Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

En High Throughput MHC II Bindende Assay til kvantitativ analyse af peptidepitoper

doi: 10.3791/51308 Published: March 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Biokemiske analyser med rekombinant humant MHC II-molekyler kan give hurtige, kvantitative indsigt i immunogen epitop identifikation, sletning eller design. Her er en bindende peptid-MHC II-analysen skaleret til 384-brønds plader beskrevet. Denne omkostningseffektive format skulle vise sig nyttig i de områder af protein deimmunization og vaccine design og udvikling.

Abstract

Biokemiske analyser med rekombinant humant MHC II-molekyler kan give hurtige, kvantitative indsigt i immunogen epitop identifikation, sletning eller design 1,2. Her er en bindende peptid-MHC II-analysen skaleret til 384-godt-format. Den skaleret ned protokol reducerer reagensomkostninger med 75%, og er højere gennemløb end tidligere beskrevet 96-brønds protokoller 1,3-5. Specifikt eksperimentelle design tillader robust og reproducerbar analyse af op til 15 peptider mod et MHC II allel pr 384-brønds ELISA-pladen. Ved hjælp af en enkelt væskehåndtering robot, giver denne metode en forsker for at analysere ca ninety testpeptider i tre eksemplarer over et område af otte koncentrationer og fire MHC II allel typer i mindre end 48 timer. Andre, der arbejder inden for protein deimmunization eller vaccine design og udvikling kan finde protokollen til at være nyttige i at fremme deres eget arbejde. Især de trin-for-trin instruktioner og visuelle formataf JOVE bør give andre brugere mulighed for hurtigt og nemt at etablere denne metode i deres egne laboratorier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Proteiner er den hurtigst voksende klasse af terapeutiske midler 6, og den hurtige ekspansion af bioterapeutiske rørledninger har fokuseret stigende opmærksomhed på de udfordringer, der er forbundet med udvikling og anvendelse af proteinbaserede lægemidler. En unik overvejelse stammer fra det faktum, at i et sundt og fungerende immunsystem, er alle ekstracellulære proteiner udskilt af antigenpræsenterende celler (APC'er). Når internaliseret af APC'er, er et protein, spaltes i små peptidfragmenter, og formodede immunogene segmenter er lagt ind i rillen af ​​klasse II store histokompatibilitetskompleks proteiner (MHC II). Peptid-MHC II-komplekser vises derefter på APC-overfladen og sande immunogene peptider, betegnet T-celleepitoper, danner ternære MHC II-peptid-T-celle-receptor-komplekser med kognate CD4 T-celleoverfladereceptorer 7. Denne kritiske molekylær genkendelse begivenhed starter en kompleks signaleringskaskade, hvilket resulterer i T-celle-aktivering, frigivelse af cytokins, CD4 T-cellemedieret B-celle modning og i sidste ende produktion af cirkulerende IgG-antistoffer, som binder til og rydde ulovlige exogent protein. Således kan immunogene proteiner deimmunized ved at identificere udgør T-celleepitoper og mutere nøglegrupper er ansvarlige for MHC II-komplekset formation. Det bærer imidlertid bemærker, at T-celle-epitoper kan være mange og bredt fordelt i hele immunogene proteiner, og størstedelen af ​​epitop-slette mutationer kan forårsage en utilsigtet tab af protein funktion eller stabilitet. Derfor teknik deimmunized bioterapier kan være en kompliceret og teknisk udfordrende mål, men der findes flere eksempler på vellykkede T-celle epitop sletning projekter 3,5,8-12. I modsætning til podning-baserede "humanisering", som stort set begrænset til antistoflægemidler, kan anvendes epitop sletning til stort set alle protein-target uanset sekvens, struktur, funktion eller tilgængeligheden af ​​homologoos menneskelige stillads. Det første skridt til at gennemføre en sådan tilgang er at identificere de vigtigste peptidepitoper indlejret i målproteinsekvensen.

