Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

doi: 10.3791/51306 Published: November 3, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות יעילים כדי לדכא גנים בשורות תאי מקרופאג עכבר באמצעות siRNAs ולעקוב אחר ההשפעות של טיפולים אלה בתגובה החיסונית המולדת. נהלים אלה מתבצעים בפורמט 96-היטב, המאפשרים למסכי RNAi באופנה בינונית או תפוקה גבוהה.

בתגובה לזיהום, בני אדם הר תגובה מיידית של מערכת חיסון מולדת ותגובה חיסונית אדפטיבית איטית אבל יותר ספציפית. תגובה חיסונית מולדת מהירה זה כוללת את הגיוס והפעלה של תאים חיסוניים מולדים phagocytic כוללים מקרופאגים 1. מקרופאגים מופעלים קלסי מעורבים בתגובות דלקתיות חריפות ולייצר חלבונים אנטי-מיקרוביאלי ותרכובות, ציטוקינים וכמוקינים, והווה אנטיגנים 2,3. מקרופאגים מופעלים לחלופין למלא תפקיד בויסות חסינות, שמירה על סובלנות, תיקון רקמות, וריפוי פצעי 4-8. בגלל המגוון הרחב של פונקציות שלהם, מקרופאגים יכולים לשחק תפקיד במספר רב של מחלות, כולל טרשת עורקים, דלקת פרקים וסרטן 9. כך, המחקר של מקרופאגים היה אזור עיקרי של מחקר כבר כמה זמן במגוון רחב של תחומים מחלה.

למרות חשיבותם בתגובה החיסונית המולדת, מקרופאגים יכולים להיות מאתגרים תאים לעבוד איתו. בפרט, קשה להשיג transfection יעיל באמצעות ריאגנטים שומנים במקרופאגים ללא הרעלה כרוכה 10,11. יתר על כן, גם כאשר siRNA מועבר ביעילות למקרופאגים, על חוסנו של הגן מושרה RNAi מציאה לעתים קרובות יכול להיות מתון למדי ויכול להשתנות מגן לגן.

כדי להתגבר על אתגרים טכניים אלה, יש לנו מותאמים transfection וטכניקות מציאה 12-16 בשתי שורות תאי מקרופאג העכבר, RAW264.7 17 וJ774A.1 18. גישה זו עושה שימוש במערכת הסעות 96, גם Amaxa Nucleofector לtransfection; מערכת זומשתמש בשילוב של חומרים כימיים וelectroporation מיוחדים transfect תאים בפורמט 96-גם 19. בעקבות transfection, אנו מתארים שיטות למקסם את התאוששות תא כדאיות ועל מנת למקסם את מציאה גן מושרה siRNA שלאחר מכן. כדי להמחיש את התועלת של גישה זו, אנו מתארים פרוטוקול למסירת siRNA לשורות תאי מקרופאג אלה, לעורר תאים אלה עם lipopolysaccharide (LPS), ולנטר את התגובה החיסונית המולדת ברמת ייצור של כמה ציטוקינים פרו-דלקתיים. אנו מספקים נתונים לדוגמה שבה אנו ממקדים משפחת קולט Toll-like (TLR), שחבריה לחוש LPS ודפוסים אחרים הפתוגן הקשורים מולקולריים (PAMPs), להסדיר חסינות מולדת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. תחזוקה של שורות תאי מקרופאג

  1. לגדול RAW264.7 ושורות תאי J774A.1 DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) בשעה 37 ºC בנוכחות של 5% CO 2. כדי לסייע לשמור על סטריליות, להוסיף 1% פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס) לתקשורת (אם כי זה לא ממש הכרחי).
  2. צעד קריטי: ודא שמקרופאגים גדלים במצב בריא עבור transfection יעיל ומציאת גן מושרה siRNA. השתמש בתאים בין קטעי 3 ו -10 לאחר הפשרה טריות, כקווי מקרופאג הללו מפגינים יעילות transfection הטובה ביותר ולשמור על הישרדות לאחר transfection חזק בשלב זה; לא להשתמש במספר גבוה יותר מעבר (> 20), כיעילות transfection וגן מציאה שני יקטינו מאוד.
  3. עבור transfection siRNA מותאם, תאי צלחת בconfluency 20% ולגדול יום או יומיים עד שהתאים מגיעים ללא מפגש יותר מ -80%. תאי מגודלים לא transfect efficiently.

