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Biology

पेप्टाइड epitopes के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक उच्च Throughput MHC द्वितीय बंधन परख

Published: March 25, 2014 doi: 10.3791/51308
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Institute for Immunology and Informatics, University of Rhode Island, 3Department of Computer Science, Dartmouth College

ERRATUM NOTICE

Summary

पुनः संयोजक मानव MHC द्वितीय अणुओं के साथ जैव रासायनिक assays तेजी, मात्रात्मक immunogenic मिलान पहचान में अंतर्दृष्टि, विलोपन, या डिजाइन प्रदान कर सकते हैं. यहाँ, 384 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए बढ़ाया एक पेप्टाइड MHC द्वितीय बाध्यकारी परख वर्णित है. यह लागत प्रभावी स्वरूप प्रोटीन deimmunization और वैक्सीन डिजाइन और विकास के क्षेत्र में उपयोगी साबित करना चाहिए.

Abstract

पुनः संयोजक मानव MHC द्वितीय अणुओं के साथ जैव रासायनिक assays तेजी, मात्रात्मक immunogenic मिलान पहचान में अंतर्दृष्टि, विलोपन, या डिजाइन 1,2 प्रदान कर सकते हैं. इधर, एक पेप्टाइड MHC द्वितीय बाध्यकारी परख 384 अच्छी तरह से प्रारूप करने के लिए बढ़ाया है. नीचे पहुंचा प्रोटोकॉल 75% से अभिकर्मक लागत कम कर देता है और पहले से 96 अच्छी तरह से प्रोटोकॉल 1,3-5 वर्णित से उच्च throughput है. विशेष रूप से, प्रयोगात्मक डिजाइन 384 अच्छी तरह एलिसा प्लेट प्रति एक MHC द्वितीय एलील के खिलाफ 15 पेप्टाइड्स के मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषण परमिट. एक भी तरल से निपटने रोबोट का उपयोग करना, इस विधि से एक शोधकर्ता कम से कम 48 घंटे में आठ सांद्रता और चार MHC द्वितीय एलील प्रकार की एक सीमा से अधिक तीन प्रतियों में लगभग नब्बे परीक्षण पेप्टाइड्स का विश्लेषण करने की अनुमति देता है. प्रोटीन deimmunization या वैक्सीन डिजाइन और विकास के क्षेत्र में कार्यरत अन्य प्रोटोकॉल अपने काम को सुविधाजनक बनाने में उपयोगी होने के लिए मिल सकता है. विशेष रूप से, कदम दर कदम निर्देश और दृश्य प्रारूपजौव के अन्य उपयोगकर्ताओं को जल्दी और आसानी से अपनी खुद की प्रयोगशालाओं में इस पद्धति को स्थापित करने के लिए अनुमति चाहिए.

Introduction

प्रोटीन चिकित्सीय एजेंट 6 के सबसे तेजी से बढ़ते स्तर के हैं, और biotherapeutic पाइपलाइनों का तेजी से विस्तार प्रोटीन दवाओं के विकास और उपयोग के साथ जुड़े चुनौतियों पर अधिक ध्यान केंद्रित किया है. एक अनूठा विचार एक स्वस्थ और प्रतिरक्षा प्रणाली के कामकाज में, सभी कोशिकी प्रोटीन प्रतिजन कोशिकाओं (APCs) द्वारा जांचा जाता है, कि इस तथ्य से उपजा है. एक बार APCs द्वारा भली भाँति, एक प्रोटीन छोटे पेप्टाइड टुकड़ों में विभाजित है, और ख्यात immunogenic क्षेत्रों द्वितीय श्रेणी प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल प्रोटीन (MHC द्वितीय) की नाली में लोड कर रहे हैं. पेप्टाइड MHC द्वितीय परिसरों तो एपीसी सतह पर प्रदर्शित है, और सच immunogenic पेप्टाइड्स, आत्मीय सीडी 4 टी सेल सतह रिसेप्टर्स 7 के साथ त्रिगुट MHC द्वितीय पेप्टाइड टी सेल रिसेप्टर परिसरों फार्म, टी सेल epitopes कहा जाता है. यह महत्वपूर्ण आणविक मान्यता घटना टी सेल सक्रियण में जो परिणाम एक जटिल संकेत झरना, साइटोकाइन की रिहाई शुरू करताएस, सीडी 4 टी सेल की मध्यस्थता बी कोशिका परिपक्वता, और करने के लिए बाध्य है और हमलावर एक्सोजेनस प्रोटीन स्पष्ट है कि आईजीजी परिसंचारी के अंत में उत्पादन. इस प्रकार, immunogenic प्रोटीन घटक टी सेल epitopes की पहचान करने और MHC द्वितीय जटिल गठन के लिए जिम्मेदार प्रमुख अवशेषों परिवर्तनशील द्वारा deimmunized किया जा सकता है. यह टी सेल epitopes कई और मोटे तौर पर immunogenic प्रोटीन भर में वितरित किया जा सकता है, हालांकि, यह देखते हुए भालू, और मिलान-हटाने परिवर्तन के बहुमत प्रोटीन समारोह या स्थिरता का एक अनजाने हानि का कारण होने की संभावना है. इसलिए, इंजीनियरिंग Biotherapies एक जटिल और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण उद्देश्य हो सकता है deimmunized, लेकिन सफल टी सेल का मिलान विलोपन परियोजनाओं 3,5,8-12 के कई उदाहरण मौजूद हैं. मोटे तौर पर एंटीबॉडी चिकित्सा विज्ञान के लिए प्रतिबंधित है, जो ग्राफ्टिंग आधारित "मानवीकरण", के विपरीत, मिलान हटाए जाने की परवाह किए बिना अनुक्रम, संरचना, समारोह का अनिवार्य रूप से किसी भी प्रोटीन लक्ष्य के लिए लागू किया जा सकता है, या homologo की उपलब्धताहमें मानव scaffolds. इस तरह के एक दृष्टिकोण को लागू करने के लिए पहला कदम लक्ष्य प्रोटीन अनुक्रम के भीतर एम्बेडेड कुंजी पेप्टाइड epitopes की पहचान है.