High throughput biokemiske analyser ved hjælp af syntetiske peptider og rekombinante humane MHC II-molekyler kan give hurtige foreløbige indsigt i identifikation og afhjælpning 1,3-5 epitop. Disse ELISA-assays kan være et effektivt supplement til andre protein / vaccine design og udviklingsværktøjer. For eksempel er en veletableret eksperimenterende tilgang til epitopkortlægning bygger på tid, arbejdskraft og ressourcekrævende ex vivo celleproliferationsassays 15. Kort fortalt er den primære sekvens af et målprotein først opdelt i et panel af overlappende peptider overlapper ofte 15-merer med 12 rester mellem tilstødende peptider. Peptidet panel kemisk syntetiseret og immunogeniciteten af ​​hvert peptid afprøves i en af ​​flere forskellige immunoassays, der anvender perifere blood mononukleære celler (PBMC) isoleret fra humane donorer 13,14. At give større tillid til resultaterne, peptider typisk testet i replikat med PBMC fra 50 eller flere forskellige donorer. I tilfælde, hvor deimmunization er det ultimative mål, er det arbejde, forværres yderligere af behovet for at producere yderligere paneler af muterede peptider og afprøve de nye peptid-paneler i PBMC analyser, før der indføres nogen deimmunizing mutationer i proteinet i fuld længde for efterfølgende funktionel analyse 10. Mens disse cellulære assays fortsat guldstandarden for vurdering immunogen potentiale i menneskelige patienter, kan effektiviteten af ​​en sådan udtømmende tilgang forbedres ved forfiltrering formodede immunogene epitoper ved hjælp af en hurtig og høj MHC II-peptid-binding assay.

Ligeledes kan biokemiske peptid-MHC II bindingsassays kombineres med prædiktiv in silico metoder til at radikalt fremskynde epitop identifikationsprocessen.Der findes en række beregningsværktøjer til T-celle epitop forudsigelse; eksempler ProPred 16 MHCPred 17. SVRMHC 18, ARB 19, SMM-tilpasse 20 NetMHCIIpan 21 samt proprietære værktøjer såsom EpiMatrix af EpiVax 22. Ligeledes har epitop prædiktorer for nylig blevet kombineret med andre bioinformatik og molekylære modelleringsværktøjer til afkaster integrerede protein deimmunization algoritmer designet til at mindske risikoen for, at deimmunizing mutationer kan forstyrre proteiners struktur og funktion 23-26. Mens flere epitop prædiktorer har vist sig at være rimeligt nøjagtige 27,28, beregningsmæssige resultater uvægerligt kræve eksperimentel validering. Hurtig og høj kapacitet, og omkostningseffektive eksperimentelle metoder er bedst egnet som en foreløbig filter for in silico epitop forudsigelser.

I en lignende åre kan epitop prædiktorer drive antigen udvælgelse til omvendt vaccinology 29,30. For eksempel har fremskridt i bioinformatik gav hele genomet skærme, der hurtigt identificerer vaccinekandidater i form af hele proteiner eller peptidepitoper udvundet patogen proteomer. Mens dette nødvendig teknologi er omformningen opdagelse og udvikling af beskyttende vacciner, det indfører en ny udfordring i form af intractably store lister af immunogene vaccine kandidater. High throughput peptid-MHC II bindingsassays kan vejlede epitop udvælgelse ved at kvantificere peptid bindingsaffinitet og bindende promiskuitet blandt flere MHC II alleler. Som med protein deimmunization er sådanne eksperimentelle metoder i sidste ende forpligtet til at validere beregningsmæssige forudsigelse af lovende vaccine kundeemner.

Her er en bindende peptid-MHC II-analysen skaleret til 384-brønds format beskrevet. Protokollen er meget paralleliseret og reducerer reagensomkostninger med 75% i forhold til tidligere beskrevne 96-brønds plade formater 1,3-5. Hjælp af en enkelt liquid håndteringsrobot, denne metode giver en forsker for nemt at analysere ca ninety testpeptider i tre eksemplarer over en række på otte koncentrationer og fire MHC II allel typer i mindre end 48 timer. Denne artikel beskriver opsætningen af ​​en 384-brønds ELISA-plade til analyse af syv eksperimentelle peptider mod et MHC II-allel, men regneark regnemaskiner leveres som supplerende materiale så nemt skalere eksperimentet til et vilkårligt antal af ønskede peptider og / eller MHC II-molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fire store aktiviteter omfatter bindende peptid-MHC II-analysen: 1-Binding: Test peptider konkurrere med mærkede kontrol peptider til opløsning fase binding af opløselige MHC II-proteiner. Binding måles over en bred vifte af test-peptidkoncentrationer. 2-Capture: Efter bindingsreaktionen nærmer ligevægt, er peptid-MHC II-komplekserne indfanges og adskilt fra ubundet peptid og protein ved konformationsafhængige anerkendelse med et immobiliseret antistof. 3-Detection: Captured kontrol peptid kvantitativt påvises ved hjælp af tidsopløst fluorescens. 4-Analyse: Spektroskopiske data behandles, afbildes og analyseres for at fastslå dosisafhængige bindende egenskaber af test-peptid og MHC II-proteiner.

På forskellige trin i proceduren nedenfor anbefales brugen af ​​en væske håndteringsrobot hvis en sådan findes. Især i en 384-brønds format, automatiseret dispensering og fortynding af væsker minimerer brugerens fejl, resulterer i merekonsekvent godt-til-godt volumener, og giver smallere 95% konfidensintervaller for IC50-værdier i forhold til manuel 96-brønds analyser (data ikke vist). Hvis en væske håndteringsrobot ikke er tilgængelig, trinene annoteret med "(flydende håndteringsrobot)" kan ske ved hånden. Tilsvarende, hvis det er muligt, en automatiseret pladevasker, der er kompatibel med 384-brøndsformatet anbefales. Denne effektivt standardiserer pladen vaskeprocessen. Hvis en pladevasker ikke er tilgængelig, trinene annoteret med "(pladevasker)" kan ske ved hånden.

1.. Coat ELISA-pladen (dag 1)

  1. Fortynd L243-antistof lager (0,5 mg / ml) i boratpuffer til en fungerende koncentration på 10 ug / ml.
    1. At coate en enkelt plade med 384 brønde, der tilsættes 200 pi lager antistof til 9,8 ml boratpuffer. (Se supplerende regneark lommeregner til alternativ skalering).
  2. Tilsættes 25 ul af L243-antistof til hver brønd af en 384-well høj-bindende hvid ELISA-plade. (Væskehåndtering robot)
  3. Forsegle pladen med en polyesterfilm og inkuberes natten over ved 4 ° C.
    Bemærk: Hver 384-brønds ELISA-plade kan rumme op til 15 testpeptider på otte fortyndinger til et MHC II allel, samt de positive og negative kontroller. Dette vil i sidste ende give tredobbelte målinger.

2. Gør Test Peptid fortyndinger (dag 1)

  1. Begyndende med en 10 mM bestand af hver prøve peptid i DMSO, foretage følgende fortyndingsrække i citratphosphatbuffer bruge 384-hullers polypropylenplader (tabel 1). (Væskehåndtering robot)
    Bemærk: Et komplet 384-godt polypropylen plade kræver tre separate ELISA-plader. En tredjedel af en plade af polypropylen vil kun kræve en ELISA-plade (fig. 1).
Udvanding Antal Volume to tage fra forudgående fortynding / lager Volumen citratbuffer for at tilføje Konc. fortyndingsbuffer Konc. i bindingsreaktion Konc. i neutraliseret ELISA
(Pi) (Pi) (UM) (UM) (UM)
1 0.7 35.1 195,531 97,765 48,883
2 14.3 14.3 97,765 48,883 24,441
3 7.1 28.7 19,389 9.695 4.847
4. 14.3 14.3 9.695 4.847 2,424
5. 7.1 28.7 1.923 0,961 0,481
6 14.3 14.3 0,961 0,481 0,24
7 7.1 28.7 0,191 0.095 0,048
8. 14.3 14.3 0.095 0,048 0.024
Fjern og kassér 7.1 pi peptid løsning fra fortynding nummer 8.

