Introduction
I denne protokollen beskriver vi effektive metoder for å hemme gener i mus makrofagcellelinjer hjelp sirnas og overvåke effekten av disse behandlingene på det medfødte immunresponsen. Disse fremgangsmåtene blir gjennomført i 96-brønners-formatet, slik at for RNAi skjermer i middels- eller høy-throughput måte.
Som reaksjon på infeksjon, mennesker montere en umiddelbar medfødte immunrespons og en langsommere, men mer spesifikk adaptiv immunrespons. Denne raske medfødte immunrespons innebærer rekruttering og aktivering av fagocytterende medfødte immunceller inkludert makrofager 1. Klassisk aktiverte makrofager er involvert i akutte inflammatoriske responser og produsere antimikrobielle proteiner og forbindelser, cytokiner og chemokiner, og presentere antigener 2,3. Alternativt kan aktiverte makrofager spiller en rolle i regulering av immunitet, opprettholde toleranse, vevsreparasjon og sårheling 4-8. På grunn av deres brede spekter av funksjonerKan makrofager spiller en rolle i en rekke sykdommer som aterosklerose, artritt, og kreft 9. Således har studiet av makrofager vært et sentralt område av forskning i noen tid i et bredt utvalg av sykdoms felt.
Til tross for sin betydning i det medfødte immunrespons, kan makrofager være utfordrende celler å jobbe med. Spesielt er det vanskelig å oppnå effektiv transfeksjon ved hjelp av lipid reagenser i makrofager uten assosiert toksisitet 10,11. Dessuten, selv når siRNA er effektivt leveres til makrofager, kan robustheten av RNAi-induserte genet knockdown ofte være relativt moderat, og kan variere fra genet til genet.
For å overvinne disse tekniske utfordringer, har vi optimalisert transfeksjon og knockdown-teknikker 12-16 i to muse makrofagcellelinjer, RAW264.7 17 og J774A.1 18. Denne tilnærmingen bruker Amaxa Nucleofector 96 brønner Shuttle System for transfeksjon; Dette systemetbruker en kombinasjon av spesialiserte reagenser og elektroporering for å transfektere celler i 96-brønners format 19. Etter transfeksjon beskriver vi metoder for å maksimere celle utvinning og levedyktighet og for å maksimere påfølgende siRNA-indusert genet knockdown. For å illustrere nytten av denne tilnærmingen, beskriver vi en protokoll for siRNA levering til disse makrofagcellelinjer, stimulere disse cellene med lipopolysakkarid (LPS), og overvåke den medfødte immunrespons ved nivået for produksjon av flere pro-inflammatoriske cytokiner. Vi gir eksempler data der vi målet Toll-like receptor (TLR) familie, hvis medlemmer forstand LPS og andre patogen assosiert molekylære mønstre (PAMPs), å regulere medfødt immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opprettholdelse av makrofagcellelinjer
- Dyrk RAW264.7 og J774A.1 cellelinjer i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i nærvær av 5% CO2. Å bidra til å opprettholde sterilitet, tilsett 1% penicillin / streptomycin (penn / strep) til media (selv om dette er strengt tatt ikke nødvendig).
- Kritisk trinn: Pass på at makrofagene vokser i en sunn tilstand for effektiv transfeksjon og siRNA-indusert genet knockdown. Bruk celler mellom passasjene 3 og 10 etter tining frisk, da disse makrofag linjer oppviser den beste transfeksjonseffektivitet og opprettholde robust post-transfeksjon overlevelse på dette trinn; ikke bruke en høyere passasje nummer (> 20), som transfeksjonseffektivitet og genet knockdown både avta sterkt.
- For optimalisert siRNA transfeksjon, plate-celler ved 20% konfluens og dyrke en eller to dager før cellene når ikke mer enn 80% konfluens. Grodde cellene vil ikke transfektere efficiently.
2. Programmering av 96 brønner Shuttle System for Transfeksjon
- Start 96-brønns shuttle programvare på datamaskinen som er koblet til romfergen. Velg ny parameter fil fra øverst til venstre menyen fil.
- Marker brønner som skal transfektert på den viste 96-brønns plate skjematisk. En grønn boks vil indikere hvilke brønner som er valgt.
