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Immunology and Infection

En utilisant l'ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

doi: 10.3791/51306 Published: November 3, 2014

Introduction

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Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes efficaces pour inhiber des gènes dans des lignées cellulaires de macrophages de souris à l'aide de siRNA et de surveiller les effets de ces traitements sur la réponse immunitaire innée. Ces procédures sont effectuées en format 96 puits, permettant écrans ARNi de la mode à moyen ou haut débit.

En réponse à une infection, l'homme une réponse immunitaire innée immédiate et une réponse immunitaire adaptative plus lente mais plus précise. Cette réponse immunitaire innée rapide comprend le recrutement et l'activation des cellules immunitaires innées, y compris les macrophages phagocytaires 1. Macrophages activées de façon classique sont impliquées dans les réponses inflammatoires aiguës et produisent des protéines antimicrobiennes et composés, les cytokines et les chimiokines, et les antigènes présents 2,3. Macrophages activés alternativement jouent un rôle dans la régulation de l'immunité, le maintien de la tolérance, la réparation des tissus, cicatrisation des plaies et 4-8. En raison de leur large éventail de fonctions, Les macrophages peuvent jouer un rôle dans de nombreuses maladies, y compris l'athérosclérose, l'arthrite, le cancer et 9. Ainsi, l'étude des macrophages a été un élément clé de la recherche depuis un certain temps dans une grande variété de domaines des maladies.

En dépit de leur importance dans la réponse immunitaire innée, les macrophages peut être difficile de travailler avec des cellules. En particulier, il est difficile d'obtenir une transfection efficace en utilisant des réactifs lipidiques dans les macrophages sans toxicité associée 10,11. En outre, même lorsque le siRNA est rendu efficace à des macrophages, la robustesse de gène induite par ARNi démontable peut être assez souvent modérée et peut varier d'un gène à gène.

Pour remédier à ces difficultés techniques, nous avons optimisé la transfection et des techniques knockdown 12-16 dans deux lignées de cellules de type macrophage de souris, RAW264.7 17 et 18 J774A.1. Cette approche utilise la 96 puits système de navette Amaxa Nucleofector pour la transfection; ce systèmeutilise une combinaison de réactifs spécialisés et l'électroporation pour transfecter des cellules dans un format à 96 puits 19. Après la transfection, on décrit des procédés pour optimiser la récupération et la viabilité cellulaire et de maximiser la suite gène induite par effet de choc de siRNA. Pour illustrer l'utilité de cette approche, nous décrivons un protocole de délivrance d'ARNi de ces lignées de cellules macrophages, stimuler ces cellules avec du lipopolysaccharide (LPS) et contrôler la réponse immunitaire innée à l'échelle de la production de plusieurs cytokines pro-inflammatoires. Nous fournissons des données de l'échantillon dans lequel nous ciblons la famille des récepteurs Toll-like (TLR), dont les membres sentir LPS et autres motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP), pour réguler l'immunité innée.

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Protocol

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1. Entretien de lignées cellulaires de macrophages

  1. Cultiver RAW264.7 et des lignées de cellules J774A.1 dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C en présence de 5% de CO 2. Pour aider à maintenir la stérilité, ajouter 1% de pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine) aux médias (bien que ce ne soit pas strictement nécessaire).
  2. Étape critique: Veiller à ce que les macrophages sont de plus en plus dans un état ​​sain pour la transfection efficace et knockdown gène siRNA induite. Utiliser des cellules entre passages 3 et 10 après décongélation frais, comme ces lignes de macrophages présentent la meilleure efficacité de la transfection et maintenir robuste survie post-transfection à ce stade; ne pas utiliser un numéro de passage plus élevé (> 20), que l'efficacité de la transfection et gène Knockdown fois diminuent considérablement.
  3. Pour optimiser la transfection de siRNA, les cellules des plaques à 20% de confluence et les poussent un ou deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent pas plus de 80% de confluence. Cellules envahies ne transfecter efficiently.

2. Programmation du système de navette à 96 puits pour la transfection

  1. Lancez le logiciel de navette de 96 puits sur l'ordinateur connecté à la navette. Sélectionnez nouveau fichier de paramètres dans le menu en haut à gauche du fichier.
  2. Mettez en surbrillance les puits qui seront transfectées sur le affichée plaque de 96 puits schématique. Une boîte verte indique que les puits sont sélectionnés.
  3. Sélectionnez le programme qui correspond à la lignée cellulaire de macrophages utilisé (DS-136 pour RAW264.7 ou DS-130 pour J774A.1) et sélectionnez Appliquer, située en dessous de la plaque de 96 puits schématisé. Notez que, après la sélection d'un programme, les puits de la plaque schématique seront colorés en bleu foncé. Cercles vides indiquent puits qui ne sont pas attribués un programme et ne seront pas choqués.