2. תכנות מערכת הסעות 96-גם לTransfection

  1. הפעל את תוכנת הסעות 96, גם על המחשב המחובר להסעות. בחר קובץ פרמטר חדש מתפריט הקובץ השמאלי העליון.
  2. סמן את הבארות שיהיה transfected על סכמטי צלחת 96-היטב המוצגות. קופסא ירוקה תציין שבארות נבחרות.
  3. בחר את התכנית המתאימה לשורת תא מקרופאג בשימוש (DS-136 לRAW264.7 או DS-130 לJ774A.1) ובחר להחיל, ממוקמת מתחת לצלחת 96-היטב diagramed. שים לב שלאחר בחירת תכנית, הבארות על הצלחת סכמטי תהיה בצבע כחולה כהה. חוגים ריקים מצביעים על בארות שלא הוקצו בתכנית ולא יהיו בהלם.

3. הכנת ריאגנטים לTransfection

  1. הכן את פתרון Nucleofector ™ עובד על ידי ערבוב שורת תאי SF 96, גם פתרון Nucleofector ™עם כל התכולה של צינור תוספת המצורפת. לאפשר ריאגנטים המעורבים לאזן בטמפרטורת חדר לפני השימוש. אחסן פתרון עודף מלא Nucleofector ™ ב 4 ºC עד 3 חודשים לשימוש עתידי.
  2. טרום חם מלוח DMEM, RPMI-1640, טריפסין 0.25% / EDTA, ופוספט שנאגר (PBS) בשעה 37 ºC לפני הכנת מקרופאגים לtransfection.
  3. הכן את siRNA לtransfection על ידי הפשרה על קרח. על מנת לצמצם את מספר מפשיר הקפאה של siRNA, להקפיא siRNAs החדשה בaliquots הפעם הראשונה שהם נמצאים בשימוש.
  4. בניסויים ראשוניים, להשתמש siRNA במינון גבוה יחסית של 2 מיקרומטר (בדילול 01:10 מ -20 מיקרומטר מניות). בהמשך לכך לכייל siRNAs שגורמת לגנים חזקים מציאה עד למינונים נמוכים יותר, אם כי במינונים גבוהים יותר בדרך כלל יש צורך במציאת גן יעיל במקרופאגים בהשוואה לסוגי תאים אחרים.
    הערה: siRNAs זמינות ממקורות רבים; למדי ניתן להשיג מציאה גן חזקהבאמצעות SMARTPOOLs siGenome, שברכות של ארבע siRNAs מיקוד כל גן. כביקורת שלילית, להשתמש בכל בריכות שונות במיקוד שאינו siRNA או siRNAs.
  5. כדי לפקח על יעילות transfection, transfect או פלסמיד pmaxGFP השליטה (בתנאי בערכות Amaxa) או siRNAs fluorescently שכותרתו במקביל לsiRNAs הניסיונית. מצפה transfection 30-50% של פלסמיד GFP (assayed על ידי מיקרוסקופ או cytometry זרימת היום לאחר transfection) וtransfection> 99% מsiRNA fluorescently שכותרתו (assayed ידי cytometry זרימה מייד לאחר transfection והתאוששות).

4. הכנת המקרופאגים לTransfection

  1. ניתוק מקרופאגים חסיד ממנות התרבות של תאים על ידי trypsinization. לשאוב את התקשורת ולשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר PBS. לאחר הסרת PBS, דגירה התאים עם מראש חימם 0.25 טריפסין% / EDTA (1 מיליליטר / 10 סנטימטר צלחת) ל1-2 דקות עד שתאים מתחילים לנתק. לטפוח בעדינות את הצלחת ולהעביר את solution במהלך הדגירה על מנת למקסם את trypsinization.
  2. לאחר הדגירה, להוסיף 9 מיליליטר DMEM תקשורת + FBS, מערבב בעדינות מעלה ומטה, ולאסוף את התאים על ידי pipetting לתוך צינור סטרילי.
  3. לספור את המספר של מקרופאגים המבודדים באמצעות hemocytometer. מצפה בערך 10 מיליון מקרופאגים לכל 10 צלחת סנטימטר. לחשב את המספר הכולל של מקרופאגים צורך; כל טוב שבאטל 96 גם דורש 200,000 תאים. זכור להוסיף את השווי של כמה בארות נוספות של תאים, כדי לאפשר להפסדי pipetting.
  4. פיפטה המספר המחושב של תאים לתוך צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה התאים עבור 10 דקות ב XG 150 בטמפרטורת חדר. אל צנטריפוגות מהר מדי כמו זה יהיה להפחית בריאות מקרופאג ויעילות transfection.