- Velg programmet som tilsvarer makrofagcellelinje blir brukt (DS-136 for RAW264.7 eller DS-130 for J774A.1) og velg Bruk som ligger under diagramed 96-brønns plate. Merk at når du har valgt et program, vil brønnene på den skjematiske plate være farget mørk blå. Tomme sirkler indikerer brønner som ikke er tildelt et program og vil ikke bli sjokkert.
3. Forberedelse av Reagenser for Transfeksjon
- Forbered arbeids Nucleofector ™ løsning ved å blande SF cellelinje 96-brønns Nucleofector ™ løsningmed hele innholdet i den vedlagte supplement tube. Tillat de blandede reagenser for å ekvilibrere ved romtemperatur før bruk. Lagre overflødig komplett Nucleofector ™ løsning ved 4 ºC i opp til tre måneder for fremtidig bruk.
- Pre-varm i DMEM, RPMI-1640, 0,25% trypsin / EDTA og fosfat-bufret saltvann (PBS) ved 37 ° C før fremstilling av makrofager for transfeksjon.
- Klargjør siRNA for transfeksjon ved tining på is. For å minimalisere antallet av fryse tiner av siRNA, fryse nye sirnas i alikvoter første gang de brukes.
- I innledende eksperimenter, siRNA bruk ved en relativt høy dose på 2 uM (fortynnet 1:10 fra 20 uM stocks). Deretter titrere sirnas som induserer robust genet knockdown ned til lavere doser, selv om vanligvis høyere doser er nødvendig for en effektiv gen knockdown i makrofager sammenlignet med andre celletyper.
MERK: sirnas er tilgjengelig fra mange kilder; ganske robust genet knockdown kan fåshjelp siGenome SMARTPOOLs, som er bassenger av fire sirnas rettet hvert gen. Som en negativ kontroll, bruke noen av en rekke ikke-målretting siRNA bassenger eller sirnas. - For å overvåke transfeksjonseffektivitet, transfektere enten pmaxGFP kontroll plasmid (gitt i Amaxa kits) eller fluoresceinmerkede sirnas parallelt med eksperimentelle sirnas. Forvente 30-50% transfeksjon av plasmid GFP (undersøkt ved mikroskopi eller strømningscytometri dagen etter transfeksjon) og> 99% transfeksjon av fluorescens-merket siRNA (analysert ved strømningscytometri umiddelbart etter transfeksjon og gjenvinning).
4. Klargjøring av Makrofager for Transfeksjon
- Løsne heftmakrofager fra cellekultur retter ved trypsinering. Aspireres media, og vaske cellene to ganger med 10 ml PBS. Etter fjerning av PBS, ruge cellene med forvarmet 0,25% trypsin / EDTA (1 ml / 10 cm plate) i 1-2 min før cellene begynner å løsne. Forsiktig på platen, og flytt oppløsesjon under inkuberingen for å maksimere trypsinering.
- Etter inkuberingen, tilsett 9 ml DMEM + FBS medier, bland forsiktig opp og ned, og samle cellene ved pipettering inn i et sterilt rør.
- Tell antall isolerte makrofager ved hjelp av en hemocytometer. Forvent lag 10 millioner makrofager per 10 cm plate. Beregn det totale antall makrofager som trengs; hver brønn på 96-brønners shuttle krever 200.000 celler. Husk å legge til noen ekstra brønner igjen av celler for å tillate pipettering tap.
- Pipetter beregnede antall celler i et sentrifugerør. Sentrifuger cellene i 10 minutter ved 150 xg ved romtemperatur. Ikke sentrifuger for raskt da dette vil avta makrofag helse og transfeksjonseffektivitet.
5. nucleofection av makrofager med siRNA
- Ved hjelp av en steril 96-vel rund bunnplate (som muliggjør miksing samtidig minimere reagenstap), tilsett 2 mL av hver siRNA til hver brønn for å være transfected.
Merk: Avhengig av antall sirnas, dette kan oppnås i løpet av makrofag sentrifugeringstrinn. - Aspirer media fra de sentrifugerte celler. Forsiktig resuspender cellene i Nucleofector ™ SF-løsning (inneholdende supplement løsning), ved anvendelse av 20 ul per 200.000 pelleterte celler. Når resuspendert, bruker cellene umiddelbart for optimal transfeksjon.