सिंथेटिक पेप्टाइड्स और पुनः संयोजक मानव MHC द्वितीय अणुओं का उपयोग उच्च throughput जैव रासायनिक assays मिलान पहचान और शमन 1,3-5 में तेजी से प्रारंभिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. ये एलिसा प्रकार assays अन्य प्रोटीन / वैक्सीन डिजाइन और विकास उपकरण के लिए एक शक्तिशाली पूरक हो सकता है. उदाहरण के लिए, मिलान मानचित्रण के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण समय, श्रम पर निर्भर करता है, और गहन पूर्व vivo सेल प्रसार assays के 15 संसाधन. संक्षेप में, एक लक्ष्य प्रोटीन की प्राथमिक अनुक्रम पहले ओवरलैपिंग पेप्टाइड्स के एक पैनल में बांटा गया है, 12 अवशेषों के साथ अक्सर 15 mers आसन्न पेप्टाइड्स के बीच ओवरलैप. पेप्टाइड पैनल रासायनिक संश्लेषित है और प्रत्येक पेप्टाइड के प्रतिरक्षाजनकता परिधीय Bloo कि रोजगार के कई अलग अलग immunoassays में से एक में परीक्षण किया जाता हैमानव दाताओं 13,14 से पृथक डी कोशिकाओं mononuclear (PBMC). परिणामों में अधिक से अधिक आत्मविश्वास प्रदान करने के लिए, पेप्टाइड्स आमतौर पर 50 या अधिक विभिन्न दानदाताओं से PBMC के साथ दोहराने में जांच की जाती है. Deimmunization परम उद्देश्य है जहां मामलों में, काम उत्परिवर्तित पेप्टाइड्स के अतिरिक्त पैनलों का उत्पादन और बाद में कार्यात्मक विश्लेषण 10 के लिए पूर्ण लंबाई प्रोटीन में किसी भी deimmunizing म्यूटेशन शुरू करने से पहले PBMC assays में नई पेप्टाइड पैनल का परीक्षण करने के लिए जरूरत से आगे बढ़ रहा है. इन सेलुलर assays मानव रोगियों में immunogenic क्षमता का आकलन करने के लिए सोने के मानक बने हुए हैं, इस तरह के एक व्यापक दृष्टिकोण की दक्षता एक तेजी से और उच्च throughput MHC द्वितीय पेप्टाइड बंधन परख का उपयोग ख्यात immunogenic epitopes prefiltering द्वारा सुधार किया जा सकता है.

इसी तरह, जैव रासायनिक पेप्टाइड MHC द्वितीय बाध्यकारी assays के मौलिक मिलान पहचान की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए सिलिको तरीकों में भविष्य कहनेवाला के साथ जोड़ा जा सकता है.टी सेल का मिलान भविष्यवाणी के लिए कम्प्यूटेशनल उपकरण की एक किस्म मौजूद हैं, उदाहरण ProPred 16 में शामिल हैं, MHCPred 17, SVRMHC 18, एआरबी 19, 20 SMM पंक्ति, NetMHCIIpan 21 के साथ ही EpiVax 22 से ऐसे EpiMatrix के रूप में स्वामित्व उपकरणों. इसी तरह, मिलान भविष्यवक्ताओं ने हाल ही में अन्य जैव सूचना विज्ञान और deimmunizing परिवर्तन प्रोटीन संरचना और समारोह 23-26 को बाधित कर सकता है कि जोखिम को कम करने के लिए डिजाइन एकीकृत प्रोटीन deimmunization एल्गोरिदम उपज के लिए आणविक मॉडलिंग उपकरणों के साथ संयुक्त किया गया है. कई मिलान भविष्यवक्ताओं हद तक सही 27,28 साबित किया है, वहीं कम्प्यूटेशनल परिणाम सदा ही प्रयोगात्मक सत्यापन की आवश्यकता होती है. रैपिड, उच्च throughput, और लागत प्रभावी प्रयोगात्मक विधियों सिलिको मिलान भविष्यवाणियों में के लिए एक प्रारंभिक फिल्टर के रूप में उपयुक्त हैं.

इसी तरह की एक नस में, मिलान भविष्यवक्ताओं रिवर्स vaccinolo के लिए प्रतिजन चयन ड्राइव कर सकते हैंGY 29,30. उदाहरण के लिए, जैव सूचना विज्ञान के क्षेत्र में प्रगति तेजी से रोगज़नक़ proteomes से निकाले पूरे प्रोटीन या पेप्टाइड epitopes के रूप में वैक्सीन उम्मीदवारों की पहचान है कि पूरे जीनोम स्क्रीन मिले हैं. इस प्रौद्योगिकी को सक्षम सुरक्षात्मक टीके की खोज और विकास देगी है, वहीं यह immunogenic टीका उम्मीदवारों की हठ से बड़ी सूची के रूप में एक नई चुनौती का परिचय. उच्च throughput पेप्टाइड MHC द्वितीय बाध्यकारी assays पेप्टाइड बंधन आत्मीयता बढ़ाता है और कई MHC द्वितीय alleles के बीच संकीर्णता बंधन से मिलान चयन मार्गदर्शन कर सकते हैं. प्रोटीन deimmunization साथ के रूप में, इस तरह के प्रयोगात्मक विधियों अंततः होनहार टीका सुराग के कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणी को मान्य करने के लिए आवश्यक हैं.

