Introduction
在这个协议中，我们描述了有效的方法，以抑制使用的siRNA的基因在小鼠巨噬细胞系和监视这些处理上的先天免疫反应的影响。这些程序在96孔格式进行，允许RNAi筛选在中等或高通量的方式。
在对感染的反应，人类装入立即先天免疫反应和较慢的但更具体的适应性免疫反应。这种快速先天免疫反应涉及吞噬先天免疫细胞，包括巨噬细胞1的募集和活化。经典的活化巨噬细胞参与了急性炎症反应，产生抗微生物蛋白和化合物，细胞因子和趋化因子，并呈递抗原2,3。另外活化的巨噬细胞在调节机体免疫力，保持宽容，组织修复的作用，并且伤口愈合4-8。由于他们的职能范围广泛的巨噬细胞可起到多种疾病，包括动脉粥样硬化，关节炎，癌症和9的作用。因此，巨噬细胞的研究一直是研究的重要领域中的各种疾病领域的一段时间。
尽管其在先天免疫应答的重要性，巨噬细胞可以是具有挑战性的细胞来工作。特别是，它难以得到利用巨噬细胞中的脂质试剂有效转染无关联的毒性10,11。此外，即使当的siRNA被有效地传递到巨噬细胞中RNAi诱导的基因经常拦截的鲁棒性可以相当温和，可以从基因而异基因。
为了克服这些技术挑战，我们有两种小鼠巨噬细胞系RAW264.7 17和18 J774A.1优化转染和技术击倒12-16。此方法使用Amaxa公司Nucleofector 96孔班车系统转染;该系统使用专门的试剂和电穿孔的组合转染细胞在96孔格式19。转染后，我们描述的方法来最大化细胞恢复和生存能力，并最大限度地随后的siRNA诱导的基因敲除。为了说明这种方法的实用性，我们描述了一种协议，用于siRNA递送到这些巨噬细胞系，刺激这些细胞用脂多糖（LPS），并监视在生产几种促炎性细胞因子的水平的先天免疫应答。我们提供一种其中我们针对Toll样受体（TLR）家族，其成员感测LPS和其他相关的病原体分子模式（PAMP），以调节先天免疫的样本数据。
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Protocol
1.维持巨噬细胞系
- 成长的RAW264.7并在DMEM J774A.1细胞系在5％CO 2的存在下在补充有10％胎牛血清（FBS）中，在37ºC。为了帮助保持无菌，加1％青霉素/链霉素（青霉素/链霉素）的培养基（尽管这不是严格必需的）。
- 关键的步骤：确保巨噬细胞生长在一个健康的状态，实现高效转染和siRNA诱导的基因敲除。利用通道3和10之间的单元格后新鲜解冻，这些巨噬细胞系具有最佳的转染效率，并保持强劲的转染后的生存在这个阶段;不使用更高的通道数（> 20），作为转染效率和基因敲低既降低很大。
- 对于优化的siRNA转染，细胞板在20％汇合和生长一至两天直到细胞达到不超过80％汇合。杂草丛生的细胞不会转efficiently。
2.编程96-穿梭系统的转染
- 启动连接到所述梭中的计算机上的96孔穿梭软件。从左上角的文件菜单中新的参数文件 。
- 突出显示将要在显示的96孔板概略转染孔中。绿色方框中会显示该井被选中。
- 选择对应于巨噬细胞系的使用（DS-136对RAW264.7或DS-130对J774A.1），然后选择适用 ，位于diagramed 96孔板下面的程序。请注意，选择一个节目后，在原理图上板的孔将被着色深蓝色。空圆圈表示尚未分配的程序并不会感到震惊的井。
3.准备试剂转染
- 通过混合SF细胞系准备工作Nucleofector™解决方案的96孔Nucleofector™解决方案使用所附的补充管的全部内容。允许该混合试剂的平衡在使用前室温。储存于4ºC过量完整Nucleofector™溶液长达3个月，以备将来使用。
- 预暖的DMEM，RPMI-1640，0.25％胰蛋白酶/ EDTA，和磷酸盐缓冲盐水（PBS），在37ºC之前制备的巨噬细胞用于转染。
- 通过融化冰准备的siRNA转染。为了最小化siRNA的冷冻解冻的数量，以等分试样冷冻新的siRNA首次使用它们。
