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Immunology and Infection

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

doi: 10.3791/51306 Published: November 3, 2014

Introduction

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Neste protocolo, descrevemos métodos eficientes para inibir genes em linhagens de células de rato macrófagos utilizando siRNAs e monitorar os efeitos desses tratamentos sobre a resposta imune inata. Estes procedimentos são realizados no formato de 96 poços, permitindo para telas de ARNi em forma de médio ou alto rendimento.

Em resposta a infecção, os humanos montar uma resposta imune inata imediata e uma resposta imune adaptativa mais lento, mas mais específico. Esta resposta imune inata rápida envolve o recrutamento e activação de células imunitárias inatas fagocíticas incluindo macrófagos 1. Classicamente macrófagos activados são envolvidos em respostas inflamatórias agudas e produzem proteínas antimicrobianas e compostos, citocinas e quimiocinas, e apresentam antígenos 2,3. Alternativamente macrófagos activados desempenham um papel na regulação da imunidade, manutenção da tolerância, a reparação de tecidos, a cicatrização de feridas e 4-8. Devido à sua ampla gama de funções, Os macrófagos podem desempenhar um papel em numerosas doenças, incluindo a aterosclerose, artrite, cancro e 9. Assim, o estudo dos macrófagos tem sido uma importante área de pesquisa por algum tempo em uma grande variedade de campos de doença.

Apesar da sua importância na resposta imune inata, os macrófagos podem ser um desafio células para trabalhar. Em particular, é difícil a obtenção de transfecção eficiente, utilizando reagentes de lípidos nos macrófagos sem toxicidade associada 10,11. Além disso, mesmo quando siRNA é eficientemente entregues aos macrófagos, a robustez do gene induzida por ARNi knockdown pode muitas vezes ser bastante moderado e pode variar de gene para gene.

Para superar estes desafios técnicos, nós otimizamos transfecção e técnicas knockdown 16/12 em duas linhas de células de rato macrófagos, RAW264.7 17 e 18 J774A.1. Esta abordagem utiliza o Sistema de Transporte de 96 poços Amaxa Nucleofector para transfecção; este sistemautiliza uma combinação de reagentes e electroporação para transfectar células especializadas em formato de 96 poços 19. Após transfecção, descrevemos métodos para maximizar a recuperação e viabilidade celular e para maximizar subseqüente knockdown gene induzida por siRNA. Para ilustrar a utilidade desta abordagem, os autores descrevem um protocolo para a entrega de siRNA para estas linhas celulares de macrófagos, estimular essas células com lipopolissacarídeo (LPS), e monitorizar a resposta imune inata no nível de produção de várias citocinas pró-inflamatórias. Nós fornecemos os dados da amostra em que têm como alvo a família de receptores Toll-like (TLR), cujos membros sentem LPS e outros padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), para regular a imunidade inata.

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Protocol

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1. A manutenção de linhas celulares de macrófagos

  1. Cresça RAW264.7 e linhas de células J774A.1 em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ºC na presença de 5% de CO 2. Para ajudar a manter a esterilidade, adicione 1% de penicilina / estreptomicina (pen / strep) para a mídia (embora este não é estritamente necessário).
  2. Passo crítico: Certifique-se que os macrófagos estão crescendo em um estado saudável para transfecção eficiente e knockdown gene induzida por siRNA. Use células entre as passagens 3 e 10 após o descongelamento fresco, uma vez que estas linhas de macrófagos apresentam a melhor eficiência de transfecção e manter robusta sobrevivência pós-transfecção nesta fase; não use um número de passagens maior (> 20), como a eficiência de transfecção e gene knockdown tanto diminuir significativamente.
  3. Para a transfecção siRNA optimizado, células da placa em 20% de confluência e crescer um ou dois dias até as células atingirem confluência não superior a 80%. As células crescidas não irá transfectar efficiently.

2. Sistema de Programação do vaivém 96 poços para a transfecção

  1. Inicie o software de transporte de 96 poços no computador conectado à nave. Selecione o novo arquivo de parâmetro a partir do topo do menu arquivo esquerda.
  2. Realce os poços que vai ser exibido transfectadas na placa de 96 poços esquemática. A caixa verde indicará que os poços são selecionados.
  3. Seleccionar o programa que corresponde à linha celular de macrófagos sendo usado (DS-136 para RAW264.7 ou DS-130 para J774A.1) e seleccionar aplicar, localizado abaixo da diagramado placa de 96 poços. Note-se que depois de seleccionar um programa, os poços na placa esquemática será de cor azul escura. Círculos vazios indicam poços que não foram atribuídos um programa e não vai ficar chocado.