- Overfør resuspenderte celler i en steril trau; ved anvendelse av en multikanal pipette, overføre 20 ul av den resuspenderte celleblanding i hver brønn av 96-brønners plate inneholdende det sirnas. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned.
- Overfør 20 pl av celle / siRNA blandingen i 96-brønns plate Nucleocuvette ™ kritisk trinn:. Unngå å generere bobler under overføringstrinnet, da dette kan forårsake feil under nucleofection.
- Etter å plassere alle de eksperimentelle prøver i transfeksjon plate, dekke 96-brønns plate med gitt lokket og very banke forsiktig på en hard overflate for å fjerne eventuelle bobler fra prøvene.
- Plasser 96-brønns plate med lokk i 96-brønns Nucleofector shuttle og velg "laste opp og starte 'nederst til høyre på programskjermen. Før nucleofection, følge programmet teksten for å lagre resultatene.
Merk: Under nucleofection prosessen, brønner hell transfekterte vil bli avbildet på 96-brønnen skjematisk på skjermen med en grønn sirkel med et plusstegn. En rød sirkel med minustegnene indikerer en feil, mest sannsynlig på grunn av bobler eller mis-pipettere riktig mengde reagenser.
6. Gjenoppretting og plating av Makrofager
- Umiddelbart etter nucleofection, ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 80 mL av forvarmet (37 ºC) RMP1-1640 media til hver brønn. Tilsett mediet til siden av hver brønn, slik at mediet langsomt blande seg med de transfekterte celler, som er svært delikat på dette stadiet. Ikke legg til media for fort, da dette vilsterkt redusere levedyktighet.
- Plasser de 96-brønners plater med transfekterte prøver og RPMI-1640 i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 2 minutter; Dette er kritisk for å tillate cellene å gjenopprette forut for videre manipulering.
- Fjern 96-brønns plate fra inkubatoren og nøye overføre blandingen fra hver brønn i en 96-brønns vevskulturplate ved anvendelse av en multikanal pipette.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette, tilsett 100 mL av forvarmet (37 ºC) DMEM + FBS medium til hver brønn.
- Inkuber 96-brønnen vevkulturplate med prøver i en 37 ºC inkubator med 5% CO 2 for 24-36 timer (optimalisere det eksakte tidspunktet for individuelle sirnas, men denne tidsperioden generelt fungerer godt).
7. Stimulering av makrofager med LPS
- Etter 24-36 timer etter nucleofection inkubasjon, forberede LPS (eller andre PAMPs) i frisk medier. Forbered nok frisk medium for alle brønnene (200 mL media / brønn av 96-brønns plate pluss litt ekstra for pipettering). Fortynn LPS til en sluttkonsentrasjon på 20 ng / ml i DMEM + FBS.
- Nøye aspirer media fra 96-brønns plate og legge den friske media inneholder LPS til cellene.
- Overvåke responsen på LPS eller andre PAMPs ved forskjellige tidspunkter etter stimulering. 6 timer er tilstrekkelig til å generere en robust inflammatorisk cytokin respons for cytokiner så som IL-6 eller TNFa.
8. Overvåking av Induced Medfødt immunrespons, Gene Knockdown, og levedyktighet i Makrofager
- For å overvåke LPS-indusert cytokinproduksjon, pipette supernatanten fra cellene inn i en 96-brønns plate lagring. Cytokinproduksjon kan deretter måles ved hjelp av ELISA.
- Når supernatanten fjernet, overvåke cellenes levedyktighet ved å bruke fluorescein-diacetat (når spaltes av cellulære esteraser i levende celler, blir denne forbindelsen fluorescerende). Identifiser sirnas som er rettet mot gener som styrer celle levedyktighet ved hjelp thans tilnærming. Merk: transfeksjonsmiddelet prosessen i seg selv bør ha liten effekt på levedyktigheten hvis det utføres riktig.
- Legg fluorescein-diacetat (5 mg / ml lager i aceton) til hver brønn (1: 100 endelig fortynning i PBS).
- Inkuber ved romtemperatur i 1-5 minutter og deretter overvåke fluorescens i cellene ved bruk av en plateleser (460 nm eksitasjon, 515 nm emisjon).