यहाँ, 384 अच्छी तरह से प्रारूप करने के लिए बढ़ाया एक पेप्टाइड MHC द्वितीय बाध्यकारी परख वर्णित है. प्रोटोकॉल अत्यधिक parallelized है और पहले 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूपों 1,3-5 वर्णित की तुलना में 75% से अभिकर्मक लागत कम कर देता है. एक एकल liqui का प्रयोगडी रोबोट से निपटने, इस विधि से एक शोधकर्ता आसानी से कम से कम 48 घंटे में आठ सांद्रता और चार MHC द्वितीय एलील प्रकार की एक सीमा से अधिक तीन प्रतियों में लगभग नब्बे परीक्षण पेप्टाइड्स का विश्लेषण करने की अनुमति देता है. यह लेख एक MHC द्वितीय एलील के खिलाफ सात प्रयोगात्मक पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए एक 384 अच्छी तरह एलिसा प्लेट की स्थापना का वर्णन करता है, लेकिन आसानी से वांछित पेप्टाइड्स और / या MHC के किसी भी संख्या के लिए प्रयोग पैमाने पर करने के रूप में इतनी फैल शीट Calculators पूरक सामग्री के रूप में प्रदान की जाती हैं द्वितीय अणुओं.

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Protocol

चार प्रमुख गतिविधियों पेप्टाइड MHC द्वितीय बाध्यकारी परख शामिल: 1 बाध्यकारी: टेस्ट पेप्टाइड्स समाधान चरण घुलनशील MHC द्वितीय प्रोटीन की बाइंडिंग के लिए लेबल नियंत्रण पेप्टाइड्स के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं. बंधन परीक्षण पेप्टाइड सांद्रता की एक विस्तृत रेंज पर मापा जाता है. 2 कैद: बाध्यकारी प्रतिक्रिया संतुलन दृष्टिकोण के बाद, पेप्टाइड MHC द्वितीय परिसरों पर कब्जा कर लिया और एक स्थिर एंटीबॉडी के साथ रचना पर निर्भर मान्यता द्वारा अनबाउंड पेप्टाइड और प्रोटीन से अलग हो रहे हैं. 3 जांच: कब्जा नियंत्रण पेप्टाइड मात्रात्मक समय हल प्रतिदीप्ति का उपयोग कर पाया है. 4-विश्लेषण: स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा, संसाधित साजिश रची और परीक्षण पेप्टाइड और MHC द्वितीय प्रोटीन की खुराक पर निर्भर बाइंडिंग गुण का पता लगाने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं.

एक उपलब्ध है, तो नीचे की प्रक्रिया में विभिन्न चरणों में, एक तरल से निपटने रोबोट के उपयोग की सिफारिश की है. विशेष रूप से एक 384 अच्छी तरह प्रारूप में, स्वचालित वितरण और तरल पदार्थ के कमजोर पड़ने अधिक में उपयोगकर्ता त्रुटि है, परिणाम को कम करता हैलगातार अच्छी तरह से अच्छी तरह से मात्रा, और मैनुअल 96 अच्छी तरह assays (नहीं दिखाया डेटा) की तुलना में आईसी 50 मूल्यों के लिए संकरा 95% विश्वास अंतराल पैदावार. एक तरल से निपटने रोबोट उपलब्ध नहीं है, तो "(तरल से निपटने रोबोट)" के साथ एनोटेट कदम हाथ से किया जा सकता है. यदि संभव हो तो इसी तरह, 384 अच्छी तरह से प्रारूप के साथ संगत है कि एक स्वचालित प्लेट वॉशर की सिफारिश की है. यह प्रभावी प्लेट धोने की प्रक्रिया का मानकीकरण. एक प्लेट वॉशर उपलब्ध नहीं है, तो "(प्लेट वॉशर)" के साथ एनोटेट कदम हाथ से किया जा सकता है.

1. कोट एलिसा प्लेट (दिवस 1)

  1. 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक काम एकाग्रता को borate बफर में L243 एंटीबॉडी शेयर (0.5 मिलीग्राम / एमएल) पतला.
    1. कोट करने के लिए एक एकल 384 अच्छी तरह से थाली, borate बफर के 9.8 मिलीलीटर शेयर एंटीबॉडी के 200 μl जोड़ें. (वैकल्पिक स्केलिंग के लिए पूरक स्प्रेडशीट कैलकुलेटर देखें).
  2. एक 384-W के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए L243 एंटीबॉडी समाधान के 25 μl जोड़ेंपक्ष सफेद एलिसा थाली उच्च बाध्यकारी. (तरल से निपटने रोबोट)
  3. एक पॉलिएस्टर फिल्म के साथ थाली सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते
    नोट: प्रत्येक 384 अच्छी तरह एलिसा थाली 15 परीक्षण एक MHC द्वितीय एलील के लिए आठ dilutions पर पेप्टाइड्स, साथ ही सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए समायोजित कर सकते हैं. यह अंततः तीन प्रतियों माप निकलेगा.

2. टेस्ट पेप्टाइड dilutions (दिवस 1) बनाओ

  1. DMSO में प्रत्येक परीक्षा पेप्टाइड की एक 10 मिमी स्टॉक के साथ शुरू, 384 अच्छी तरह polypropylene प्लेट (तालिका 1) का उपयोग साइट्रेट फॉस्फेट बफर में निम्नलिखित कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाते हैं. (तरल से निपटने रोबोट)
    नोट: एक पूर्ण 384 अच्छी तरह polypropylene प्लेट तीन अलग एलिसा प्लेटों की आवश्यकता है. एक polypropylene थाली में से एक तिहाई ही एक एलिसा प्लेट (चित्रा 1) की आवश्यकता होगी.
कमजोर पड़ने संख्या वॉल्यूम टीओ पिछले कमजोर पड़ने / शेयर से ले जोड़ने के लिए वॉल्यूम साइट्रेट बफर सान्द्र. कमजोर पड़ने की सान्द्र. बाध्यकारी रिएक्शन में सान्द्र. निष्प्रभावी एलिसा में
(Μl) (Μl) (माइक्रोन) (माइक्रोन) (माइक्रोन)
1 0.7 35.1 195.531 97.765 48.883
2 14.3 14.3 97.765 48.883 24.441
3 7.1 28.7 19.389 9.695 4.847
4 14.3 14.3 9.695 4.847 2.424
5 7.1 28.7 1.923 0.961 0.481
6 14.3 14.3 0.961 0.481 0.24
7 7.1 28.7 0.191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
निकालें और कमजोर पड़ने संख्या 8 से पेप्टाइड समाधान के 7.1 μl त्यागें.

परीक्षण पेप्टाइड कमजोर पड़ने श्रृंखला की तालिका 1. तैयारी.

चित्रा 1
चित्रा 1. परख बाध्यकारी पेप्टाइड का नक्शा प्लेट. Polypropylene 384 अच्छी तरह प्लेटें में पेप्टाइड dilutions की (ए) का नक्शा. प्रत्येक polypropylene प्लेट एक गाना खिलाफ प्रतिस्पर्धा बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं में 15 पेप्टाइड्स के तीन समूहों को समायोजित कर सकते हैं Le MHC द्वितीय एलील. बंधन प्रतिक्रिया संतुलन दृष्टिकोण के बाद (बी), प्रत्येक पेप्टाइड समूह विरोधी MHC द्वितीय एंटीबॉडी के साथ precoated किया गया है कि एक अलग 384 अच्छी तरह एलिसा थाली करने के लिए, तीन प्रतियों में तबादला हो गया है.

3. MHC द्वितीय मास्टर मिक्स दिवस (1) तैयार करें

  1. प्रतिक्रिया बफर बनाओ
    1. साइट्रेट फॉस्फेट बफर के 3920 μl 1 मिमी Pefa ब्लॉक के 80 μl और octyl-β-D-glucopyranaside के 60 मिलीग्राम जोड़ें. (वैकल्पिक स्केलिंग के लिए पूरक स्प्रेडशीट कैलकुलेटर देखें).
  2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (तालिका 2) का उपयोग कर प्रतिक्रिया बफर में 101 एनएम के लिए चयनित MHC द्वितीय शेयर समाधान पतला.
    नोट: MHC द्वितीय एकाग्रता अंततः निष्प्रभावी एलिसा परख में बाध्यकारी प्रतिक्रिया और 25 एनएम में 50 एनएम हो जाएगा. MHC द्वितीय शेयर सांद्रता निर्माता बहुत संख्या के आधार पर अलग अलग होंगे. (पूरक स्प्रेडशीट कैलकुलेटर देखें).
"> MHC द्वितीय ऐल्लि DRB1 *: 1501 MHC द्वितीय शेयर एकाग्रता (मिलीग्राम / एमएल) 1.3 MHC द्वितीय शेयर एकाग्रता (मिमी) 20 वॉल्यूम. MHC द्वितीय शेयर जोड़ने के लिए (एमएल) 14.65 वॉल्यूम. प्रतिक्रिया बफर जोड़ने के लिए (एमएल): 2,885.35 MHC द्वितीय मास्टर मिक्स एकाग्रता (एनएम) 101

MHC द्वितीय मास्टर मिश्रण की तालिका 2. तैयारी.

4. नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण दिवस (1) तैयार करें

  1. 2.1 कदम से 384 अच्छी तरह polypropylene प्लेट (चित्रा 1 ए) के "नकारात्मक नियंत्रण" अच्छी तरह से करने के लिए साइट्रेट फॉस्फेट बफर के 21.5 μl जोड़ें.
  2. 384 अच्छी तरह polypropylene प्लेट की "सकारात्मक नियंत्रण" अच्छी तरह से करने के लिए साइट्रेट फॉस्फेट बफर के 21.5 μl जोड़ें.
    नोट: "स्थितिसक्रिय नियंत्रण "नीचे, धारा 5 में पूरा हो जाएगा.
  3. एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में 3.2 कदम और पिपेट से MHC द्वितीय मास्टर मिक्स के 49.5 μl निकालें.
  4. कदम 4.3 से MHC द्वितीय मास्टर मिक्स के 49.5 μl को साइट्रेट बफर के 0.5 μl जोड़ें.
  5. 384 अच्छी तरह polypropylene थाली के "नकारात्मक नियंत्रण" अच्छी तरह से (चित्रा 1 ए) के लिए कदम 4.4 से MHC द्वितीय मास्टर मिक्स समायोजित एकाग्रता की 21.5 μl जोड़ें.
    नोट: इस नमूने MHC द्वितीय प्रोटीन, कोई नियंत्रण नहीं पेप्टाइड, और कोई परीक्षण पेप्टाइड युक्त शून्य संकेत नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है.

5. MHC द्वितीय मास्टर मिक्स करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण पेप्टाइड (दिवस 1) जोड़ें

MHC द्वितीय ऐल्लि DRB1 * Biotinylated नियंत्रण पेप्टाइड (अवशेष) अनुक्रम
0101 फ्लू हा बी (306-318) बायोटिन (Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-एमाइड
0301 Myoglobin (137-148) बायोटिन (Ahx) - (Ahx) LFRKDIAAKYKE, ओह
0401 Yar-B (1-14) बायोटिन (Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT, ओह
0701 TetTox बी (830-843) बायोटिन (Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE, ओह
1101 फ्लू हा बी (306-318) बायोटिन (Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-एमाइड
1501 MBP-B (84-102) बायोटिन (Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS, ओह

* हम अर्थव्यवस्था के लिए 10 मिलीग्राम पैमाने आदेश देने की सलाह देते हैं.
तालिका 3. विभिन्न MHC द्वितीय alleles के लिए नियंत्रण पेप्टाइड्स. *

  1. 20 माइक्रोन से कम एक पतला शेयर उपज के लिए ताजा DMSO में (DMSO में 400 माइक्रोन पर संग्रहीत) नियंत्रण पेप्टाइड 01:20 पतला.
    1. 25 μl 400 माइक्रोन नियंत्रण पेप्टाइड में जोड़ें475 μl DMSO. नोट: यह एक बड़ी अतिरिक्त है, लेकिन चिपचिपा DMSO के समाधान का सही से निपटने की अनुमति देता है.
  2. इसके अलावा 3.2 कदम से MHC द्वितीय मास्टर मिक्स में 5.1 कदम (20 मिमी) 1:100 से नियंत्रण पेप्टाइड पतला.
    1. MHC द्वितीय मास्टर मिक्स के शेष 2,850.5 μl करने के लिए कदम 5.2 में पतला नियंत्रण पेप्टाइड का 28.8 μl जोड़ें.
  3. 384 अच्छी तरह polypropylene प्लेट (4.2 कदम) (चित्रा 1 ए) के सकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से करने के लिए नियंत्रण पेप्टाइड (कदम 5.2) के साथ MHC द्वितीय मास्टर मिक्स के 21.5 μl जोड़ें. नोट: इस नमूने MHC द्वितीय प्रोटीन, नियंत्रण पेप्टाइड, और कोई परीक्षण पेप्टाइड युक्त उच्च संकेत सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है.

6. बाध्यकारी रिएक्शन दिवस (1) बनाओ

  1. बाध्यकारी प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए एक 1:1 के अनुपात में टेस्ट पेप्टाइड dilutions (2.1 कदम) में से प्रत्येक के लिए नियंत्रण पेप्टाइड (कदम 5.2) युक्त MHC द्वितीय मास्टर मिक्स जोड़ें.
    1. कोन युक्त MHC द्वितीय मास्टर मिक्स के 21.5 μl जोड़ें2.1 कदम से प्रत्येक परीक्षा पेप्टाइड कमजोर पड़ने की 21.5 μl करने के लिए कदम 5.2 से trol पेप्टाइड. (तरल से निपटने रोबोट)
  2. एक पॉलिएस्टर फिल्म के साथ बंधन रिएक्शन सील और मिलाते हुए बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गैर सीओ 2 नियंत्रित इनक्यूबेटर में 12-24 घंटे सेते हैं.

7. बेअसर और बाध्यकारी रिएक्शन (2 दिन) स्थानांतरण

  1. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से बाध्यकारी रिएक्शन (6.2 कदम) युक्त 384 अच्छी तरह polypropylene थाली निकालें.
  2. निराकरण बफर के साथ बंधन रिएक्शन 01:01 पतला. (तरल से निपटने रोबोट)
    1. अच्छी तरह से प्रत्येक बाध्यकारी प्रतिक्रिया के निराकरण बफर के 43 μl जोड़ें.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस से एलिसा प्लेट (1.3 चरण) निकालें और पीबीएस 0.05% बीच 20 से 60 मिलीग्राम / अच्छी तरह से साथ 3x धो लो. (प्लेट वॉशर)
  4. स्थानांतरण कदम 7.3 से एंटीबॉडी में लिपटे 384 अच्छी तरह एलिसा प्लेट की तीन प्रतियों कुओं में कदम 7.2 से प्रत्येक निष्प्रभावी बाध्यकारी प्रतिक्रिया के 25 μl. (चित्रा 1
  5. रातोंरात 2.5 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में या एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में एक पॉलिएस्टर फिल्म और जगह के साथ एलिसा प्लेट कवर.

8. एलिसा विकास दिवस (2 या 3)

  1. कदम 7.5 से एलिसा थाली निकालें, 60 μl / अच्छी तरह से पीबीएस 0.05% बीच के साथ 3 बार धोएं. (प्लेट वॉशर)
  2. DELFIA परख बफर में streptavidin-युरोपियम शेयर समाधान (0.1 मिलीग्राम / एमएल streptavidin, 7 यूरोपीय संघ 3 + / streptavidin) 1,000 गुना पतला.
    1. एक 384 अच्छी तरह से थाली के लिए, 10 मिलीलीटर परख बफर में 10 μl streptavidin-युरोपियम पतला.
  3. कदम 8.1 से 384 अच्छी तरह एलिसा थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से पतला streptavidin-युरोपियम के 25 μl जोड़ें. (तरल से निपटने रोबोट)
  4. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में एक पॉलिएस्टर फिल्म और जगह के साथ प्लेट कवर. नोट: 1 घंटा ऊष्मायन के दौरान, फ्रिज से संवर्धन समाधान निकालें और आरओ पर अंधेरे में 10 मिलीग्राम / प्लेट अलग सेटओम तापमान.
  5. 1 घंटा ऊष्मायन के बाद, 60 μl / अच्छी तरह से पीबीएस 0.05% बीच के साथ कदम 8.3 3x से 384 अच्छी तरह एलिसा प्लेट धो लो. (प्लेट वॉशर)
  6. कदम 8.5 से 384 अच्छी तरह एलिसा थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए संवर्धन समाधान के 25 μl जोड़ें. (तरल से निपटने रोबोट)
  7. एक पॉलिएस्टर फिल्म के साथ 384 अच्छी तरह एलिसा प्लेट कवर और प्लेट 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में बैठने की अनुमति.
  8. 200, स्टॉप इंटरनैशनल:. 1000, भूतपूर्व 340, एम. 10-15 मिनट ऊष्मायन के बाद, एक समय उदाहरण के लिए युरोपियम सेटिंग्स के साथ हल फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर (, प्रारंभ इंटरनैशनल का उपयोग कर कदम 8.7 से 384 अच्छी तरह एलिसा प्लेट की प्रतिदीप्ति पढ़ा . 615, cutoff: कोई नहीं, पीएमटी: ऑटो, / खैर पुस्तकें: 50).

9. डेटा विश्लेषण

  1. पक्ष द्वारा साइड कॉलम में 3 को दोहराने के मूल्यों (; वाई = प्रतिदीप्ति माप एक्स = परीक्षण पेप्टाइड एकाग्रता) के साथ XY प्रारूप ग्राफ में डेटा दर्ज करें.
  2. सभी डेटा के लिए एक्स मूल्यों को बदलने में लॉग ऑन करें: एक्स = प्रवेश (एक्स)
  3. प्रवेश टीआरए फ़िटआईसी 50 मूल्य निकालने के लिए एक साइट प्रतियोगी बंधन मॉडल के साथ डेटा nsformed.
  4. औसत नकारात्मक नियंत्रण मूल्य के लिए नीचे मूल्य नियंत्रित करें.
  5. वैश्विक स्तर पर शीर्ष मूल्य फिट और वैश्विक फिट पैरामीटर नीचे या सकारात्मक नियंत्रण के बराबर है कि बीमा है.

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Representative Results

Enterobacter cloacae P99 बीटा lactamase (bla) (Genbank आईडी # X07274.1) के परिपक्व पेप्टाइड अनुक्रम MHC द्वितीय एलील DRB1 * 1501 (तालिका 4) के लिए ख्यात पेप्टाइड बाँधने के लिए ProPred 16 के साथ विश्लेषण किया गया था. ProPred एक अनिवार्य P1 लंगर अवशेषों के साथ 117 nonamer पेप्टाइड्स पहचान (यानी एक एम, एल, मैं, वी, एफ, वाई, या 31 बाध्यकारी MHC द्वितीय के लिए आवश्यक है, जो स्थिति 1, पर पश्चिम). एक 5% सीमा में, केवल अधिक से अधिक अंक या 2.6 के बराबर होने की संभावना बाँधने हैं साथ पेप्टाइड्स. इस प्रकार, 5% दहलीज पर, केवल शीर्ष 11 पेप्टाइड्स * 1501 MHC द्वितीय DRB1 बाध्य करने के लिए भविष्यवाणी कर रहे हैं.

तालिका 4
तालिका 4. शीर्ष स्कोरिंग BLA पेप्टाइड्स और * 1501 MHC द्वितीय एलील DRB1 के लिए भविष्यवाणियों ProPred.

भविष्यवाणी epitop का एक प्रतिनिधि पैनलतों हमारे MHC द्वितीय बाध्यकारी परख (तालिका 4, बोल्ड प्रविष्टियों) में विश्लेषण के लिए चुना गया था. पंद्रह अवशेषों की BLA पेप्टाइड टुकड़े रासायनिक ख्यात nonamer MHC द्वितीय epitopes कृत्रिम प्रोटीन टुकड़े भीतर एम्बेडेड रहे थे कि इस तरह संश्लेषित किया गया. MHC द्वितीय बाध्यकारी नाली में ही केवल नौ अमीनो एसिड accommodates है, सबूत flanking दृश्यों पेप्टाइड MHC द्वितीय बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं कि पता चलता है, और 15-20 अवशेषों की सिंथेटिक पेप्टाइड्स इसलिए आमतौर पर 15 कार्यरत हैं. जैविक रूप से प्रसंस्कृत प्रोटीन टुकड़े में हो सकता है कि epitopes ओवरलैपिंग की जटिलता का प्रतिनिधित्व करने के लिए, हम (मैं) एक भविष्यवाणी बाँधने, (द्वितीय) एकल भविष्यवाणी nonbinders, (iii) कई बाँधने की भविष्यवाणी, (चतुर्थ) एकाधिक nonbinders भविष्यवाणी की है कि निहित कृत्रिम दृश्यों का परीक्षण किया या (v) भविष्यवाणी बाँधने और nonbinders (टेबल्स 4 और 5) के मिश्रण.

सारणी 5 रासायनिक संश्लेषित पेप्टाइड्स की सारणी 5. सूची.

ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में MHC द्वितीय DRB1 * 1501 के लिए बाध्य करने के लिए biotinylated MBP बी नियंत्रण पेप्टाइड (तालिका 3) के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए इन सिंथेटिक पेप्टाइड्स की क्षमता का विश्लेषण किया गया था. सिंथेटिक पेप्टाइड्स के लिए प्रतियोगी बंधन घटता चित्रा 2 में दिखाया गया. आईसी 50 मूल्यों चश्मे से एक साइट प्रतियोगी बंधन, nonlinear फिट समारोह (6 तालिका) का उपयोग लॉग तब्दील डेटा फिटिंग द्वारा गणना की गई. चित्रा 2 में देखा, पेप्टाइड्स स्वाभाविक रूप से तीन समूहों में विभाजन: आईसी 50 के साथ मजबूत बाँधने <1 माइक्रोन (पेप्टाइड 2 और 10), 1 माइक्रोन के साथ मध्यम बाँधने आईसी 50 <100 माइक्रोन (पेप्टाइड 4, 9, 11, और 24 ≤ ), आईसी 50 ≥ 100 μ साथ कमजोर बाँधने; एम (पेप्टाइड 31).

चित्रा 2
चित्रा 2. MHC द्वितीय एलील DRB1 के लिए BLA पेप्टाइड्स के प्रतियोगी बाध्यकारी वक्र * 1501. चुस्त बाँधने नारंगी लाइनों, मध्यम बाँधने हरी लाइनों, और कमजोर बांधने की मशीन एक लाल रंग की रेखा के साथ फिट हैं.

पेप्टाइड कल आईसी 50 (माइक्रोन) आईसी 50 के लिए 95% सीआई (माइक्रोन) फिट की गुणवत्ता (नि. 2)
2 0.1199 0.09404-0.1529 0.98
4 15.1 11.83-19.28 0.87
9 17.11 13.39-21.88 0.81
10 0.2743 .2149-.3502 0.98
11 10.49 8.252-13.34 0.98
24 4.787 3.769-6.082 0.96
31 190.6 137.7-263.9 0.80

तालिका 6. DRB1 * 1501 के लिए BLA पेप्टाइड टुकड़े के 50 मूल्यों आईसी की गणना.

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Discussion

Biotherapeutics 2012 32 में शीर्ष पांच दवाओं की बिक्री की चार का प्रतिनिधित्व, आधुनिक चिकित्सा का एक आधार के रूप में खुद को स्थापित किया है. Biopharmaceutics क्षेत्र के कई साल 6 निरंतर वृद्धि हुई है, और उपन्यास एजेंटों के चल रहे विकास के साथ ही biosimilars के उद्भव biopharmaceutical पाइपलाइनों का विस्तार किया गया. , भविष्य की खोज का आकलन करने और प्रोटीन चिकित्सा विज्ञान के प्रतिरक्षाजनकता कम करने के प्रारंभिक चरण biotherapeutic विकास का एक अभिन्न हिस्सा बन जाएगा. इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए, biotechnologists मिलान भविष्यवाणी 16-22 के लिए कम्प्यूटेशनल विधियों के लिए खुद के साथ ही समारोह 3,23-26 बनाए रखते हुए प्रतिरक्षाजनकता कम करने की तलाश है कि एकीकृत प्रोटीन डिजाइन एल्गोरिदम का लाभ उठा सकते हैं. इसी तरह, वैक्सीन डिजाइन और विकास भविष्य कहनेवाला एल्गोरिदम 4 की शक्ति को भुनाने सकता है, और रिवर्स vaccinology की निरंतर परिपक्वता सुरक्षात्मक उपज की उम्मीद हैपिछले प्रयासों 33 नहीं मिल पाई है कि संक्रामक एजेंटों की एक व्यापक सरणी के लिए टीके. इन कम्प्यूटेशनल उपकरण मौलिक दवा और टीका विकास की प्रक्रिया में तेजी लाने की क्षमता है, सिलिको भविष्यवाणियों में से परिणाम अंततः आगे तो शीर्ष प्रदर्शन उम्मीदवारों की एक विनयशील संख्या की पहचान के रूप में फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए. मात्रात्मक पेप्टाइड MHC द्वितीय विश्लेषण में हाल के अग्रिमों Luminescent आक्सीजन Immunoassays 35 Channeling आधारित इंजीनियर खमीर कोशिका की सतह डिस्प्ले सिस्टम 34 और microbead के विकास को शामिल किया है, लेकिन इन विट्रो में एलिसा प्रकार assays विशिष्ट MHC द्वितीय और पेप्टाइड जोड़े के बीच बंधन बढ़ाता के लिए workhorse रहते हैं. इधर, मानव MHC द्वितीय प्रतिरक्षा अणुओं के लिए बाध्य पेप्टाइड मिलान की, तेजी से मात्रात्मक, और लागत प्रभावी विश्लेषण के लिए एक microliter पैमाने प्रक्रिया में वर्णित है. इन विधियों funneling प्रक्रिया में एक प्रारंभिक चरण प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

पुप्रदर्शन की rposes, bla के अनुक्रम ProPred वेब सर्वर का उपयोग ख्यात MHC द्वितीय बाध्यकारी पेप्टाइड्स के लिए विश्लेषण किया गया था. इन पेप्टाइड्स के सात रासायनिक संश्लेषित और प्रयोगात्मक घुलनशील मानव MHC द्वितीय DRB1 * 1501 के लिए बाध्य करने के लिए परीक्षण किया गया. भविष्यवक्ता सटीकता की 28 अन्य विश्लेषण के लिए इसी प्रकार, ProPred बाध्यकारी भविष्यवाणी DRB1 * 1501 MHC द्वितीय एलील के लिए प्रयोगात्मक मापा आईसी 50 के साथ काफी अच्छी तरह से सहसंबद्ध. यह सही MHC की dilutions, नियंत्रण पेप्टाइड्स, और परीक्षण पेप्टाइड्स सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए परिणाम सांद्रता और देखभाल के क्षेत्र में बदलाव के प्रति संवेदनशील हैं कि नोट करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. इसी तरह, इस पद्धति की एक सीमा आईसी 50 मूल्यों MHC की सांद्रता और नियंत्रण पेप्टाइड्स के रिश्तेदार हैं कि है. BLA पेप्टाइड परीक्षण सेट में सर्वाधिक ProPred मिलान पुनः संयोजक DRB1 * 1501 के लिए बाध्य मजबूत प्रदर्शन स्थान पर रहीं. इसी तरह, अन्य सभी भविष्यवाणी मिलान बाँधने उच्च MHC द्वितीय समानताएं के लिए उदार प्रदर्शन किया. जैसी कि उम्मीद थी,ओवरलैपिंग भविष्यवाणी बाध्यकारी epitopes और nonbinding epitopes युक्त सिंथेटिक पेप्टाइड्स सभी मामलों में MHC द्वितीय बाँध पाए गए. भविष्यवाणी epitopes स्थान पर रहीं सबसे कम के दो फैला जो पेप्टाइड 31, सबसे कमजोर MHC द्वितीय बांधने की मशीन साबित हुई. पेप्टाइड 24, तथापि, अपने ही उच्च स्थान पर घटक मिलान (मिलान 24) 5% सीमा पर एक भविष्यवाणी बांधने की मशीन नहीं था कि इस तथ्य के बावजूद मध्यम आत्मीयता के साथ MHC द्वितीय बाँध पाया गया. दिलचस्प है, मिलान 24 BLA 10 deimmunizing के उद्देश्य से पिछले एक अध्ययन में पहचान की थी. उन प्रयोगों में, सिंथेटिक पेप्टाइड 24 मानव PBMC assays में अत्यधिक immunogenic होना दिखाया गया था. इस प्रकार, इस एक मामले में, हमारे MHC द्वितीय बाध्यकारी परख ProPred नहीं किया था, जबकि प्रतिरक्षाजनकता की भविष्यवाणी साबित हुई. कुल में परिणाम की संभावना immunogenic epitopes की दिशा में शोधकर्ताओं का मार्गदर्शन में कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियों की उपयोगिता का प्रदर्शन, लेकिन वे भी एक अभिन्न अंग के रूप में उच्च throughput प्रयोगात्मक विधियों के महत्व को रेखांकितप्रोटीन / वैक्सीन डिजाइन की प्रक्रिया.

महत्वपूर्ण बात है, यह 384 अच्छी तरह से प्रयोगात्मक डिजाइन अत्यधिक parallelized है और ऊपर से 15 पेप्टाइड्स और 384 अच्छी तरह एलिसा प्लेट प्रति एक MHC द्वितीय एलील के कठोर विश्लेषण परमिट. एक भी तरल से निपटने रोबोट का उपयोग करना, इस विधि से एक शोधकर्ता कम से कम 48 घंटे में चार MHC द्वितीय एलील प्रकार के खिलाफ नब्बे परीक्षण पेप्टाइड्स का विश्लेषण करने की अनुमति देता है. इस डिजाइन प्रत्येक एकाग्रता में आठ विभिन्न परीक्षण पेप्टाइड सांद्रता और तीन प्रतियों माप भी शामिल है. इसलिए, उपयोगकर्ता मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रात्मक परिणाम का आश्वासन दिया है. प्रोटीन चिकित्सा या वैक्सीन डिजाइन और विकास के क्षेत्र में काम कर रहे अन्य लोगों को इस प्रोटोकॉल प्रोटीन deimmunization या प्रतिरक्षाजनकता विश्लेषण में उनके काम को सुविधाजनक बनाने में उपयोगी होने के लिए मिल सकता है.

साइट्रेट फॉस्फेट बफर (22.2 मिमी साइट्रिक एसिड, 55.6 मीटरएम Dibasic ना 2 4 HPO, पीएच 5.4)
222 मिलीलीटर 0.1 एम साइट्रिक एसिड
278 मिलीलीटर 0.2 एम द्विक्षारकीय ना 2 4 HPO
500 मिलीलीटर MilliQ एच 2 हे
साइट्रिक एसिड, सोडियम फास्फेट, और MilliQ एच 2 ओ की 450 मिलीलीटर मिक्स 5.4 पीएच को समायोजित और 1 एल को क्यु
यह समाधान कमरे के तापमान पर स्थिर है.
बंधन प्रतिक्रिया बफर
साइट्रेट फास्फेट बफर, पीएच 5.4 के साथ 2% v / वी 1 मिमी PefaBloc
1.5% w / वी Octyl-β-D-glucopyranaside
सही दूर का प्रयोग करें.
1 मिमी PefaBloc
1 मिलीलीटर MilliQ एच 2 हे
25 मिलीग्राम PefaBloc अनुसूचित जाति (पाउडर)
-20 ˚ सेल्सियस पर aliquots और दुकान बनाओ
Borate बफर सूत्र (12.5 मिमी सोडियम tetraborateडेकाहाईड्रेट, पीएच 8.2)
1.19 ग्राम सोडियम tetraborate डेकाहाईड्रेट (सिग्मा)
250 मिलीलीटर MilliQ एच 2 हे
MilliQ एच 2 ओ की 225 मिलीलीटर में सोडियम tetraborate डेकाहाईड्रेट भंग 250 मिलीलीटर के लिए 8.2 और क्यु पीएच को समायोजित करें.
यह समाधान कमरे के तापमान पर स्थिर है.
पीबीएस के बीच (2.7 मिमी KCl, 1.5 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 136.9 मिमी NaCl, 8.9 मिमी ना 2 4 HPO • 7 2 हे, 0.05% बीच, पीएच 7.4)
4.5 एल MilliQ एच 2 हे 500 मिलीलीटर 10x है Dulbecco पीबीएस (DPBS)
2.5 मिलीलीटर बीच 20
यह समाधान कमरे के तापमान पर स्थिर है.
निराकरण बफर (50 मिमी Trizma एचसीएल, 8.0 पीएच)
475 मिलीलीटर MilliQ एच 2 हे
25 एमएल 1 एम Trizma एचसीएल
मिक्स और 8.0 पीएच को समायोजित
यह समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है

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Disclosures

लियोनार्ड Moise द्वारा नियोजित और EpiVax, इंक, प्रोविडेंस, आरआई में स्थित एक निजी स्वामित्व वाली जैव प्रौद्योगिकी कंपनी में स्टॉक विकल्प रखती है. इस शोध रिपोर्ट में निहित काम कंपनी के व्यावसायिक लक्ष्यों के साथ जुड़ा हो सकता है कि किसी भी पूर्वाग्रह से मुक्त है.

Acknowledgments

इस काम एनआईएच अनुदान R01-जीएम-098977 और CBK और पीपा के लिए R21-AI-098122 द्वारा समर्थित किया गया. आरएसएस इंजीनियरिंग के Thayer स्कूल से एक थायर अभिनव कार्यक्रम फैलोशिप द्वारा एक लूस फाउंडेशन फैलोशिप द्वारा और भाग में समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

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References

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Tags

बायोकैमिस्ट्री अंक 85 प्रतिरक्षा प्रोटीन प्रतिरक्षाजनकता MHC द्वितीय टी सेल का मिलान उच्च throughput स्क्रीन Deimmunization वैक्सीन डिजाइन

Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
पेप्टाइड epitopes के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक उच्च Throughput MHC द्वितीय बंधन परख
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