3. Preparação dos reagentes para transfecção

  1. Preparar a solução de trabalho Nucleofector ™ misturando SF linha celular de 96 bem-solução Nucleofector ™com a totalidade do conteúdo do tubo de suplemento fechado. Permitir que os reagentes misturados a equilibrar à temperatura ambiente antes de usar. Armazenar o excesso de solução Nucleofector ™ completa a 4 ºC por até 3 meses para uso futuro.
  2. Pré-aquecer a solução salina DMEM, RPMI-1640, 0,25% de tripsina / EDTA, e fosfato tamponada (PBS) a 37 ºC antes de preparar os macrófagos para a transfecção.
  3. Prepare o siRNA para a transfecção por degelo em gelo. A fim de minimizar o número de degelos congelamento do siRNA, congelar novos siRNAs em alíquotas a primeira vez que eles são usados.
  4. Em experiências iniciais, utilizar siRNA a uma dose relativamente elevada de 2 uM (diluído 1:10 a partir de 20? M stocks). Posteriormente titular siRNAs que induzem gene robusto knockdown para baixo para doses mais baixas, embora sejam necessárias doses normalmente mais elevados para knockdown gene eficiente em macrófagos em comparação com outros tipos de células.
    NOTA: Os siRNAs estão disponíveis a partir de muitas fontes; knockdown bastante robusta gene pode ser obtidousando SMARTPOOLs siGenome, que são grupos de quatro siRNAs segmentação cada gene. Como controle negativo, use qualquer um dos vários conjuntos não-alvo siRNA ou siRNAs.
  5. Para controlar a eficiência da transfecção, transfectar ou o plasmídeo controlo pmaxGFP (fornecida nos kits Amaxa) ou siRNAs fluorescentemente marcadas em paralelo com os siRNAs experimentais. Esperar 30-50% de transfecção do plasmídeo GFP (ensaiado por microscopia ou por citometria de fluxo no dia após a transfecção) e> 99% de transfecção fluorescentemente marcado siRNA (ensaiada por citometria de fluxo imediatamente após a transfecção e recuperação).

4. Preparando os macrófagos para transfecção

  1. Separar macrófagos aderentes provenientes das placas de cultura de células por tripsinização. Aspirar a mídia e lave as células duas vezes com 10 ml de PBS. Após a remoção do PBS, incubar as células com pré-aquecida até 0,25% de tripsina / EDTA (1 ml / placa de 10 cm) durante 1-2 min até que as células comecem a separar. Bata suavemente na placa e mover a solução durante a incubação para maximizar a tripsinização.
  2. Após a incubação, adicionar 9 ml de meio DMEM + FBS, misture suavemente para cima e para baixo, e recolher as células por pipetagem em um tubo estéril.
  3. Contar o número de macrófagos isolados, utilizando um hemocitómetro. Espere cerca de 10 milhões de macrófagos por placa de 10 cm. Calcule o número total de macrófagos necessários; cada poço na 96 poços vaivém requer 200.000 células. Lembre-se de adicionar valor de alguns poços adicionais de células para permitir perdas de pipetagem.
  4. Pipetar o número calculado de células para um tubo de centrífuga. Centrifuga-se as células durante 10 min a 150 xg à temperatura ambiente. Não centrifugar muito rapidamente, pois isso vai diminuir saúde macrófagos e eficiência de transfecção.