3. Préparation des réactifs pour la transfection

  1. Préparer la solution de travail Nucleofector ™ en mélangeant SF lignée cellulaire de 96 puits solution Nucleofector ™avec la totalité du contenu du tube en supplément joint. Laisser les réactifs mixtes à équilibrer à température ambiante avant de l'utiliser. Stocker l'excès de solution complète Nucleofector ™ à 4 ° C pendant 3 mois pour une utilisation future.
  2. Préchauffer la solution saline DMEM, RPMI-1640, 0,25% de trypsine / EDTA, et tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C avant de préparer les macrophages pour la transfection.
  3. Préparer le siRNA pour la transfection par la fonte de la glace. Afin de minimiser le nombre des dégels gel du siRNA, geler de nouveaux siRNA en aliquots la première fois qu'ils sont utilisés.
  4. Dans les premières expériences, utiliser siRNA à une dose relativement élevée de 2 pm (01:10 dilué de 20 pm stocks). Titrer la suite siRNA gène qui induisent robuste démontable vers le bas à des doses plus faibles, bien que des doses plus élevées sont nécessaires en général pour effet de choc efficace de gènes dans des macrophages par rapport à d'autres types de cellules.
    NOTE: siRNA sont disponibles à partir de nombreuses sources; assez robuste knockdown de gène peut être obtenuutilisant SmartPools de siGenome, qui sont les piscines de quatre siRNA ciblant chaque gène. Comme témoin négatif, utiliser l'une des diverses piscines non-ciblage siRNA ou siRNA.
  5. Pour contrôler l'efficacité de transfection, transfecter soit le plasmide contrôle pmaxGFP (fourni dans le kit Amaxa) ou siRNA marqués par fluorescence en parallèle avec les siRNA expérimentales. Expect 30 à 50% de la transfection de plasmide GFP (analysé par cytométrie en flux ou microscopie jours après la transfection) et> 99% de transfection de siRNA marqué par fluorescence (analysé par cytométrie de flux, immédiatement après la transfection et la récupération).

4. Préparer les macrophages pour la transfection

  1. Détachez les macrophages adhérents des boîtes de culture cellulaire par traitement à la trypsine. Aspirer les médias et laver les cellules deux fois avec 10 ml de PBS. Après avoir enlevé le PBS, incuber les cellules avec préchauffé 0,25% de trypsine / EDTA (1 ml / 10 cm plaque) pendant 1-2 min jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher. Tapoter légèrement la plaque et déplacer la solution lors de l'incubation de maximiser la trypsine.
  2. Après l'incubation, ajouter 9 ml de milieu DMEM + FBS, mélanger doucement de haut en bas, et de recueillir les cellules par pipetage dans un tube stérile.
  3. Comptez le nombre de macrophages isolés à l'aide d'un hémocytomètre. Attendez environ 10 millions de macrophages par 10 cm plaque. Calculer le nombre total de macrophages nécessaires; chaque puits sur la navette 96 puits nécessite 200 000 cellules. Pensez à ajouter la valeur des cellules de quelques puits supplémentaires de cas de pertes de pipetage.
  4. Pipeter le nombre calculé de cellules dans un tube de centrifugation. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 150 x g à température ambiante. Ne pas centrifuger trop rapidement car cela diminue la santé des macrophages et l'efficacité de la transfection.