5. nucleofection של המקרופאגים עם siRNA

  1. באמצעות היטב 96 צלחת סטרילית תחתית עגול (המאפשר ערבוב תוך מזעור הפסד מגיב), להוסיף 2 μl של כל siRNA לכל transf גם להיותected.
    הערה: בהתאם למספר siRNAs, זה יכול להיות מושלם במהלך שלב צנטריפוגה מקרופאג.
  2. לשאוב את התקשורת מתאי centrifuged. בעדינות resuspend תאי פתרון Nucleofector ™ SF (המכילים את פתרון התוסף), באמצעות 20 μl ל200,000 תאים pelleted. ברגע שresuspended, להשתמש בתאים באופן מיידי לtransfection האופטימלי.
  3. העבר את תאי resuspended לתוך שוקת סטרילי; בעזרת פיפטה רבה, העברת 20 μl של תערובת תאים המושעית זה לבאר כל צלחת 96-היטב המכילה את siRNAs. לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  4. העברה 20 μl של תערובת התא / siRNA לתוך 96-גם צלחת Nucleocuvette ™ צעד קריטי:. למנוע יצירת בועות במהלך שלב ההעברה כמו זה יכול לגרום לשגיאות במהלך nucleofection.
  5. לאחר הצבת כל דגימות ניסוי בצלחת transfection, מכסה את הצלחת 96-היטב עם המכסה וVer סיפקy לטפוח בעדינות על משטח קשה כדי להסיר בועות מהדגימות.
  6. מניחים צלחת 96-היטב עם מכסה ל96-גם הסעות Nucleofector ובחר 'להעלות ולהתחיל "בצד הימין למטה של ​​מסך התכנית. לפני nucleofection, בצע את הפקודה התכנית כדי לשמור את התוצאות.
    הערה: במהלך תהליך nucleofection, בארות tranfected הצלחה תהיה להיות מתוארות על 96, גם סכמטי על המסך על ידי עיגול ירוק בסימן חיובי. עיגול אדום עם סימני מינוס מציין שגיאה, ככל הנראה בשל בועות או אמצעי האחסון הנכון של חומרים כימיים pipetting-רע.

שחזור 6. וציפוי של המקרופאגים

  1. מייד לאחר nucleofection, בעזרת פיפטה רבה, להוסיף 80 μl של מחוממים מראש (37 ºC) RMP1-1640 תקשורת היטב כל אחד. הוסף את התקשורת לצד של כל טוב, המאפשר התקשורת לערבב באיטיות עם תאי transfected, שהם מאוד עדינים בשלב זה. אל תוסיף את התקשורת מהר מדי, כרצון זובמידה ניכר את הכדאיות.
  2. מקם את צלחות 96-גם עם דגימות transfected וRPMI-1640 לחממת 37 ºC עם 5% CO 2 למשך 2 דקות; זה הוא קריטי כדי לאפשר לתאים להתאושש לפני לקדם מניפולציה.
  3. הסר את צלחת 96-היטב מהחממה ולהעביר בזהירות את התערובת מכל טוב לצלחת תרבית רקמת 96, גם בעזרת פיפטה רבה.
  4. בעזרת פיפטה רבה, להוסיף מ( 37 ºC) DMEM בינוני מחומם מראש + FBS 100 μl היטב כל אחד.
  5. דגירה את צלחת 96-גם רקמת התרבות עם דגימות בחממה 37 ºC עם 5% CO 2 ל24-36 שעות (לייעל את העיתוי המדויק לsiRNAs בודדת, אם כי טווח זמן זה בדרך כלל עובד היטב).