5. Nucleofection de macrófagos com siRNA

  1. Usando uma placa de 96 poços de fundo redondo estéril (o que facilita a mistura, enquanto minimiza a perda de reagentes), adicionar 2 mL de cada siRNA para cada poço a ser transfected.
    Nota: Dependendo do número de siRNAs, isto pode ser realizado durante o passo de centrifugação de macrófagos.
  2. Aspirar a mídia a partir de células centrifugadas. Delicadamente ressuspender as células em solução Nucleofector ™ SF (contendo a solução suplemento), utilizando-se 20 ul por 200.000 células peletizadas. Uma vez ressuspensa, utilizar as células imediatamente para a transfecção óptima.
  3. Transferir as células ressuspensas para uma calha estéril; utilizando uma pipeta de canais múltiplos, a transferência de 20 mL da mistura de células ressuspenso em cada poço da placa de 96 poços contendo o siRNAs. Misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo.
  4. Transferir 20 uL da mistura de célula / siRNA para a placa com 96 poços Nucleocuvette ™ passo crítico:. Evitar a geração de bolhas durante o passo de transferência como este pode induzir erros durante Nucleofection.
  5. Depois de colocar todas as amostras experimentais na placa de transfecção, cobrir a placa de 96 poços, com a tampa fornecida e seey bater suavemente sobre uma superfície dura para remover quaisquer bolhas a partir das amostras.
  6. Coloque placa de 96 poços com tampa para o de 96 poços de transporte Nucleofector e selecione "carregar e iniciar 'no canto inferior direito da tela do programa. Antes Nucleofection, siga o prompt programa para salvar os resultados.
    Nota: Durante o processo de Nucleofection, poços transfectadas com sucesso será representado no 96 poços esquemática na tela por um círculo verde com um sinal de mais. Um círculo vermelho com sinais de menos indica um erro, provavelmente devido a bolhas ou mis-pipetagem do volume correto de reagentes.

6. Recuperação e chapeamento de macrófagos

  1. Imediatamente após Nucleofection, utilizando uma pipeta multicanal, adicionar 80 ul de pré-aquecido (37 ºC) RMP1-1640 meios de comunicação a cada poço. Adicionar os meios de comunicação para o lado de cada poço, permitindo que os meios de comunicação para misturar lentamente com as células transfectadas, as quais são muito delicado nesta fase. Não adicione a mídia muito rápido, pois isso irádiminuir consideravelmente a viabilidade.
  2. Colocar as placas de 96 poços com amostras transfectadas e meio RPMI-1640 numa incubadora de 37 ºC, com 5% de CO 2 durante 2 min; esta é crítica para permitir que as células para recuperar antes da manipulação posterior.
  3. Remova a placa de 96 poços da incubadora e transferir cuidadosamente a mistura de cada poço para uma placa de 96 poços de cultura de tecidos utilizando uma pipeta multicanal.
  4. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 100 ul de pré-aquecido (37 ºC) DMEM + FBS a cada poço.
  5. Incubar a placa de cultura de tecidos de 96 poços com amostras em uma incubadora de 37 ºC, com 5% de CO 2 durante 24-36 hr (optimizar o momento exacto para siRNAs individuais, embora este intervalo de tempo, geralmente funciona bem).

7. Estimulação de macrófagos com LPS

  1. Após a 24-36 horas pós-Nucleofection incubação, preparar LPS (ou outro PAMPs) em meio fresco. Prepare meio fresco o suficiente para todos os poços (200 mL mEDIA / poço da placa de 96 poços e um pouco mais para a pipetagem). Dilui-se LPS para uma concentração final de 20 ng / mL em DMEM + FBS.
  2. Media cuidadosamente aspirado a partir da placa de 96 poços e adicionar o meio fresco contendo os LPS às células.
  3. Monitorar a resposta ao LPS ou outros MMAPs em vários momentos após a estimulação. 6 horas é suficiente para gerar uma resposta de citocinas inflamatórias robusto para citocinas tais como IL-6 ou TNFa.

8. Acompanhamento da Induzida imunitário inatas Response, Gene Knockdown e Viabilidade de macrófagos

  1. Para monitorizar a produção de citocinas induzida por LPS, pipeta-se o sobrenadante das células para uma placa de armazenamento de 96 poços. A produção de citocinas pode ser então medido por ELISA.
  2. Uma vez que o sobrenadante é removido, monitorar a viabilidade celular utilizando diacetato de fluoresceína (quando clivada por esterases celulares em células vivas, este composto se torna fluorescente). Identificar os siRNAs que têm como alvo os genes que controlam a viabilidade celular usando tsua abordagem. Nota: o processo de transfecção em si deve ter pouco efeito sobre a viabilidade se for realizada correctamente.
    1. Adicionar diacetato de fluoresceína (5 mg estoque / mL em acetona) a cada poço (1: 100 de diluição final em PBS).
    2. Incubar à temperatura ambiente durante 1-5 min e, em seguida, monitorar fluorescência nas células, utilizando um leitor de placas (460 nm de excitação, 515 nm de emissão).
    3. Opcional: Para assegurar que a fluorescência nos poços é uniforme, lisar as células, utilizando tampões tais como RIPA; isto proporciona um sinal fluorescente uniforme no poço, como alguns leitores de placas estão configurados para monitorar apenas uma pequena porção do poço; se as células não são colocadas de maneira uniforme, o diacetato de fluoresceína pode dar uma leitura imprecisa.
  3. Como uma alternativa para monitorar a viabilidade celular, monitorar gene induzida por siARN knockdown por qPCR utilizando ARN derivado a partir das células aderentes.
    1. Após o sobrenadante é removido a partir das células (passo 8.1), o anúnciod tampão RLT (que é usado para a lise e preservação de ARN) directamente para as células aderentes para lisar-los.
    2. Isolar ARN utilizando um kit de preparação de RNA tais como o mini-kit RNeasy, e usar qPCR com iniciadores específicos do gene para monitorar gene relativa knockdown para controlar o tratamento de siRNA. Use Βactin ou iniciadores para GAPDH para normalização.
  4. Como uma outra alternativa para controlar outros aspectos da resposta imune inata, monitorar a capacidade fagocitica dos macrófagos adicionando marcado com FITC E. coli partículas directamente sobre as células aderentes utilizando um kit. Seguindo o protocolo do fabricante, o que leva apenas algumas horas, monitorizar a absorção fagocítica utilizando um leitor de placas ou microscopia.

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Representative Results

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Para demonstrar a eficiência de transfecção usando esta abordagem, foi monitorada a absorção de siARN marcado com FITC utilizando um citómetro de fluxo (Figura 1).

Para ilustrar a utilidade da nossa abordagem para o controlo da resposta imune inata, que transfectadas siRNAs dirigidos conhecidos genes reguladores da imunidade inata para a linha celular RAW264.7 de macrófagos, as células estimuladas com LPS, em seguida, monitorizada a produção de citocinas pró-inflamatórias IL 6 e TNF. Diferentes TLRs reconhecer diferentes MMAPs, com LPS a partir de bactérias Gram negativas reconhecidos por TLR4 20, lipopéptidos, como reconhecido por PAM3CSK4 TLR2 21, e ARNcd a partir de vírus, tais como o poli mímico (I: C) reconhecido por TLR3 22,23. Como mostrado na Figura 2, a inibição da TLR4 (mas não outros TLRs utilizando siRNA) diminui fortemente a produção induzida por LPS de IL-6 e TNFa. Além disso, a inibição da IL-6 com IL-siRNA também diminui6 produção sem afectar a produção de TNFa (comparar painel A para B na Figura 2).

A Figura 1
Figura 1: siARN marcado com FITC é eficientemente transfectado para a linha celular de rato macrófagos J774A.1 utilizando os métodos descritos Imediatamente após a transfecção, as células foram lavadas várias vezes, fixadas em paraformaldeído, e a fluorescência foi monitorizada por citometria de fluxo.. A figura compara as células incubadas na presença de FITC-siRNA que ou foram transfectadas (curva azul) ou não (curva a vermelho).

A Figura 2
Figura 2: A eficácia e especificidade de ARNsi no macrófago do ratolinha celular RAW264.7. RAW264.7 células foram transfectadas com os ARNsi indicados (ou controlar não com o objectivo de piscinas siRNA # 1 ou 2 ou siRNAs que alvejam TLR4, TLR3, TLR2, ou IL-6 como indicado). 24 horas mais tarde, as células foram estimuladas com 20 ng / ml de LPS durante 6 h e a produção de citocinas (IL-6 no painel A ou TNFa no painel B foi subsequentemente monitorizados por ELISA. Os asteriscos indicam valor significativamente diferente do tratamento de controlo (p <0,05 , t-teste).

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Discussion

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Numerosos estudos têm sido publicados em que genes individuais têm sido alvo de siRNA em macrófagos murinos. Enquanto a transfecção mediada por lípidos foi usado para entregar siRNA para linhas celulares de macrófagos, numa base individual, estes métodos sofrem de efeitos potenciais sobre a viabilidade, knockdown gene limitada, e variabilidade de gene para gene. Para desenvolver ensaios mais robustos que poderiam ser usados ​​para direcionar genes na forma de médio ou de alto rendimento, nós otimizamos técnicas que utilizam o sistema de transporte Amaxa Nucleofector 96 poços, que apresenta maior consistência em knockdown do gene e efeitos limitados sobre a viabilidade (este mais robusto sistema é mais caro do que as abordagens mediada por lipídicas). Muitas variáveis ​​foram testadas a fim de optimizar estes procedimentos. Fomos capazes de utilizar este sistema para entregar de forma eficiente siRNA para muitos macrófagos primários diferentes e imortalizado linhas celulares de macrófagos (em alguns casos isso se revelem necessários usando o kit Amaxa otimização linha celular de 96 poços). Eun testes preliminares com estas linhas diferentes do mouse macrófagos (células RAW264.7, J774A.1 e MH-S) e células primárias (tioglicolato-suscitou e macrófagos da medula óssea derivada), descobrimos que as células RAW264.7 e J774A.1 exibiu o knockdown de genes induzida por siARN mais robusta (seguido por MH-S e células primárias, respectivamente, dados não mostrados). Como estas duas linhas celulares de macrófagos imortalizadas são normalmente utilizados para o estudo, nós optimizado para os nossos procedimentos de ARNi mais usando estas linhas.