- Valgfritt: For å sikre at fluorescensen i brønnene er enhetlig, lysere cellene ved bruk av buffere slik som RIPA; Dette gir en jevn fluorescerende signal i brønnen, som noen platelesere er konfigurert til å overvåke bare en liten del av brønnen; Dersom cellene ikke er jevnt belagt, kan det fluorescein-diacetat gir en unøyaktig avlesning.
- Som et alternativ til å overvåke cellenes levedyktighet, overvåke siRNA-induserte genet knockdown etter qPCR ved hjelp av RNA avledet fra de adherente celler.
- Etter at supernatanten er fjernet fra cellene (trinn 8.1 ovenfor), add RLT buffer (som brukes for lysering og bevaring av RNA) direkte til de adherente celler til å lysere dem.
- Isolere RNA ved anvendelse av en RNA-preparatet kit som RNeasy Mini-kit, og bruke qPCR med genspesifikke primere for å overvåke knockdown-genet i forhold til kontroll siRNA behandling. Bruk primere til Βactin eller GAPDH for normalisering.
- Som et annet alternativ til å overvåke andre aspekter av den medfødte immunrespons, kontrollere fagocytiske evne av makrofager ved tilsetning av FITC-merket E. coli-partikler direkte på de adherente celler ved hjelp av et kit. Etter produsentens protokoll, som tar bare et par timer, overvåke phagocytic opptak med en plateleser eller mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere effektiviteten av transfeksjon ved bruk av denne tilnærmingen, overvåket vi opptaket av FITC-merket siRNA ved hjelp av et strømningscytometer (figur 1).
For å illustrere nytten av vår tilnærming for overvåking av medfødte immunrespons, vi transfektert sirnas rettet kjente medfødte immun regulatoriske gener inn i RAW264.7 makrofagcellelinje, stimuleres cellene med LPS, og deretter overvåket produksjonen av proinflammatoriske cytokiner IL- 6 og TNFa. Ulike TLRs gjenkjenne ulike PAMPs, med LPS fra Gram-negative bakterier anerkjent av TLR4 20, lipopeptides som PAM3CSK4 anerkjent av TLR2 21, og dsRNA fra virus som etterligner poly (I: C) anerkjent av TLR3 22,23. Som vist i figur 2, inhibering av TLR4 (men ikke ved hjelp av andre TLR'ene siRNA) avtar sterkt produksjonen av LPS-indusert IL-6 og TNFa. Videre, inhibering av IL-6 med siRNA minsker også IL-6 produksjon samtidig som det ikke påvirker TNFa-produksjon (sammenlign panel A til B i figur 2).
Figur 1: FITC-merket siRNA er effektivt transfektert inn i mus makrofag cellelinje J774A.1 ved hjelp av de beskrevne fremgangsmåter Umiddelbart etter transfeksjon, ble cellene vasket flere ganger, fiksert i paraformaldehyd, og fluorescensen ble målt ved strømningscytometri.. Figuren sammenligner-celler inkubert i nærvær av FITC-siRNA som enten ble transfektert (blå kurve) eller ikke (rød kurve).
Figur 2: Effekt og spesifisiteten av siRNA i musemakrofagcellelinje. RAW264.7 RAW264.7-celler ble transfektert med de indikerte sirnas (enten kontrollere ikke-målretting siRNA bassenger # 1 eller 2 eller sirnas som er rettet mot TLR4, TLR3, TLR2, eller IL-6 som indikert). 24 timer senere ble cellene stimulert med 20 ng / ml LPS i 6 timer og cytokinproduksjon (enten IL-6 i panel A eller TNFa i panel B ble deretter overvåket ved ELISA. Stjernene indikerer verdien signifikant forskjellig fra kontrollbehandling (p <0.05 , t-test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tallrike studier har blitt publisert i den enkelte gener har blitt målrettet av siRNA i murine makrofager. Mens lipid-mediert transfeksjon har vært brukt til å levere siRNA til makrofagcellelinjer på individuell basis, er disse fremgangsmåter lider av potensielle virkninger på levedyktighet, begrenset gen knockdown, og variasjon fra genet til genet. Å utvikle mer robuste analyser som kan brukes til å målrette gener i middels eller høy gjennomstrømming mote, vi optimalisert teknikker som bruker Amaxa Nucleofector 96 brønner shuttle-systemet, som viser mer konsistens i genet knockdown og begrensede effekter på levedyktighet (dette mer robust Systemet er dyrere enn lipid-medierte metoder). Mange variabler ble undersøkt for å optimalisere disse fremgangsmåtene. Vi var i stand til å bruke dette systemet for å effektivt levere siRNA til mange forskjellige primære makrofager og udødelig makrofagcellelinjer (i noen tilfeller er dette nødvendig bruker Amaxa 96-brønners cellelinje optimalisering kit). Jegn foreløpige tester med disse forskjellige muse makrofagcellelinjer (RAW264.7, J774A.1 og MH-S) og primærceller (thioglycollate-fremkalte og benmarg makrofager), fant vi at RAW264.7 og J774A.1 celler oppviste den mest robuste siRNA-induserte genet knockdown (fulgt av MH-S og primærceller, respektivt, data ikke vist). Som disse to udødelig makrofagcellelinjer blir ofte brukt for å studere, optimalisert vi våre RNAi prosedyrer videre bruke disse linjene.
For å overvåke transfeksjonseffektivitet, vi enten bruke kontrollen GFP plasmid i Nucleofector kits eller FITC-merket siRNA. GFP-plasmidet viser sterk fluorescens dagen etter transfeksjon med transfeksjonseffektivitet på 30-50% som analysert mikroskopisk eller ved strømningscytometri (data ikke vist). Med FITC-merket siRNA, observerer vi> 99% transfeksjonseffektivitet som analysert ved strømningscytometri (dsRNA transfects bedre enn plasmid DNA). Mens det er viktig å vente på å fluorescensutvikles ved bruk av GFP plasmid, bør det fluorescerende siRNA overvåkes relativt snart etter transfeksjon fordi det fluorescente signalet svekkes med tiden.
Transfeksjon under de beskrevne forhold ikke har en betydelig innvirkning på celle levedyktighet. Vi vanligvis overvåke celle levedyktighet følge våre siRNA behandlinger med fluorescein diacetat. Denne forbindelse er ikke fluorescerende; Imidlertid, når de spaltes ved cellulære esteraser i levende celler, blir det fluorescerende. Dessuten er den fluorescerende formen deretter beholdt i celler med intakt plasmamembranen 24. Denne fluorescens-basert assay er en relativt enkel, rask og billig assay for å overvåke cellenes levedyktighet, selv om det er andre mer sofistikerte analyser som for eksempel overvåker cellulære ATP-nivåer.
Vi vanligvis analysere cellene for medfødte immunfunksjon 24-36 timer etter transfeksjon, som er på siden tidlig for RNAi i forhold til andre cellelinjer. While man må vente for endogene proteiner for å slå over til rette genet knockdown, må man balansere dette med tap av siRNA potens, og vi finner mer robust knockdown i disse makro linjer på litt tidlige tider enn den typiske 48-72 hr brukes i andre celletyper. Mens det er å foretrekke å overvåke protein nivåer av western blot, vi vanligvis overvåke mRNA nivåer ved qPCR, med mål om å studere flere gener samtidig, for der flere antistoffer og vestlige blotter kan ikke være praktisk. Vi bruker LPS på minimal dose som maksimerer inflammatorisk cytokin produksjon.
Når målet er nye gener med siRNA, starter vi med den relativt høye siRNA dose beskrevet i protokoll og deretter titrere ned sirnas som induserer en fenotype. Etterfølgende kontroller utformet for å unngå off-target effekter inkluderer bruk av flere siRNA duplekser for å bestemme om mer enn ett siRNA kan indusere den samme fenotype, verifisering av qPCR-gen knockdown eller Western blot, og ved hjelp gene høyekspresjonsystemer studier for å utfylle RNAi tilnærming. Disse metodene bør tillate for rask identifisering av gener som regulerer medfødt immunitet i musemakrofager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser. Denne artikkelen ble sponset av Lonza, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electroporation | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFα Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. The macrophage. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. Methods in Cellular Immunology. 8, CRC Press. 8 (2001).