- 在最初的实验中，使用的siRNA以相对高的剂量为2微米（从20μM的股稀释1:10）。随后滴定的siRNA诱导强有力的基因敲除下到较低的剂量，虽然需要通常较高剂量为有效的基因敲除中的巨噬细胞相比，其他类型的细胞。
注：siRNA是可从许多来源;相当可以获得健壮的基因敲除使用siGenome SMARTPOOLs，这是四个siRNA的靶向每个基因库。作为阴性对照，使用各种非靶向siRNA池或siRNA的。 - 以监测转染效率，转任pmaxGFP对照质粒（在Amaxa公司的试剂盒提供），或荧光标记的siRNA在平行于该实验的siRNA。期望的GFP质粒的30-50％的转染（用显微镜测定或在转染后流式细胞术当天）和荧光标记的siRNA的> 99％的转染（转染和恢复之后通过流式细胞仪立即测定）。
4.准备的巨噬细胞的转染
- 通过胰蛋白酶消化分离从细胞培养皿贴壁的巨噬细胞。吸出培养基，并用10ml PBS洗细胞两次。除去PBS后，孵育细胞预温的0.25％胰蛋白酶/ EDTA（1毫升/ 10cm平板）1-2分钟，直至细胞开始分离。轻轻晃动酶标板，移动SOLU在孵化期间重刑最大化胰蛋白酶。
- 培养后，通过移液添加9毫升DMEM + FBS的培养基，轻轻混匀，上下，并且收集细胞到无菌管中。
- 算使用血球分离的巨噬细胞的数量。预计每10cm平板大约一千万的巨噬细胞。计算出所需的巨噬细胞的总数;每个孔的96孔的穿梭需要200,000个细胞。记得添加了一些额外的井的价值单元，以便吸取损失。
- 吸取细胞的数目计算为一个离心管中。离心细胞10分钟，于150×g离心室温。不要离心太快，因为这会降低巨噬细胞的健康和转染效率。
5.用siRNA巨噬细胞的核转
- 使用无菌的96孔圆底板（这同时减少试剂损失便于混合），加入2微升每种siRNA，每孔为互感器ected。
注意：根据siRNA的数目，这可以在巨噬细胞的离心步骤来完成的。 - 从离心细胞吸出培养基。轻轻悬浮细胞Nucleofector™解决方案SF（含补充液），用每200,000细胞沉淀20微升。一旦重悬，立即用细胞最佳转染。
- 传输重悬的细胞进入无菌槽;使用多通道移液管，移20微升的重新悬浮的细胞混合物放入96孔板中含有siRNA的各孔中。移液器向上和向下轻轻混匀。
- 转移20微升细胞/ siRNA的混合物放入96孔Nucleocuvette™板的关键步骤：避免在转移步骤期间产生气泡，因为这会核转期间引起的错误。
- 将所有的转板实验样品后，覆盖96孔板用所提供的盖和版本Ÿ轻轻拍打在坚硬的表面，从样本中删除任何气泡。
- 将96孔板盖子放入96孔Nucleofector班车并选择程序屏幕的右下方“上传并开始”。前核转，按照程序提示保存结果。
注意：在核转过程中，井成功转染将由一个绿色圆圈加号所描绘的96孔原理图在屏幕上。一个红色的圆圈，减号指的错误，很可能是由于气泡或错误吸取试剂的正确数量。
6.恢复和巨噬细胞的电镀
- 立即核转后，用多道移液器，加入80微升预温（37℃）的RMP1-1640媒体到每个孔中。媒体添加到每孔中的侧面，允许媒体慢慢与转染的细胞，这是非常微妙的，在这个阶段混合。不要添加媒体太快，因为这将大大降低生存能力。
- 将96孔板用转染的样品和RPMI-1640成37ºC培养箱，用5％CO 2下2分钟;这是至关重要的，以使细胞进一步操作之前恢复。
- 从培养箱中取出96孔板中并小心地从每孔中转移到混合物用多道移液器96孔组织培养板中。
- 使用多通道移液管，加入100微升预温（37℃）的DMEM + FBS培养基中的每个孔中。
- 孵育96孔组织培养板用在37ºC培养箱，用5％CO 2下24-36小时的样品（优化siRNA个体的精确定时，尽管该时间段通常可以很好）。
7. LPS刺激巨噬细胞
- 继24-36小时后核转孵化，准备LPS（或其他的PAMP）的新鲜培养基。准备足够的新鲜培养基对所有井（200微升米EDIA /孔的96孔板加一点点额外的移液）。稀释的LPS至20毫微克/毫升的DMEM + FBS的最终浓度。