Tabel 1.. Forberedelse af test peptid fortyndingsrække.

Figur 1
Figur 1.. Pladediagram af peptid Binding analysen. (A) Kort over peptid fortyndinger i polypropylen 384-brønds plader. Hver plade polypropylen kan rumme tre grupper af 15 peptider i konkurrencesager bindende reaktioner mod en sing le MHC II-allel. (B) Efter bindingsreaktionen nærmer ligevægt, er hvert peptid gruppe overføres i tre eksemplarer, til en separat 384-brønds ELISA-plade, der er blevet belagt med anti-MHC II-antistof.

3. Forbered MHC II Master Mix (dag 1)

  1. Gør Reaction Buffer
    1. Tilføj 80 pi af 1 mM Pefa Bloc og 60 mg octyl-β-D-glucopyranaside til 3.920 pi citratphosphatbuffer. (Se supplerende regneark lommeregner til alternativ skalering).
  2. Fortynd udvalgte MHC II stamopløsninger til 101 nM i Reaction Buffer med en 15 ml konisk rør (Tabel 2).
    Bemærk: MHC II-koncentrationen i sidste ende vil være 50 nM i bindingsreaktionen og 25 nM i den neutraliserede ELISA. De MHC II stamkoncentrationer vil variere alt efter producent lotnummer. (Se supplerende regneark lommeregner).
"> MHC II Allele DRB1 *: 1501 MHC II Stock Concentration (mg / ml) 1.3 MHC II Stock Concentration (mM) 20 Bd. MHC II Lager til Tilføj (ml) 14.65 Bd. Reaction Buffer til Tilføj (ml): 2885,35 MHC II Master Mix Koncentration (Nm) 101

Tabel 2.. Udarbejdelse af MHC II-mester mix.

4.. Forbered de negative og positive kontroller (dag 1)

  1. Tilføj 21,5 ul citratphosphatbuffer til "negativ kontrol" brønd i 384 brønde polypropylen plade fra trin 2.1 (figur 1A).
  2. Tilføj 21,5 ul citratphosphatbuffer til "positiv kontrol" brønd i 384 brønde polypropylen plade.
    Bemærk: "positiv kontrol "vil blive afsluttet i afsnit 5 nedenfor.
  3. Fjern 49,5 ul af MHC II Master Mix fra trin 3.2 og pipette i en 1,5 ml Eppendorf rør.
  4. Tilsæt 0,5 ul Citrate Buffer til de 49,5 ul af MHC II Master Mix fra trin 4.3.
  5. Tilføj 21,5 pi af koncentrationen justeret MHC II Master Mix fra trin 4.4 til "negativ kontrol" brønd i 384 brønde polypropylen plade (figur 1A).
    Bemærk: Denne prøve repræsenterer nul-signal negativ kontrol indeholdende MHC II-protein, NO kontrol peptid, og ingen test peptid.

5.. Tilsæt passende kontrolforanstaltninger peptid til MHC II Master Mix (dag 1)

MHC II Allele DRB1 * Biotinyleret Kontrol Peptid (Rester) Sequence
0101 Influenza-HA-B (306-318) Biotin-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amid
0301 Myoglobin (137-148) Biotin-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401 YAR-B (1-14) Biotin-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) Biotin-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 Influenza-HA-B (306-318) Biotin-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amid
1501 MBP-B (84-102) Biotin-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* Vi anbefaler at bestille 10 mg skalaen for økonomien.
Tabel 3. Kontrol Peptider til forskellige MHC II alleler. *

  1. Control peptid (opbevares ved 400 um i DMSO) 1:20 Fortynd i frisk DMSO for at give en fortyndet bestand på 20 uM.
    1. Tilsæt 25 ul 400 uM kontrol peptid til475 pi DMSO. Bemærk: Dette er et stort overskud, men tillader præcis håndtering af tyktflydende DMSO-løsninger.
  2. Yderligere fortynde Control Peptid fra trin 5.1 (20 mM) 1:100 i MHC II Master Mix fra trin 3.2.
    1. Tilføj 28.8 pi of Control Peptide fortyndet i trin 5.2 til de resterende 2,850.5 ul af MHC II Master Mix.
  3. Tilføj 21,5 ul af MHC II Master Mix med kontrol peptid (trin 5.2) til den positive kontrol brønd i 384 brønde polypropylen plade (trin 4.2) (Figur 1A). Bemærk: Denne prøve repræsenterer det høje signal positiv kontrol indeholdende MHC II-protein, kontrol-peptid, og ingen test peptid.

6.. Gør bindingsreaktionen (dag 1)

  1. Føj MHC II Master Mix indeholder Kontrol peptid (trin 5.2) til hver af testpeptidet fortyndinger (trin 2.1) i forholdet 1:1 til at skabe bindingsreaktionen.
    1. Tilføj 21,5 ul MHC II Master Mix indeholder Control Peptid fra trin 5,2-21,5 ul af hver test Peptid fortynding fra trin 2.1. (Væskehåndtering robot)
  2. Seal bindingsreaktionen med en polyesterfilm og inkuberes 12-24 timer i en ikke-CO 2 styret inkubator ved 37 ° C uden omrystning.

7.. Neutralisere og Overfør bindingsreaktionen (dag 2)

  1. Fjern 384-brønds polypropylen-plade indeholdende bindingsreaktionen (trin 6.2) fra 37 ° C inkubator.
  2. Fortynd bindingsreaktionen 1:1 med Neutralisering bufferen. (Væskehåndtering robot)
    1. Tilføj 43 ul af Neutralisering Buffer til hver bindingsreaktionen godt.
  3. Fjern ELISA-pladen (trin 1.3) fra 4 ° C og vaskes 3x med 60 ml / brønd PBS-0,05% Tween 20. (Pladevasker)
  4. Transfer 25 ul af hver neutraliseret bindingsreaktion fra trin 7.2 i tredobbelte brønde i antistofcoatede 384-brønds ELISA-plade fra trin 7.3. (Figur 1
  5. Dæk ELISA-pladen med en polyesterfilm og anbringes i en 37 ° C inkubator i 2,5 time eller i en 4 ° C køleskab natten over.

8.. ELISA Development (Dag 2 eller 3)

  1. Fjern ELISA-pladen fra trin 7,5, vaskes 3 gange med 60 ul / brønd PBS-0,05% Tween. (Pladevasker)
  2. Streptavidin-Europium stamopløsning (0,1 mg / ml streptavidin, 7 Eu 3 + / streptavidin) 1000-fold Fortynd i DELFIA Assay Buffer.
    1. For en 384-brønds plade, fortyndes 10 pi streptavidin-europium i 10 ml assaypuffer.
  3. Tilsættes 25 pi af fortyndet streptavidin-europium til hver brønd i 384-brønds ELISA-plade fra trin 8.1. (Væskehåndtering robot)
  4. Dæk pladen med en polyesterfilm og sted i mørke ved stuetemperatur i 1 time. Bemærk: Under 1 time inkubation fjernes Enhancement Solution fra køleskabet og der er afsat 10 ml / plade i mørke ved roabout temperatur.
  5. Efter 1 times inkubation vaskes 384-brønds ELISA-plade fra trin 8.3 3x med 60 ul / brønd PBS-0,05% Tween. (Pladevasker)
  6. Tilsæt 25 ul Enhancement Solution til hver brønd i 384-brønds ELISA-plade fra trin 8.5. (Væskehåndtering robot)
  7. Dæk 384-brønds ELISA-plade med en polyesterfilm og tillade pladen at sidde i mørke ved stuetemperatur i 10-15 min.
  8. Efter 10-15 minutters inkubation, læse fluorescensen af ​​384-brønds ELISA-plade fra trin 8.7 ved hjælp af en tidsopløst fluorescerende pladelæser med Europium indstillinger (for eksempel start Int.: 200, Stop Int.:. 1.000 Ex 340 Em . 615, Cutoff: Ingen, PMT: Auto, Læser / Well: 50).

9.. Dataanalyse

  1. Indtast data i XY-format graf med 3 gentagne værdier i side-by-side kolonner (X = testkoncentration peptid, Y = fluorescens måling).
  2. Log omdanne X-værdier for alle data: X = log (X)
  3. Monter log transformed data med et-site-kompetitiv binding model til at udtrække IC50-værdien.
  4. Fikser bunden værdi til den gennemsnitlige negative kontrolværdi.
  5. Globalt passer til den øverste værdi og sikre, at den globale fit parameter er under eller lig med den positive kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den modne peptidsekvens af Enterobacter cloacae P99 beta-lactamase-(BLA) (Genbank ID # X07274.1) blev analyseret med ProPred 16 for formodede peptid bindemidler til MHC II allelen DRB1 * 1501 (Tabel 4). ProPred identificeret 117 nonamere peptider med en obligatorisk P1 ankerenhed (dvs. M, L, I, V, F, Y eller W i position 1, som er nødvendig for MHC-II-bindende 31). Ved en tærskel på 5% peptider kun med scoringer større end eller lig med 2,6 er sandsynlige bindemidler. Således ved tærskel på 5%, er det kun de øverste 11 peptider forventes at binde MHC II DRB1 * 1501.

Tabel 4
Tabel 4. Bedst scoring ProPred forudsigelser for BLA peptider og MHC II allelen DRB1 * 1501.

Et repræsentativt panel af forudsagt epitopes blev udvalgt til analyse i vores MHC II bindende assay (tabel 4, fed poster). BLA peptidfragmenter af femten rester blev kemisk syntetiseret, således at formodede nonamer MHC II epitoper blev indlejret i de syntetiske proteinfragmenter. Mens MHC II bindingskløft selv kan rumme kun ni aminosyrer, tyder på, at flankerende sekvenser kan påvirke peptid-MHC II-interaktioner og syntetiske peptider på 15-20 rester er derfor almindeligt anvendt 15. At repræsentere kompleksiteten af ​​overlappende epitoper, der måtte opstå i biologisk forarbejdet protein fragmenter, vi testede syntetiske sekvenser, der indeholdt (i) enkelt forudsagte bindemidler, (ii) enkelt forudsagte nonbinders, (iii) flere forudsagt bindemidler, (iv) multiple forudsagt nonbinders, eller (v) en blanding af forudsagte bindemidler og nonbinders (tabel 4 og 5).

Tabel 5 Tabel 5. Liste af kemisk fremstillede peptider.

Kapaciteten af disse syntetiske peptider til at konkurrere med det biotinylerede MBP-B kontrol-peptid (tabel 3) om binding til MHC II DRB1 * 1501 blev analyseret som beskrevet i den ovennævnte protokol. Kompetitive bindings-kurver for de syntetiske peptider er vist i figur 2. IC50-værdier blev beregnet ved at montere log-transformerede data ved hjælp af en-site kompetitiv binding, lineær fit funktion Prism (tabel 6). Som det ses i figur 2, peptiderne naturligvis fordeles i tre grupper: stærke bindemidler med IC50 <1 uM (peptiderne 2 og 10), moderate ringbind med 1 uM ≤ IC50 <100 uM (peptiderne 4, 9, 11 og 24. ), svage ringbind med IC 50 ≥ 100 μM (peptid 31).

Figur 2
Figur 2.. Kompetitiv binding Curve af BLA peptider til MHC II allelen DRB1 * 1501. Tight bindemidler er fit med orange linjer, moderate bindemidler grønne linjer, og den svage bindemiddel en rødbrun linje.

Peptid Rank IC50 (uM) 95% CI for IC50 (uM) Kvaliteten af Fit (R2)
2 0,1199 ,09404-0,1529 0,98
4. 15.1 11,83-19,28 0,87
9 17.11 13,39-21,88 0,81
10 0,2743 ,2149-,3502 0,98
11 10.49 8,252-13,34 0,98
24 4,787 3,769-6,082 0,96
31 190,6 137,7-263,9 0.80

Tabel 6. Beregnet IC50-værdier af BLA peptidfragmenter for DRB1 * 1501.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bioterapeutiske har etableret sig som en hjørnesten i moderne medicin, der repræsenterer fire af de fem bedste sælgende lægemidler i 2012 32. Den Biopharmaceutics sektor har vist en vedvarende vækst i flere år 6, og den igangværende udvikling af nye stoffer, samt fremkomsten af biosimilars har udvidet biofarmaceutiske rørledninger. Et blik på fremtiden, vurdere og afbøde immunogeniciteten af ​​terapeutiske proteiner vil blive en integreret del af tidlig fase bioterapeutisk udvikling. For at lette denne proces, kan bioteknologer benytte sig af computerbaserede metoder til epitop forudsigelse 16-22 samt integrerede protein design algoritmer, der søger at reducere immunogenicitet og samtidig bevare funktion 3,23-26. Ligeledes kan vaccine design og udvikling udnytte kraften af prædiktive algoritmer 4, og den fortsatte modning af reverse vaccinologi forventes at give beskyttendeVacciner til en bred vifte af smitstoffer, der har unddraget tidligere bestræbelser 33. Mens disse beregningsværktøjer har kapacitet til radikalt accelerere narkotika og udvikling vaccine processer skal resultaterne af in silico forudsigelser i sidste ende blive filtreret yderligere for at identificere en medgørlig antal præsterer kandidater top. Nylige fremskridt inden for kvantitativ peptid-MHC II-analyse har omfattet udviklingen af manipuleret gærcelle overflade display-systemer 34 og microbead baserede Selvlysende Oxygen Kanalisering Immunoassays 35, men in vitro ELISA assays forbliver arbejdshest til kvantificering binding mellem specifikke MHC II og peptid par. Her er en procedure for hurtig, kvantitativ og omkostningseffektiv analyse af peptid epitop binding til humane MHC II immunmolekyler mikroliter skala beskrevet. Disse fremgangsmåder kan anvendes som et tidligt stadium eksperimentelt værktøj i kanalisere processen.

For purposes demonstration, blev sekvensen af ​​BLA analyseret for putative MHC II bindende peptider ved hjælp af ProPred webserver. Syv af disse peptider blev syntetiseret kemisk og eksperimentelt testet for binding til opløseligt humant MHC II DRB1 * 1501. I lighed med andre analyser af prædiktor nøjagtighed 28, ProPred bindende forudsigelse korreleret rimeligt godt med eksperimentelt målte IC50 for DRB1 * 1501 MHC II-allel. Det er også vigtigt at bemærke, at resultaterne er følsomme over for variationer i koncentrationer og pleje bør tages for at sikre nøjagtige fortyndinger af MHC, kontrol peptider og test peptider. Ligeledes kan en begrænsning af denne fremgangsmåde er, at IC50-værdier er i forhold til koncentrationerne af MHC-og kontrolforanstaltninger peptider. Blandt BLA peptid test sæt, den højest rangerende ProPred epitop udviste den stærkeste binding til rekombinant DRB1 * 1501. Ligeledes alle andre forudsagte epitop bindemidler udviste moderat til høj MHC II tilhørsforhold. Som forventet,syntetiske peptider indeholdende overlappende forudsagte bindende epitoper og ikke-bindende epitoper fandtes at binde MHC II i alle tilfælde. Peptid 31, som strakte sig to af de laveste rangeret forudsagte epitoper, viste sig at være det svageste MHC II bindemiddel. Peptid 24 blev imidlertid fundet at binde MHC II med moderat affinitet til trods for, at dens eneste højt rangeret bestanddel epitop (epitop 24) var ikke en forudsagt bindemiddel på 5% grænsen. Interessant nok blev epitop 24 identificeret i en tidligere undersøgelse med henblik på deimmunizing BLA 10. I disse eksperimenter blev syntetisk peptid 24 vist sig at være særdeles immunogene i humane PBMC assays. Således i denne ene tilfælde vores MHC-II-bindende assay viste sig at være prædiktiv for immunogenicitet mens ProPred ikke. Sammenlagt resultaterne demonstrere nytten af ​​beregningsmæssige forudsigelser i ledende forskere i retning sandsynlige immunogene epitoper, men også understrege betydningen af ​​high throughput eksperimentelle metoder som en integreret del afprotein / vaccine designprocessen.

Vigtigere er det, denne 384-brønds eksperimentelle design er meget paralleliseret og tillader grundig analyse af op til 15 peptider og et MHC II allel pr 384-brønds ELISA-pladen. Ved hjælp af en enkelt væskehåndtering robot, denne metode giver en forsker for at analysere halvfems testpeptider mod fire MHC II allel typer i mindre end 48 timer. Dette design omfatter otte forskellige test peptid koncentrationer og tredobbelt måling til hver koncentration. Derfor er brugeren sikret robuste og reproducerbare kvantitative resultater. Andre, der arbejder inden for terapeutiske proteiner eller vaccine design og udvikling kan finde denne protokol at være nyttige i at lette deres arbejde på protein deimmunization eller immunogenicitet analyse.

Citratphosphatbuffer (22,2 mM citronsyre, 55,6 mM dibasisk Na 2 HPO 4, pH 5,4)
222 ml 0,1 M citronsyre
278 ml 0,2 M dibasisk Na 2 HPO 4
500 ml MilliQ H2O
Bland citronsyre, natriumphosphat og 450 ml MilliQ H 2 O. PH justeres til 5,4 og qs til 1 L.
Denne opløsning er stabil ved stuetemperatur.
Binding reaktionsbuffer
Citratphosphatbuffer, pH 5,4 med 2% v / v 1 mM Pefabloc
1,5% w / v octyl-β-D-glucopyranaside
Brug højre væk.
1 mM Pefabloc
1 ml MilliQ H2O
25 mg Pefabloc SC (pulver)
Foretag portioner og opbevares ved -20 ˚ C.
Boratpuffer formlen (12,5 mM Natriumtetraboratdecahydrat, pH 8,2)
1,19 g natriumtetraborat decahydrat (Sigma)
250 ml MilliQ H2O
Natriumtetraboratdecahydrat opløses i 225 ml MilliQ H 2 O. PH justeres til 8,2 og qs til 250 ml.
Denne opløsning er stabil ved stuetemperatur.
PBS-Tween (2,7 mM KCI, 1,5 mM KH 2PO 4, 136,9 mM NaCI, 8,9 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,05% Tween, pH 7,4)
4,5 L MilliQ H2O 500 ml 10x Dulbeccos PBS (DPBS)
2,5 ml Tween 20
Denne opløsning er stabil ved stuetemperatur.
Neutralisering Buffer (50 mM Trizma HCI, pH 8,0)
475 ml MilliQ H2O
25 ml 1 M Trizma HCI
Bland og justere pH til 8,0
Denne opløsning er stabil ved 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Leonard Moise er ansat af og holder aktieoptioner i EpiVax, Inc., et privatejet biotekselskab, beliggende i Providence, RI. Det arbejde, der er indeholdt i denne analyse er fri for bias, som kan være forbundet med de kommercielle mål for virksomheden.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH R01-GM-098.977 og R21-AI-098.122 til CBK og KEG. RSS blev støttet delvist af en Luce Foundation Fellowship og delvist af en Thayer Innovation Program Fellowship fra Thayer School of Engineering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
  3. Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
  4. Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
  5. Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
  6. Aggarwal, S. R. What's fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
  7. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
  8. Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
  9. Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
  10. Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
  11. Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
  12. Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
  13. Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
  14. Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).
  15. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  16. Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
  17. Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
  18. Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).
  19. Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
  20. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).
  21. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9 (2010).
  22. De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
  23. Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
  24. Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
  25. Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
  26. Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).
  27. De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
  28. Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).
  29. Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
  30. Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
  31. Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
  32. Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636 (2012).
  33. Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
  34. Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
  35. Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
En High Throughput MHC II Bindende Assay til kvantitativ analyse af peptidepitoper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter