッティング試薬の正しいボリュームをに、最も可能性の高いエラーを示します。
6.回復とマクロファージのめっき
- すぐにヌクレオの後、マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルにRMP1-1640メディアを予め温めた（37℃）の80μlを添加する。メディアはゆっくりと、この段階では非常にデリケートであるトランスフェクションされた細胞、と混合することができ、各ウェルの側にメディアを追加します。このうように、速すぎて、メディアを追加しないでください大幅に生存能力を減少させる。
- 2分間、5％CO 2、37ºCインキュベーター中にトランスフェクト試料およびRPMI-1640を有する96ウェルプレートを置く。これは、細胞が前にさらなる操作まで回復することを可能にすることが重要です。
- インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、慎重にマルチチャンネルピペットを用いて、96ウェル組織培養プレートに各ウェルからの混合物を移す。
- マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに予め温めた（37℃）DMEM + FBS培地100μlを加える。
- （この時間範囲は一般に良好に機能するが、個々のsiRNAのための正確なタイミングを最適化する）24〜36時間5％CO 2で37ºCインキュベーター中でサンプルを96ウェル組織培養プレートをインキュベートする。
LPSによるマクロファージの刺激7.
- 24-36時間後クレオインキュベーション後、新鮮な培地中で、LPS（または他のPAMP）を用意。すべてのウェルのための十分な新鮮な培地（200μlのmを準備しますEDIA /ウェルの96ウェルプレートに加え、ピペッティングのために少し余分な）。 DMEM + FBS中に20ng / mlの最終濃度にLPSを希釈する。
- 96ウェルプレートから慎重に培地を吸引し、細胞にLPSを含む新鮮な培地を追加します。
- 刺激後の様々な時点でLPSまたは他のPAMPへの応答を監視します。 6時間後には、IL-6またはTNFαなどのサイトカインのための強固な炎症性サイトカイン応答を生成するのに十分である。
8.マクロファージにおいて誘導先天性免疫応答、遺伝子ノックダウン、および生存率のモニタリング
- LPS誘導性のサイトカイン産生を監視するために、96ウェル貯蔵プレートに細胞からの上清をピペット。サイトカイン産生をELISAによって測定することができる。
- 上清を除去した後、フルオレセインジアセテート（生細胞における細胞エステラーゼによって切断されると、この化合物は蛍光性になる）を使用して、細胞生存率をモニターする。 Tを使用して、細胞の生存率を制御する遺伝子を標的とするsiRNAを特定彼のアプローチ。注意：適切に実行した場合のトランスフェクションプロセス自体が生存率にほとんど影響を持っている必要があります。
- （：PBSで100最終希釈1）各ウェルにフルオレセインジアセテート（アセトン中5mg / mlストック）を追加します。
- 一から五分間、室温でインキュベートした後、プレートリーダー（460 nm励起、515 nm発光）を用いて、細胞内の蛍光をモニターする。
- オプション：RIPAなどのような緩衝液を用いて細胞を溶解、ウェル内の蛍光が均一であることを確実にする。いくつかのプレートリーダーでウェルの小部分のみを監視するように構成されているように、これは、十分に均一な蛍光シグナルを提供する。細胞が均一にメッキされていない場合、フルオレセインジアセテートは、不正確な読み取り値を与えることができる。
- 細胞生存率を監視する代わりに、接着性細胞に由来するRNAを用いて定量PCRによりノックダウンsiRNAによる遺伝子をモニタリング。
- 上清を細胞から除去した後、広告を（上記8.1ステップ ）それらを直接溶解する接着細胞への（RNAの溶解および保存のために使用されている）からd RLT緩衝。
- このようにRNeasyミニキットとしてRNA調製キットを用いてRNAを単離し、そしてsiRNA処理を制御するために、遺伝子ノックダウンと比較して監視するために、遺伝子特異的プライマーを用いて定量PCRを使用する。正規化のためにβアクチンまたはGAPDHに対するプライマーを使用してください。
- 先天性免疫応答の他の側面を監視する別の代替方法として、FITC標識した大腸菌を添加することにより、マクロファージの貪食能をモニターキットを使用して付着細胞上に直接大腸菌粒子。ほんの数時間かかり、製造業者のプロトコール、続いて、プレートリーダーまたは顕微鏡を用いて貪食取り込みを監視します。
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Representative Results
このアプローチを使用するトランスフェクションの効率を実証するために、我々は、フローサイトメーター（ 図1）を用いてFITC標識siRNAの取り込みを監視した。
先天性免疫応答をモニターするための我々のアプローチの有用性を説明するために、我々は、RAW264.7マクロファージ細胞株に知ら自然免疫調節遺伝子を標的とするsiRNAをトランスフェクトされたLPSで細胞を刺激し、その後、前炎症性サイトカインの産生をモニターし、IL- 6およびTNFα。 TLR3 22,23によって認識：異なるTLRは、TLR4 20によって認識グラム陰性細菌由来のLPSで、そのような模倣ポリウイルスからTLR2 21、およびdsRNAによって認識などPAM3CSK4などのリポペプチド（I：C）、異なるのPAMPを認識する。 図2に示すように、TLR4（しかし、siRNAを用いない他のTLR）の阻害が強くLPS誘導性のIL-6およびTNFαの産生を減少させる。さらに、siRNAを用いたIL-6の阻害はまた、IL-を減少させる（ 図2のBにパネルAを比較）TNFα産生に影響を与えずに6本番。
。図1：FITC標識siRNAを効率的に記載された方法を用いて、マウスマクロファージ細胞株J774A.1にトランスフェクトされた直後に、トランスフェクション後、細胞を数回洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、そして蛍光をフローサイトメトリーによりモニターした。図は、いずれか（青曲線）ないか（赤い曲線）をトランスフェクトしたFITC-siRNAの存在下でインキュベートした細胞を比較します。
図2：マウスマクロファージにおけるsiRNAの有効性と特異性細胞株RAW264.7。RAW264.7細胞を、示されたsiRNAでトランスフェクトされた（いずれかの非ターゲティングsiRNAプール＃1又は2に示されるようTLR4、TLR3、TLR2、またはIL-6を標的とするsiRNAをコントロール）した。 24時間後、細胞を、パネルB、パネルAまたはTNFαでIL-6は、（6時間およびサイトカイン産生のために20ng / mlのLPSで刺激し、続いてELISAによってモニターした。アスタリスクは、コントロール処置した（p <0.05有意に異なる値を示す、t検定）。
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Discussion
多くの研究は、個々の遺伝子は、マウスのマクロファージにおけるsiRNAの標的とされている中で発表されている。脂質媒介トランスフェクションが個別にマクロファージ細胞株に対するsiRNAを送達するために使用されてきたが、これらの方法は、生存能力、限られた遺伝子ノックダウン、および遺伝子からの遺伝子の可変性に対する潜在的な影響に苦しんでいる。中·高スループット様式で遺伝子を標的化するために使用することができ、より堅牢なアッセイを開発するために、我々は、遺伝子ノックダウン、より一貫性と生存性に対する制限された効果（これより堅牢性を示すAmaxa社ヌクレオ96ウェルシャトルシステムを使用して、技術を最適化システム）は、脂質媒介アプローチよりも高価である。多くの変数は、これらの手順を最適化するために試験した。我々は、効率的に多くの異なる初代マクロファージにsiRNAを送達するためにこのシステムを使用することができたマクロファージ細胞株を不死化（これはAmaxa社96ウェル細胞株の最適化キットを使用して必要と場合によっては）。私nは、これらの異なるマウスマクロファージ細胞株（RAW264.7、J774A.1、およびMH-S）及び一次細胞（チオグリコレート刺激および骨髄由来マクロファージ）を用いた予備試験が、我々はそのRAW264.7とJ774A.1細胞を発見最も堅牢なsiRNAによる遺伝子ノックダウン示した（MH-Sおよび初代細胞に続いて、それぞれ、データは示さない）。これら二つの不死化マクロファージ細胞株は、一般的に研究のために使用されているように、我々はさらに、これらの株を用いた我々のRNAiの手順を最適化した。
トランスフェクション効率をモニターするために、我々は、いずれかのNucleofectorキットまたはFITC標識siRNAのコントロールGFPプラスミドを使用しています。微視的またはフローサイトメトリーによってアッセイしたGFPプラスミドは30〜50％のトランスフェクション効率を、トランスフェクションの翌日、強い蛍光を示す（データは示さず）。 siRNAをFITC標識でフローサイトメトリーによってアッセイし、我々は> 99％のトランスフェクション効率を観察（dsRNAは、プラスミドDNAよりも良好なトランスフェクト）。それが可能な蛍光を待つために重要であるが蛍光シグナルは時間とともに弱くなるため、GFPプラスミドを使用するときに発症する、蛍光siRNAはトランスフェクション後比較的すぐに監視すべきである。
記載された条件下でのトランスフェクションは、細胞生存率に大きな影響を持っていない。私たちは通常、フルオレセインジアセテートを使用して、当社のsiRNA処置後の細胞生存率を監視します。この化合物は蛍光性ではない。生細胞における細胞エステラーゼによって切断するときしかし、それは蛍光性となる。また、蛍光フォームは、無傷の原形質膜24を有する細胞内に保持される。例えば、細胞のATPレベルを監視する他のより洗練されたアッセイがあるが、この蛍光ベースのアッセイは、細胞生存率を監視するための、比較的単純で迅速、かつ安価なアッセイである。
私たちは通常、他の細胞株に比べてRNAiのための早期の側にあるトランスフェクションの後、先天性免疫機能24-36時間、私たちの細胞をアッセイ。 WHIleの一つは、遺伝子ノックダウンを容易にするために裏返しする内因性タンパク質を待たなければならない1がsiRNA効力の損失で、このバランスをとる必要があり、我々は他で使用される典型的な48〜72時間よりも少し早いタイミングでこれらのマクロファージ株でより堅牢なノックダウンを見つける細胞型。これはウェスタンブロットによりタンパク質レベルをモニターすることが好ましいが、我々は、通常、複数の抗体およびウェスタンブロットが実用的でない可能性があるために、一度に複数の遺伝子を研究することを目的として、定量PCRによりmRNAレベルを監視する。我々は、炎症性サイトカイン産生を最大化、最小の用量でLPSを使用しています。
siRNAを用いた新しい遺伝子をターゲットとする場合、我々は、議定書に記載されて比較的高いのsiRNA用量で開始し、表現型を誘導するsiRNAを下に滴定する。オフターゲット効果を回避するように設計され以降の制御は、geと定量PCRまたはウェスタンブロットにより遺伝子ノックダウンを確認し、使用して、複数のsiRNAが、同じ表現型を誘導できるかどうかを判断するために、複数のsiRNA二重鎖の使用を含むNEの過剰発現の研究は、RNAiアプローチを補完する。これらのアプローチは、マウスのマクロファージにおける自然免疫を制御する遺伝子の迅速な同定を可能にすべきである。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。この記事は、ロンザ社が主催した
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electroporation | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFα Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
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