5. nucléofection de macrophages avec siRNA

  1. L'utilisation d'un plaque de 96 puits à fond rond stérile (qui facilite le mélange tout en minimisant la perte de réactif), ajouter 2 pi de chaque siRNA à chaque puits pour être transfète.
    Remarque: En fonction du nombre de siRNA, ceci peut être réalisé au cours de l'étape de centrifugation des macrophages.
  2. Aspirer les médias à partir des cellules centrifugés. Resuspendre doucement les cellules de solution Nucleofector ™ SF (contenant la solution de complément), en utilisant 20 pi par 200 000 cellules sédimentées. Une fois remis en suspension, utiliser les cellules immédiatement pour la transfection optimale.
  3. Transfert cellules remises en suspension dans une cuve stérile; à l'aide d'une pipette multicanaux, le transfert de 20 pl du mélange de cellules remis en suspension dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant le siRNA. Mélanger doucement par aspiration et refoulement.
  4. Transférer 20 pl du mélange de cellules / siRNA dans la plaque à 96 puits Nucleocuvette ™ étape critique:. Éviter de générer des bulles lors de l'étape de transfert, car cela peut provoquer des erreurs durant nucléofection.
  5. Après avoir placé tous les échantillons expérimentaux dans la plaque de transfection, couvrir la plaque de 96 puits avec le couvercle fourni, very touchez doucement sur une surface dure pour éliminer les bulles à partir des échantillons.
  6. Placer la plaque de 96 puits avec couvercle dans le 96 puits navette Nucleofector et sélectionnez «télécharger et démarrer 'en bas à droite de l'écran du programme. Avant nucléofection, suivez l'invite de programme pour enregistrer les résultats.
    Remarque: Durant le processus nucléofection, puits transfectées avec succès seront représentés sur le 96 bien schématique à l'écran par un cercle vert avec un signe plus. Un cercle rouge avec un signe moins indique une erreur, probablement en raison de bulles ou mal pipetage le volume correct de réactifs.

6. Récupération et placage de macrophages

  1. Immédiatement après nucléofection, à l'aide d'une pipette multicanaux, ajouter 80 ul de pré-chauffé (37 ° C) RMP1-1640 médias à chaque puits. Ajouter les médias sur le côté de chaque puits, permettant aux médias de mélanger lentement avec les cellules transfectées, qui sont très délicat à ce stade. Ne pas ajouter les médias trop vite, comme cette volontédiminuer considérablement la viabilité.
  2. Placer les plaques à 96 puits et transfectées avec des échantillons du milieu RPMI-1640 dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 2 min; ce qui est essentiel pour permettre aux cellules de se rétablir avant une autre manipulation.
  3. Retirer la plaque à 96 puits à partir de l'incubateur et de les transférer avec précaution le mélange à partir de chaque puits dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits en utilisant une pipette multicanaux.
  4. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 100 ul de pré-chauffé (37 ° C) du milieu DMEM + FBS à chaque puits.
  5. Incuber le 96 et le tissu plaque de culture avec des échantillons dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 24-36 heures (optimiser le moment exact de siRNA individuels, bien que cette plage de temps fonctionne généralement bien).

7. La stimulation des macrophages avec LPS

  1. Après le 24-36 h post-nucléofection incubation, préparer LPS (ou autre PAMP) dans un milieu frais. Préparer suffisamment milieu frais pour tous les puits (200 pi media / puits de la plaque de 96 puits et un peu plus de pipetage). Diluer le LPS à une concentration finale de 20 ng / ml dans du DMEM + FBS.
  2. Médias aspirer délicatement de la plaque de 96 puits et ajouter les milieux frais contenant les LPS aux cellules.
  3. Surveiller la réponse au LPS ou d'autres PAMP à divers moments après la stimulation. 6 heures est suffisante pour générer une réponse de cytokine inflammatoire robuste pour des cytokines telles que l'IL-6 ou TNF.

8. Suivi de la réponse immunitaire innée induite, Gene Knockdown, et la viabilité dans les macrophages

  1. Pour surveiller induite par le LPS production de cytokines, pipeter le surnageant des cellules dans une plaque de 96 puits de stockage. La production de cytokine peut être ensuite mesurée par ELISA.
  2. Une fois que le surnageant est éliminé, surveiller la viabilité des cellules en utilisant le diacétate de fluorescéine (lorsqu'il est clivé par des estérases cellulaires dans les cellules vivantes, ce composé est fluorescent). Identifier les siRNA ciblant les gènes qui contrôlent la viabilité des cellules en utilisant tson approche. Remarque: le processus de transfection lui-même devrait avoir peu d'effet sur la viabilité si elle est effectuée correctement.
    1. Ajouter diacétate de fluorescéine (5 mg / ml dans de l'acétone actions) à chaque puits (1: 100 dilution finale dans du PBS).
    2. Incuber à température ambiante pendant une à cinq minutes, puis surveiller la fluorescence dans les cellules en utilisant un lecteur de plaque (460 nm d'excitation, 515 nm émission).
    3. Facultatif: Pour veiller à ce que la fluorescence dans les puits est uniforme, la lyse des cellules en utilisant des tampons tels que RIPA; cela fournit un signal fluorescent uniforme dans le puits, comme certains lecteurs de plaques sont configurés pour surveiller seulement une petite partie du puits; si les cellules ne sont pas étalées uniformément, le diacétate de fluorescéine pourrait donner une lecture inexacte.
  3. Comme alternative à la surveillance de la viabilité cellulaire, contrôler gène induite par le siRNA-knockdown par qPCR en utilisant l'ARN provenant des cellules adhérentes.
    1. Après que le surnageant est séparé des cellules (étape 8.1 ci-dessus), annonced tampon RLT (qui est utilisé pour la lyse et la préservation de l'ARN) directement aux cellules adhérentes de les lyser.
    2. Isoler l'ARN en utilisant un kit de préparation d'ARN tels que le mini-kit RNeasy, et en utilisant qPCR avec des amorces spécifiques d'un gène par rapport au gène surveiller démontable pour contrôler le traitement des siRNA. Utilisez amorces à Βactin ou GAPDH pour la normalisation.
  4. Comme autre alternative à surveiller d'autres aspects de la réponse immunitaire innée, surveiller la capacité phagocytaire des macrophages par l'addition marqué au FITC E. particules coli directement sur ​​les cellules adhérentes en utilisant un kit. Suivant le protocole du fabricant, qui ne prend que quelques heures, contrôler l'absorption phagocytaire utilisant un lecteur de plaque ou microscopie.

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Representative Results

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Pour démontrer l'efficacité de la transfection en utilisant cette approche, nous avons suivi l'absorption de FITC marqué siRNA l'aide d'un cytomètre de flux (Figure 1).

Pour illustrer l'utilité de notre approche pour le suivi de la réponse immunitaire innée, nous avons transfecté siRNA ciblant des gènes de régulation de l'immunité innée connus dans la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7, stimulé les cellules avec LPS, puis surveillé la production de cytokines pro-inflammatoires IL 6 et TNFa. Les différents TLR reconnaissent différents PAMP, avec LPS de bactéries Gram négatives reconnus par le TLR4 20, lipopeptides, tels que reconnus par PAM3CSK4 TLR2 21, et l'ARN double brin à partir de virus tels que le poly synoptique (I: C) reconnue par TLR3 22,23. Comme le montre la figure 2, l'inhibition de TLR4 (mais pas d'autres TLR) à l'aide de siRNA diminue fortement la production d'IL-6 induite par le LPS et TNFa. En outre, l'inhibition de l'IL-6 à IL-siRNA diminue également6 production tout en affectant de ne pas la production de TNFa (comparer panneau A à B dans la figure 2).

Figure 1
Figure 1: siRNA marqué au FITC est efficacement transfecté dans la J774A.1 de la lignée cellulaire de macrophages de souris en utilisant les procédés décrits immédiatement après la transfection, les cellules ont été lavées plusieurs fois, fixées dans du paraformaldéhyde, et la fluorescence a été surveillée par cytométrie de flux.. La figure compare cellules incubées en présence de FITC-siRNA qui ont été soit transfectées (courbe bleue) ou non (courbe rouge).

Figure 2
Figure 2: L'efficacité et la spécificité des ARNsi dans le macrophage de sourisles cellules RAW264.7. RAW264.7 de lignées cellulaires ont été transfectées par les siRNA indiqués (soit non et destinées à contrôler les pools de siRNA n ° 1 ou 2 ou des siRNA ciblant TLR4, TLR3, TLR2, ou l'IL-6 comme indiqué). 24 heures plus tard, les cellules ont été stimulées avec 20 LPS ng / ml pour 6 heures et la production de cytokines (soit IL-6 du groupe A ou TNF dans le panneau B a été ensuite été analysés par ELISA. Astérisques indiquent valeur significativement différente de traitement de commande (p <0,05 , t-test).

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Discussion

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De nombreuses études ont été publiées dans lequel les gènes individuels ont été pris pour cible par siRNA dans les macrophages murins. Bien que la transfection médiée par des lipides a été utilisé pour fournir des siRNA pour les lignées de cellules macrophages sur une base individuelle, ces méthodes souffrent des effets potentiels sur la viabilité, knock-down de gènes limitée, et la variabilité du gène à gène. Pour développer des tests plus robustes qui pourraient être utilisés pour cibler les gènes de la mode à moyen ou haut débit, nous avons optimisé les techniques utilisant la Amaxa Nucleofector système de navette à 96 puits, qui présente plus de cohérence dans knockdown de gènes et des effets limités sur la viabilité (ce plus robuste système est plus coûteux que les approches de lipides médiée). Plusieurs variables ont été testés dans le but d'optimiser ces procédures. Nous avons pu utiliser ce système pour fournir efficacement des siRNA à de nombreux macrophages primaires et des lignées cellulaires immortalisées macrophages (dans certains cas, par cette situation en utilisant la Amaxa 96 puits kit d'optimisation de la lignée cellulaire). Jen essais préliminaires avec ces différentes lignes de macrophages de souris de cellules (RAW264.7, J774A.1, et MH-S) et des cellules primaires (thioglycolate et macrophages dérivées de moelle osseuse), nous avons trouvé que les cellules RAW264.7 et J774A.1 expose l'effet de choc le plus robuste induite par le siRNA-gène (suivie par MH-S et les cellules primaires, respectivement, les données non présentées). Comme ces deux lignées cellulaires immortalisées macrophages sont couramment utilisés pour l'étude, nous avons optimisé nos procédures d'ARNi en utilisant en outre de ces lignes.

Pour contrôler l'efficacité de transfection, on utilise soit le plasmide contrôle de GFP dans les kits de Nucleofector ou siRNA marqué au FITC. Le plasmide GFP présente une forte fluorescence du jour après la transfection, avec l'efficacité de transfection de 30 à 50% telle que déterminée au microscope ou par cytométrie de flux (données non présentées). Avec siRNA marqué au FITC, on observe> 99% d'efficacité de transfection comme analysé par cytométrie de flux (ARNdb mieux que transfecte l'ADN plasmidique). Bien qu'il soit important d'attendre fluorescence àdévelopper l'utilisation du plasmide GFP, le siRNA fluorescent doit être surveillée relativement peu de temps après la transfection parce que le signal fluorescent affaiblit avec le temps.

La transfection dans les conditions décrites ne pas avoir un impact significatif sur la viabilité des cellules. Nous surveillons généralement viabilité cellulaire après nos traitements de siRNA à l'aide de fluorescéine diacétate. Ce composé est pas fluorescent; Toutefois, lorsqu'il est clivé par des estérases cellulaires dans les cellules vivantes, il devient fluorescent. De plus, la forme fluorescente est ensuite conservé dans des cellules avec une membrane de plasma 24 intact. Ce test basé sur la fluorescence est un test relativement simple, rapide, pas cher et de surveiller la viabilité des cellules, mais il existe d'autres tests plus sophistiqués que par exemple surveiller les niveaux ATP cellulaire.

Nous dosage généralement nos cellules pour la fonction immunitaire inné 24-36 h après la transfection, qui est sur le côté au début de l'ARNi par rapport à d'autres lignées cellulaires. While doit attendre pour des protéines endogènes à remettre à faciliter knockdown de gènes, il faut équilibrer cela avec la perte de siRNA puissance, et nous trouver knockdown plus robuste dans ces lignes macrophages à peu les premiers temps que le typique 48-72 h utilisée dans d'autres des types de cellules. Bien qu'il soit préférable de surveiller les niveaux de protéines par Western Blot, nous surveillons généralement des niveaux d'ARNm par qPCR, dans le but d'étudier plusieurs gènes à la fois, dont plusieurs anticorps et des transferts Western peuvent ne pas être pratique. Nous utilisons des LPS à la dose minimale qui maximise la production de cytokines inflammatoires.

Lorsque vous ciblez de nouveaux gènes avec le siRNA, nous commençons avec la dose relativement élevée de siRNA décrit dans le Protocole, puis titrer en bas siRNA qui induisent un phénotype. Contrôles ultérieurs destinés à éviter les effets hors-cible comprennent l'utilisation de plusieurs duplex de cARNi de déterminer si plus d'un siRNA peut induire le même phénotype, la vérification de gène démontable par qPCR ou western blot, en utilisant ge etétudes ne surexpression de compléter l'approche RNAi. Ces approches devraient permettre l'identification rapide de gènes qui régulent l'immunité innée dans les macrophages de souris.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents. Cet article a été parrainé par Lonza, Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amaxa nucleofector 96-well shuttle system Lonza AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit Lonza V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line ATCC TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line ATCC TIB-67
siGenome smartpool siRNA Dharmacon varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool Dharmacon D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electroporation Invitrogen 13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS List Biological Laboratories 421
DMEM, high glucose Invitrogen 11995-065
RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) Fisher SV30010
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
96-well tissue culture plates Fisher 07-200-89  
96-well round bottom sterile plates (not coated) Fisher 07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY406
Mouse TNFα Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY410
Fluorescein diacetate Sigma-Aldrich F7378
RLT buffer Qiagen 79216
RNeasy mini kit Qiagen 74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit Invitrogen V-6694

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References

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De Arras, L., Guthrie, B. S., Alper, S. Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (93), e51306, doi:10.3791/51306 (2014).More

De Arras, L., Guthrie, B. S., Alper, S. Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (93), e51306, doi:10.3791/51306 (2014).

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