- 从96孔板小心吸出培养基，并添加含有内毒素的细胞的新鲜培养基。
- 监控刺激后在不同时间对LPS反应或其它的PAMP。 6小时是足够的，以产生细胞因子如IL-6或TNFα的一个健壮的炎性细胞因子应答。
8.监控诱导先天免疫反应，基因敲除和活力的巨噬细胞
- 并监控LPS诱导的细胞因子的产生，吸管从细胞上清液中加入96孔储藏板。细胞因子产生可以然后通过ELISA进行测量。
- 一旦除去上清液，用荧光素二乙酸酯监测细胞生存力（当被细胞酯酶活细胞裂解，这种化合物变成荧光）。确定采用t控制细胞活力的siRNA靶向基因他的做法。注：转染过程本身应该有生存力的影响不大，如果执行正确。
- 添加荧光素二乙酸酯（5毫克/毫升的库存在丙酮）至每个孔中（1：在PBS 100的最终稀释度）。
- 在室温下孵育一至五分钟，然后监测荧光在使用板读数器（460nm处激发，515nm处发射）的细胞。
- 可选：要确保在孔中的荧光均匀，裂解使用缓冲剂如RIPA细胞;这提供了在井均匀的荧光信号，因为有些板读取器被配置为监测井的一小部分;如果细胞不是均匀地镀敷，荧光素二乙酸酯可以得到不准确的读数。
- 作为替代，以监测细胞生存力，监视的siRNA诱导的基因使用从贴壁细胞的RNA通过qPCR拦截。
- 之后将上清液从细胞中除去（ 步骤8.1以上），广告ðRLT缓冲液（其用于裂解和保存的RNA）直接连接到贴壁细胞以裂解它们。
- 使用RNA制备试剂盒，如的RNeasy迷你试剂盒提取RNA，并使用定量PCR用基因特异性引物并监控基因敲除相对于对照siRNA处理。使用引物对Βactin或GAPDH用于标准化。
- 作为另一种选择，监察先天免疫应答的其它方面，通过加入FITC标记的大肠杆菌监视巨噬细胞的吞噬能力菌颗粒上直接使用试剂盒的贴壁细胞。按照制造商的协议，它只需几个小时，监视使用读板器或显微镜巨噬细胞吞噬。
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Representative Results
为了证明使用这种方法转染的效率，我们使用流式细胞仪（ 图1）监视的FITC标记的siRNA的摄取。
为了说明我们的用于监视先天免疫应答的方法的实用性，我们转染的靶向已知的先天性免疫调节基因插入的RAW264.7巨噬细胞系的siRNA，刺激了细胞用LPS，然后监测生产的促炎性细胞因子的IL- 6和TNFα。不同的TLR识别不同的PAMP，与从由TLR4 20识别革兰氏阴性细菌的脂多糖，脂肽，如PAM3CSK4认可TLR2 21，并且双链RNA的病毒，如模拟物的聚（I：C）通过TLR3 22,23识 别。如示于图2中 ，抑制TLR4（但使用的siRNA不其他的TLR）的强烈减少生产LPS诱导的IL-6和肿瘤坏死因子α。此外，抑制IL-6与用siRNA也减少IL-6生产而不会影响TNFα生成（ 图2中图 A比较B）中 。
图1：FITC-标记的siRNA有效地转染到使用所描述的方法的小鼠巨噬细胞株J774A.1马上转染后，将细胞洗涤几次，固定在多聚甲醛和荧光通过流式细胞术监测。该图比较了细胞培养中的FITC-siRNA的存在是被任意转染（蓝色曲线）或没有（红色曲线）。
图2：效力的siRNA和特异性的小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7。RAW264.7细胞用所指示的siRNA（或者控制非，对象的siRNA池＃1或2或靶向TLR4，TLR3，TLR2，或IL-6所示的siRNA）。 24小时后，细胞用20纳克/ ml的LPS 6小时和细胞因子的产生（或IL-6的面板A或肿瘤坏死因子α在图 B中，随后通过ELISA监测。星号表示值显著不同于对照（P <0.05 ，t-检验）。
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Discussion
众多研究已经发表，其中各个基因已在小鼠巨噬细胞被设为目标的siRNA。而脂质介导的转染已用于siRNA递送给个体基础上的巨噬细胞的细胞系，这些方法存在的生存能力，有限的基因敲除，以及变异性的潜在影响，从基因到基因。为了开发更强有力的测定法，可以用于靶向基因在中等或高通量的方式，我们的优化使用Amaxa公司nucleofector 96-穿梭系统，它显示出在基因敲除更多的一致性和生存能力有限效果（这更健壮的技术系统更昂贵的比脂质介导的方法）。许多变量，以优化这些程序进行测试。我们可以使用这个系统来有效siRNA递送到许多不同的主巨噬细胞和巨噬细胞的永生化细胞系（在某些情况下使用Amaxa公司96孔细胞系的优化试剂盒这个必要）。我n，其中这些不同的小鼠巨噬细胞株（RAW264.7，J774A.1，和MH-S）和原代细胞的初步试验（巯基乙酸，诱发和骨髓衍生的巨噬细胞），我们发现，RAW264.7和J774A.1细胞表现出最健壮的siRNA诱导的基因敲除（后跟MH-S和原代细胞，分别，数据未显示）。由于这两个永久化的巨噬细胞的细胞系通常用于研究中，我们优化了RNAi的程序还使用这些行。
为了监测转染效率，我们既可以使用在nucleofector套件或FITC标记的siRNA控制GFP质粒。绿色荧光蛋白的质粒具有强荧光的转染一天后，用30-50％的转染效率为测定显微镜或流式细胞术（数据未显示）。用FITC标记的siRNA，我们观察到> 99％的转染效率为测定通过流式细胞术（dsRNA的transfects比质粒DNA更好）。虽然等待荧光是重要使用GFP的质粒时发展中，荧光的siRNA应相对快转染后监测，因为荧光信号减弱与时间。
在所述条件下转染不会对细胞活力显著影响。我们通常监测细胞活力下面我们用荧光素二乙酸酯的siRNA治疗。此化合物不是荧光;然而，当由蜂窝酯酶活细胞裂解，它成为荧光。另外，该荧光的形式，然后保留在细胞中具有完整细胞膜24。这种基于荧光的测定法是一个相对简单，快速，廉价的测定法来监测细胞生存力，虽然也有其他更复杂的实验，对于例如监测细胞内ATP水平。
我们通常测定了细胞对固有免疫功能24-36小时以下的转染，这是对早期侧的RNAi相比其他细胞系。瓦异亮氨酸1必须等待内源性蛋白翻身以促进基因敲除时，必须平衡这种用siRNA效力的损失，我们发现更健壮击倒在这些巨噬细胞系在稍微早时间比典型的48-72小时，在其他使用细胞类型。虽然这是优选的监测蛋白质水平通过免疫印迹，我们通常监测mRNA水平通过qPCR，以学习多个基因在一次的目标，对于其中多个抗体和蛋白质印迹可能不实用。我们用LPS的最小剂量，最大限度地提高炎性细胞因子的产生。
当用siRNA靶向新基因，我们开始与协议中所描述的相对高剂量的siRNA，然后滴定下来的siRNA诱导的表型。设计，以避免脱靶效应随后控制包括使用多个siRNA双链体，以确定是否超过一个的siRNA可诱导相同的表型，证实基因通过qPCR或免疫印迹拦截，并用格NE表达的研究，以补充RNAi的方法。这些方法应该能够迅速识别基因调节小鼠巨噬细胞天然免疫。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。这篇文章是由赞助Lonza公司
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electroporation | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFα Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
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