7. גירוי של המקרופאגים עם LPS

  1. לאחר הדגירה לאחר nucleofection 24-36 שעות, להכין LPS (או PAMPs אחר) בתקשורת טרי. להכין מדיום טרי מספיק עבור כל הבארות (מ '200 μlעדיה / היטב צלחת 96-היטב בתוספת תוספת קטנה עבור pipetting). לדלל LPS לריכוז סופי של 20 ng / ml בDMEM + FBS.
  2. תקשורת בזהירות לשאוב מצלחת 96-היטב ומוסיפה את התקשורת הטרי המכילה LPS לתאים.
  3. צג התגובה לLPS או PAMPs האחר בזמנים שונים לאחר גירוי. 6 שעות מספיקות כדי ליצור תגובת ציטוקינים דלקתית חזקה לציטוקינים כגון IL-6 או TNFα.

8. ניטור המושרה מולדת התגובה החיסונית, ג'ין מציאה, ויכולת הקיום בהמקרופאגים

  1. כדי לפקח על מושרה LPS ייצור ציטוקינים, פיפטה supernatant מהתאים לתוך צלחת אחסון 96-היטב. ייצור ציטוקינים לאחר מכן ניתן למדוד על ידי ELISA.
  2. ברגע שsupernatant מוסר, לפקח על כדאיויות תא באמצעות diacetate והעמסת (כאשר ביקעו ידי esterases הסלולרי בתאים חיים, המתחם הזה הופך ניאון). לזהות siRNAs כי יעד הגנים ששולטות כדאיות תא באמצעות tהגישה שלו. הערה: תהליך transfection עצמו יהיה השפעה מועטת על יכולת קיום אם מבוצע כראוי.
    1. להוסיף diacetate והעמסת (5 מ"ג / מיליליטר מניות באצטון) זה טוב (1: 100 דילול סופי PBS).
    2. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 4:59 דקות ולאחר מכן לעקוב אחר הקרינה בתאים באמצעות קורא צלחת (460 עירור ננומטר, 515 פליטת ננומטר).
    3. אופציונאלי: כדי להבטיח שהקרינה בבארות היא אחידה, lyse התאים באמצעות מאגרים כגון ריפה; זה מספק אות ניאון אחידה בבאר, כחלק מקוראי הצלחת מוגדרים לפקח רק חלק קטן מהבאר; אם התאים אינם מצופים באופן אחיד, diacetate והעמסת יכול לתת קריאה מדויקת.
  3. כחלופה למעקב כדאיות תא, לעקוב אחר הגן מושרה siRNA מציאה על ידי qPCR באמצעות RNA הנגזר מהתאים חסיד.
    1. לאחר supernatant הוא להסיר את התאים (שלב 8.1 לעיל), מודעהחיץ ד RLT (המשמש לתמוגה ושימור של RNA) ישירות לתאים חסיד לlyse.
    2. בודד RNA באמצעות ערכת הכנת RNA כגון RNeasy מיני הערכה, ולהשתמש qPCR עם פריימרים גן ספציפי כדי לפקח על גן יחסי מציאה לשלוט טיפול siRNA. השתמש בפריימרים לΒactin או GAPDH לנורמליזציה.
  4. כחלופה נוספת כדי לפקח על היבטים אחרים של התגובה החיסונית המולדת, לפקח על יכולת phagocytic של מקרופאגים על ידי הוספת א-שכותרתו FITC חלקיקי coli ישירות על התאים חסיד באמצעות ערכה. בעקבות הפרוטוקול של היצרן, אשר לוקח רק כמה שעות, לפקח ספיגת phagocytic באמצעות קורא צלחת או במיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כדי להדגים את היעילות של transfection שימוש בגישה זו, אנו במעקב ספיגה של siRNA FITC שכותרתו באמצעות cytometer זרימה (איור 1).

כדי להמחיש את התועלת של הגישה שלנו לבקרה על התגובה החיסונית המולדת, אנו transfected siRNAs מיקוד גני רגולטורי חיסון מולדים ידועים לשורת תאי מקרופאג RAW264.7, מגורה התאים עם LPS, ולאחר מכן במעקב ייצור של ציטוקינים פרו-דלקתי אִי- 6 וTNFα. TLRs שונה להכיר PAMPs שונה, עם LPS מחיידקים שליליים גרם מוכרים על ידי TLR4 20, lipopeptides כגון PAM3CSK4 מוכר על ידי 21 TLR2, וdsRNA מפני וירוסים כגון פולי לחקות (אני: C) שהוכרו על ידי TLR3 22,23. כפי שניתן לראות באיור 2, עיכוב של TLR4 (אבל TLRs לא אחר באמצעות siRNA) בתוקף מפחית ייצור של IL-6-Induced LPS וTNFα. יתר על כן, עיכוב של IL-6 עם siRNA גם מפחית אִי-6 ייצור ואילו לא משפיע על ייצור TNFα (השווה פנל A ל- B באיור 2).

איור 1
איור 1: siRNA FITC שכותרתו הוא transfected ביעילות לתוך J774A.1 שורת תאי מקרופאג העכבר באמצעות השיטות שתוארו מייד לאחר transfection, התאים נשטפו מספר פעמים, קבועים paraformaldehyde, והקרינה הייתה במעקב על ידי cytometry זרימה.. הדמות משווה תאים הודגרו בנוכחות FITC-siRNA שהיו transfected או (עקומה כחולה) או לא (עקומה אדומה).

איור 2
איור 2: יעילות וספציפיות של siRNA במקרופאג העכברRAW264.7. תאי RAW264.7 שורת התאים היו transfected עם siRNAs מצויינים (או לשלוט בריכות siRNA שאינה ממוקד מס '1 או 2 או siRNAs כי יעד TLR4, TLR3, TLR2, או IL-6 כפי שצוין). 24 שעות מאוחר יותר, תאים היו מגורה עם 20 LPS ng / ml לייצור משאבי אנוש וציטוקינים 6 (או IL-6 בפנל או TNFα בלוח ב 'היה פיקוח לאחר מכן על ידי ELISA. כוכביות מציינות את הערך שונה באופן משמעותי מטיפול ביקורת (p <0.05 , מבחן t).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחקרים רבים שפורסמו שבגנים בודדים היו ממוקדים על ידי siRNA במקרופאגים העכבריים. בעוד transfection תיווך שומנים נעשה שימוש כדי לספק siRNA לשורות תאי מקרופאג על בסיס אישי, שיטות אלה סובלים מהשפעות אפשריות על כדאיות, מציאה גן מוגבלת, ושונות מגן לגן. לפתח מבחני חזקים יותר שיכול לשמש יעד גנים באופנה בינונית או תפוקה גבוהה, אנו מותאמים טכניקות שימוש במערכת הסעות 96, גם Amaxa Nucleofector, אשר מציגה יותר עקבי במציאת גן והשפעות מוגבלות על כדאיות (זה חזק יותר המערכת היא יקרה יותר מאשר גישות בתיווך שומנים בדם). משתנים רבים נבדקו על מנת לייעל את התהליכים האלה. היינו יכול להשתמש במערכת זו כדי לספק siRNA ביעילות למקרופאגים העיקריים שונים והנציח את שורות תאי מקרופאג (במקרים מסוימים דבר זה הצריך שימוש בAmaxa ערכת אופטימיזציה קו תא 96-היטב). אניn בדיקות ראשוניות עם שורות אלה שונים מקרופאג עכבר התא (RAW264.7, J774A.1, וMH-S) ותאים ראשוניים (thioglycollate הופקו ומח עצם נגזרות מקרופאגים), מצאנו כי תאי RAW264.7 וJ774A.1 הציג מציאה החזקה ביותר הנגרם על siRNA הגן (ואחריו MH-S ותאים ראשוניים, בהתאמה, מידע לא מוצג). כשתי שורות תאי מקרופאג אלה הונצחו משמשות בדרך כלל למחקר, אנו מותאמים נהלי RNAi שלנו באמצעות עוד שורות אלה.

כדי לפקח על יעילות transfection, או שאנחנו משתמשים בפלסמיד GFP שליטה בערכות Nucleofector או siRNA FITC שכותרתו. פלסמיד GFP מציג הקרינה חזקה ביום שלאחר transfection, עם יעילות transfection של 30-50% כassayed מיקרוסקופיים או על ידי cytometry זרימה (מידע לא מוצג). עם FITC שכותרתו siRNA, אנו צופים> 99% יעילות transfection כassayed ידי cytometry זרימה (dsRNA transfects טוב יותר מאשר פלסמיד דנ"א). אמנם חשוב לחכות לקרינה ללפתח בעת השימוש בפלסמיד GFP, siRNA הניאון צריך להיות במעקב זמן קצר יחסית לאחר transfection כי אות הניאון מחלישה עם זמן.