Para controlar a eficiência da transfecção, que quer utilizar o plasmídeo de controlo da GFP nos kits Nucleofector ou siARN marcado com FITC. O plasmídeo GFP exibe forte fluorescência no dia após a transfecção, com uma eficiência de transfecção de 30-50% na análise microscópica ou por citometria de fluxo (dados não apresentados). Com siARN marcado com FITC, observa-se> 99% de eficiência de transfecção, tal como testado por citometria de fluxo (dsRNA transfects melhor do que o DNA de plasmídeo). Embora seja importante para esperar por fluorescência paradesenvolvem quando se utiliza o plasmídeo GFP, o siRNA fluorescente devem ser monitorizados em relativamente pouco tempo após a transfecção, pois enfraquece o sinal de fluorescência com o tempo.

A transfecção nas condições descritas não têm um impacto significativo sobre a viabilidade celular. Nós normalmente monitorar a viabilidade celular após os nossos tratamentos siRNA usando fluoresceína diacetato. Este composto não é fluorescente; no entanto, quando clivada por esterases celulares em células vivas, torna-se fluorescente. Além disso, a forma fluorescente é então retido nas células com uma membrana plasmática intacta 24. Este ensaio baseado em fluorescência é um ensaio relativamente simples, rápido, barato e para monitorar a viabilidade da célula, embora haja outros ensaios mais sofisticados que, por exemplo, monitorizar os níveis de ATP celular.

Nós normalmente testar nossas células para função imunológica inata 24-36 horas após a transfecção, que está no lado mais cedo para RNAi em comparação com outras linhas celulares. Whum ile tem que esperar por proteínas endógenas para virar para facilitar knockdown gene, é preciso equilibrar isso com a perda de siRNA potência, e encontramos knockdown mais robusto nestas linhas de macrófagos, por vezes, um pouco mais cedo do que o típico 48-72 hr usado em outro tipos de células. Enquanto é preferível para monitorar os níveis de proteína por western blot, que tipicamente monitorizar os níveis de mRNA por qPCR, com o objectivo de estudar múltiplos genes de uma só vez, para o qual múltiplos anticorpos e western blots pode não ser prático. Nós utilizamos LPS na dose mínima que maximiza a produção de citoquinas inflamatórias.

Quando atingir novos genes com siRNA, começamos com a dose relativamente alta siRNA descrita no Protocolo e, em seguida, para baixo titular siRNAs que induzem um fenótipo. Controlos subsequentes destinados a evitar os efeitos fora do alvo incluem a utilização de múltiplos ARNic em cadeia dupla para determinar se mais do que um siRNA podem induzir o mesmo fenótipo, verificando gene knockdown por qPCR ou Western blot, e usando geestudos ne superexpressão para complementar a abordagem RNAi. Essas abordagens devem permitir a rápida identificação de genes que regulam a imunidade inata em macrófagos de camundongos.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Este artigo foi patrocinado pela Lonza, Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amaxa nucleofector 96-well shuttle system Lonza AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit Lonza V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line ATCC TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line ATCC TIB-67
siGenome smartpool siRNA Dharmacon varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool Dharmacon D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electroporation Invitrogen 13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS List Biological Laboratories 421
DMEM, high glucose Invitrogen 11995-065
RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) Fisher SV30010
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
96-well tissue culture plates Fisher 07-200-89  
96-well round bottom sterile plates (not coated) Fisher 07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY406
Mouse TNFα Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY410
Fluorescein diacetate Sigma-Aldrich F7378
RLT buffer Qiagen 79216
RNeasy mini kit Qiagen 74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit Invitrogen V-6694

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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De Arras, L., Guthrie, B. S., Alper, S. Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (93), e51306, doi:10.3791/51306 (2014).More

De Arras, L., Guthrie, B. S., Alper, S. Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (93), e51306, doi:10.3791/51306 (2014).

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