Transfection בתנאים שתוארו אין השפעה משמעותית על כדאיות תא. אנחנו בדרך כלל לעקוב אחר כדאיות תא לאחר הטיפולים שלנו siRNA באמצעות diacetate והעמסת. המתחם הזה הוא לא ניאון; עם זאת, כאשר ביקעו ידי esterases הסלולרי בתאים חיים, הוא הופך להיות ניאון. יתר על כן, צורת הניאון לאחר מכן נשמרה בתאים עם קרום פלזמה שלם 24. assay הקרינה מבוסס זה assay פשוט יחסית, מהיר, וזול לניטור כדאיות תא, אם כי יש מבחני מתוחכמים יותר אחרים שלמשל לעקוב אחר רמות ה- ATP סלולריות.

אנחנו בדרך כלל assay התאים שלנו עבור שעות של מערכת חיסון מולדת פונקצית 24-36 הבאות transfection, שנמצא בצד המוקדם לRNAi בהשוואה לשורות תאים אחרים. ש"שאיל יש להמתין לחלבונים אנדוגניים להתהפך כדי להקל על מציאה גן, אחד חייב לאזן את זה עם הפסד של עצמת siRNA, ואנו מוצאים מציאה חזקה יותר בקווי מקרופאג אלה בזמנים מוקדמים במקצת מהשעות 48-72 האופייניות בשימוש באחר תא סוגים. למרות שזה עדיף כדי לפקח על רמות חלבון על ידי כתם מערבי, אנחנו בדרך כלל לעקוב אחר רמות ה- mRNA על ידי qPCR, במטרה בודק את הגנים מרובים בבת אחת, שלנוגדנים מרובים וכתמים מערביים לא יכולים להיות מעשיים. אנו משתמשים LPS במינון המינימלי שמגדיל את ייצור של ציטוקינים דלקתיים.

כאשר מיקוד גנים חדשים עם siRNA, אנחנו מתחילים עם מינון siRNA הגבוה יחסית שתואר בפרוטוקול ולאחר מכן לכייל את siRNAs שגורמת לפנוטיפ. פקדים לאחר שנועדו למנוע השפעות חוץ-היעד כוללים שימוש בדופלקסים siRNA מרובים כדי לקבוע אם siRNA יותר מאחד יכול לגרום לאותו פנוטיפ, אימות גן מציאה על ידי qPCR או כתם מערבי, ובאמצעות GEמחקרי ביטוי יתר ne כדי להשלים את גישת RNAi. גישות אלה יכולות לאפשר לזיהוי מהיר של גנים המווסתים חסינות מולדת במקרופאגים עכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. מאמר זה מומן על ידי Lonza, Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amaxa nucleofector 96-well shuttle system Lonza AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit Lonza V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line ATCC TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line ATCC TIB-67
siGenome smartpool siRNA Dharmacon varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool Dharmacon D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electroporation Invitrogen 13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS List Biological Laboratories 421
DMEM, high glucose Invitrogen 11995-065
RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) Fisher SV30010
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
96-well tissue culture plates Fisher 07-200-89  
96-well round bottom sterile plates (not coated) Fisher 07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY406
Mouse TNFα Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY410
Fluorescein diacetate Sigma-Aldrich F7378
RLT buffer Qiagen 79216
RNeasy mini kit Qiagen 74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit Invitrogen V-6694

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. ASM Press. (2004).
  2. Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
  3. Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
  4. Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
  5. Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
  6. Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
  7. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
  8. Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
  9. Burke, B., Lewis, C. E. The macrophage. 2nd edn, Oxford University Press. (2002).
  10. Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
  12. Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
  13. De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. 1967-1978 (2013).
  14. Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
  15. Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
  16. Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
  17. Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
  18. Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. 1528-1533 (1976).
  19. Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
  20. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
  21. Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
  22. Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
  23. Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
  24. Fernandez-Botran, R., Větvička, V. Methods in Cellular Immunology. 8, CRC Press. 8 (2001).
באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Arras, L., Guthrie, B. S., Alper, S. Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (93), e51306, doi:10.3791/51306 (2014).More

De Arras, L., Guthrie, B. S., Alper, S. Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (93), e51306, doi:10.3791/51306 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter