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Biology

Un essai de liaison à haut débit CMH II pour l'analyse quantitative du peptide épitopes

doi: 10.3791/51308 Published: March 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Dosages biochimiques avec des molécules du CMH II recombinants humains peuvent fournir des indications rapides quantitatives dans l'identification de l'épitope immunogène, la suppression, ou la conception. Ici, une analyse de liaison peptide-CMH II à l'échelle de plaques à 384 puits est décrite. Ce format rentable devrait se révéler utile dans les domaines de deimmunization de protéine et la conception et le développement de vaccins.

Abstract

Dosages biochimiques avec des molécules du CMH II recombinants humains peuvent fournir des indications rapides quantitatives dans l'identification de l'épitope immunogène, la suppression, ou la conception 1,2. Ici, un test de liaison peptide-CMH II est redimensionné au format de 384 puits. Le protocole mis à l'échelle vers le bas permet de réduire les coûts de réactifs de 75% et est un débit plus élevé que précédemment décrit les protocoles de 96 puits 1,3-5. Plus précisément, la conception expérimentale permet l'analyse robuste et reproductible d'un maximum de 15 peptides contre un allèle du CMH II à 384 puits par plaque ELISA. L'utilisation d'un seul robot de manipulation de liquide, cette méthode permet d'analyser un chercheur environ quatre-vingt dix peptides d'essai, en triple sur une gamme de concentrations huit et quatre types d'allèles du CMH II en moins de 48 h. Autres personnes travaillant dans les domaines de la deimmunization de protéines ou de la conception et le développement de vaccins peuvent trouver le protocole à être utile pour faciliter leur propre travail. En particulier, les instructions et le format visuel, étape par étapede Jupiter devrait permettre à d'autres utilisateurs d'établir rapidement et facilement cette méthodologie dans leurs propres laboratoires.

Introduction

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Les protéines sont les plus rapides de croissance classe d'agents thérapeutiques 6, et l'expansion rapide des pipelines biothérapeutiques a attiré l'attention de plus en plus sur les défis liés au développement et à l'utilisation de médicaments protéiques. Une considération unique, provient du fait que, dans un système immunitaire sain et fonctionnel, toutes les protéines extracellulaires sont échantillonnés par des cellules présentatrices d'antigène (CPA). Une fois internalisé par les CPA, une protéine est clivé en petits fragments peptidiques, et des segments immunogènes putatifs sont chargées dans la rainure de classe II protéines du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH-II). Les complexes peptide-CMH II sont alors affichés sur la surface d'APC, et des peptides immunogènes vrais, appelés épitopes de cellules T, former des complexes de récepteurs cellulaires ternaires CMH II-peptide-T avec T CD4 apparentées récepteurs de surface cellulaire 7. Cet événement de reconnaissance moléculaire critique initie une cascade de signalisation complexe, ce qui entraîne l'activation des lymphocytes T, la libération de cytokines, T CD4 maturation des cellules B à médiation cellulaire et, finalement, la production d'anticorps circulants IgG qui se lient à et défrichent la protéine exogène de la délinquance. Ainsi, les protéines immunogènes peuvent être deimmunized par identification d'épitopes de cellules T constitutifs et la mutation de résidus clés responsables de la formation du complexe CMH II. Il convient de noter, toutefois, que des épitopes de lymphocytes T peuvent être nombreuses et largement distribué dans les protéines immunogènes, et la majorité des mutations d'épitopes-suppression sont susceptibles de causer une perte involontaire d'une fonction de la protéine ou la stabilité. Par conséquent, l'ingénierie deimmunized biothérapies peut être un objectif complexe et techniquement difficile, mais il existe plusieurs exemples de succès épitope projets 3,5,8-12 de suppression t. Contrairement à la base de greffage "humanisation", qui est largement limitée aux anticorps thérapeutiques, épitope deletion peut être appliqué à pratiquement n'importe quelle protéine cible indépendamment de la séquence, la structure, la fonction ou la disponibilité de homólogonous échafaudages humains. La première étape de la mise en oeuvre d'une telle approche est l'identification d'épitopes peptidiques clés incorporées à l'intérieur de la séquence de protéine cible.

Haut débit essais biochimiques utilisant des peptides synthétiques et des molécules du CMH II recombinantes humaines peuvent fournir des indications préliminaires rapides dans l'identification de l'épitope et l'atténuation 1,3-5. Ces tests de type ELISA peut être un puissant complément à d'autres conception et de développement d'outils de protéines / vaccins. Par exemple, une approche expérimentale bien établie à la cartographie d'épitopes repose sur le temps, le travail, et de ressources ex vivo des tests de prolifération cellulaire intensifs 15. En bref, la séquence primaire d'une protéine-cible est tout d'abord divisée en un panneau de peptides chevauchants, souvent de 15-mers avec 12 résidus adjacents se chevauchent entre les peptides. Le panneau de peptide est synthétisé chimiquement et l'immunogénicité de chaque peptide est testé dans l'un de plusieurs dosages immunologiques qui emploient différentes bloo périphériquecellules d mononucléaires (PBMC) isolés à partir de donneurs humains 13,14. Pour assurer une plus grande confiance dans les résultats, les peptides sont généralement testés à répétition avec des PBMC à partir de 50 ou plus de donneurs différents. Dans les cas où deimmunization est l'objectif ultime, le travail est encore aggravé par la nécessité de produire des panneaux supplémentaires de peptides mutés et tester les nouveaux panneaux de peptides dans des essais PBMC avant d'introduire des mutations deimmunizing dans la protéine de pleine longueur pour l'analyse fonctionnelle ultérieure 10. Bien que ces tests cellulaires restent l'étalon-or pour évaluer le potentiel immunogène chez des patients humains, l'efficacité d'une telle approche exhaustive pourrait être améliorée par préfiltrage épitopes immunogènes putatifs en utilisant un débit rapide et une grande analyse de liaison du CMH II-peptide.

De même, des essais de liaison peptide-CMH II biochimiques peuvent être combinés avec de prédiction in silico pour accélérer radicalement le processus d'identification de l'épitope.Il existe une variété d'outils de calcul pour la prédiction T épitope; exemples ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, BRA 19, SMM aligner 20, NetMHCIIpan 21 ainsi que des outils propriétaires tels que EpiMatrix par EpiVax 22. De même, les facteurs prédictifs d'épitopes ont récemment été combinées avec d'autres bio-informatique et des outils de modélisation moléculaire pour obtenir des algorithmes de deimmunization de protéines intégrées visant à atténuer le risque que les mutations deimmunizing risque de perturber la structure et la fonction des protéines 23-26. Bien que plusieurs prédicteurs d'épitopes sont avérés être raisonnablement précis 27,28, des résultats de calcul nécessitent invariablement validation expérimentale. Rapide, à haut débit, et rentables méthodes expérimentales sont mieux adaptés comme un filtre préliminaire pour en silico prédictions d'épitopes.

Dans la même veine, les facteurs prédictifs d'épitopes peuvent conduire sélection d'antigène pour vaccinolo inversegie 29,30. Par exemple, les progrès de la bioinformatique ont donné des écrans du génome entier qui identifient rapidement des vaccins candidats sous la forme de protéines entières ou épitopes peptidiques extraits de protéomes pathogènes. Bien que cette technologie permet de redessiner la découverte et le développement de vaccins protecteurs, elle introduit un nouveau défi sous la forme d'irréductiblement grandes listes de candidats vaccins immunogènes. Des dosages de liaison à haut débit peptide-CMH II peuvent guider le choix de l'épitope en quantifiant l'affinité de liaison peptidique et la promiscuité de liaison entre plusieurs allèles du CMH II. Comme avec la protéine deimmunization, ces méthodes expérimentales sont finalement nécessaires pour valider la prédiction de calcul de pistes de vaccins prometteurs.

Ici, un test de liaison peptide-CMH II à l'échelle au format 384 puits est décrit. Le protocole est très parallélisée et réduit les coûts de réactifs de 75% par rapport à précédemment décrit 96 puits formats de plaques 1,3-5. L'utilisation d'un seul liquidationd robot de manipulation, cette méthode permet un chercheur d'analyser facilement environ quatre peptides d'essai en triple exemplaire, dans une gamme de huit concentrations et quatre types d'allèles du CMH II en moins de 48 heures. Cet article décrit l'installation d'une plaque de 384 puits ELISA pour l'analyse de sept peptides expérimentaux contre un allèle du CMH II, mais les calculatrices de feuilles réparties sont fournies comme matériel supplémentaire afin d'étendre facilement l'expérience à un certain nombre de peptides et / ou MHC souhaités molécules II.

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Protocol

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Quatre activités principales comprennent l'analyse de liaison peptide-CMH II: 1-Reliure: peptides essai en concurrence avec des peptides de contrôle marquées pour la liaison phase de solution de protéines CMH II solubles. La liaison est mesurée sur une large plage de concentrations de peptides d'essai. 2-Capture: Après la réaction de liaison se rapproche de l'équilibre, des complexes peptide-CMH II sont saisis et séparés l'un de peptide non lié et de protéines de reconnaissance dépendant de la conformation avec un anticorps immobilisé. 3-détection: Capturé peptide de commande est quantitativement détecté par fluorescence en temps résolu. 4-Analyse: les données spectroscopiques sont traitées, tracées et analysées pour déterminer les propriétés de liaison dose-dépendante de peptide de test et les protéines CMH II.

A différentes étapes de la procédure ci-dessous, l'utilisation d'un robot de manipulation de liquide est recommandée si elle est disponible. En particulier dans un format de 384 puits, distribution automatique et la dilution des liquides minimise l'erreur de l'utilisateur, les résultats en plusvolumes cohérents du puits à bien, et donne plus étroits intervalles de confiance à 95% pour les valeurs de CI50 par rapport aux dosages de 96 et manuel (données non présentées). Si un robot de manipulation de liquide n'est pas disponible, les étapes annotées avec "(la manipulation du liquide robot)" peuvent être faits à la main. De même, si possible, un laveur de plaques automatisé qui est compatible avec le format de 384 puits est recommandée. Ceci normalise efficacement le processus de lavage de plaques. Si un laveur de plaques n'est pas disponible, les étapes annotées avec "(plaque rondelle)" peuvent être faits à la main.

Une. Manteau de la plaque ELISA (Jour 1)

  1. Diluer L243 anticorps actions (0,5 mg / ml) dans tampon borate à une concentration de travail de 10 pg / ml.
    1. Pour revêtir une plaque 384 puits unique, ajouter 200 ul d'anticorps d'actions pour 9,8 ml de tampon borate. (Voir calculatrice de feuille de calcul supplémentaire pour le détartrage de remplacement).
  2. Ajouter 25 ul de la solution d'anticorps L243 à chaque puits d'un 384-well haute contraignant blanc plaque ELISA. (Robot de manipulation de liquide)
  3. Sceller la plaque avec un film de polyester et incuber pendant une nuit à 4 ° C.
    Remarque: chaque plaque ELISA à 384 puits peut accueillir jusqu'à 15 peptides d'essai à huit dilutions pour un allèle du CMH II, ainsi que des contrôles positifs et négatifs. Ce sera finalement céder mesures triple.

2. Assurez-peptide dilutions d'essai (jour 1)

  1. A partir d'un magasin de 10 mM de chaque peptide à tester dans du DMSO, rendre la série de dilution suivante dans Citrate Phosphate Buffer en utilisant des plaques de polypropylene à 384 puits (Tableau 1). (Robot de manipulation de liquide)
    Note: Une assiette pleine de polypropylène 384 puits nécessite trois plaques ELISA séparés. Un tiers d'une plaque de polypropylene, il faudra seulement une plaque ELISA (figure 1).
Nombre de dilution Volume to prendre de dilution avant / stock Volume tampon citrate à ajouter Conc. de dilution Conc. en réaction de liaison Conc. dans neutralisée ELISA
(Ul) (Ul) (PM) (PM) (PM)
1 0,7 35.1 195,531 97,765 48,883
2 14.3 14.3 97,765 48,883 24,441
3 7.1 28,7 19,389 9,695 4.847
4 14.3 14.3 9,695 4.847 2.424
5 7.1 28,7 1.923 0.961 0,481
6 14.3 14.3 0.961 0,481 0,24
7 7.1 28,7 0,191 0,095 0,048
8 14.3 14.3 0,095 0,048 0,024
Retirez et jetez 7.1 pi de solution de peptide à partir du numéro de dilution 8.

Tableau 1. Préparation de l'essai peptide série de dilution.

Figure 1
Figure 1. Carte de plaque d'Peptide Binding Assay. (A) Carte des dilutions de peptide en polypropylène plaques à 384 puits. Chaque plaque de polypropylène peut accueillir trois groupes de 15 peptides dans des réactions de liaison de la concurrence contre un chanter allèle le CMH II. (B) Après que la réaction de liaison se rapproche de l'équilibre, chaque groupe peptidique est transféré, en triple exemplaire, dans une plaque de 384 puits ELISA séparée qui a été pré-revêtue avec un anticorps anti-CMH II.

3. Préparer le CMH II Master Mix (Jour 1)

  1. Faire le tampon de réaction
    1. Ajouter 80 pi de 1 mM PEFA Bloc et 60 mg de octyl-β-D-glucopyranaside à 3920 pi de tampon phosphate citrate. (Voir calculatrice de feuille de calcul supplémentaire pour le détartrage de remplacement).
  2. Diluer les solutions mères CMH II sélectionnés à 101 nM dans du tampon réactionnel à l'aide d'un tube conique de 15 ml (tableau 2).
    Remarque: la concentration du CMH II sera finalement 50 nM dans la réaction de liaison et de 25 nM dans le dosage ELISA neutralisé. Les concentrations d'CMH II varient en fonction du nombre fabricant de beaucoup. (Voir calculatrice de feuille de calcul supplémentaire).
"> CMH II allèle DRB1 *: 1501 MHC II Stock Concentration (mg / ml) 1.3 CMH II Stock Concentration (mM) 20 Vol. II MHC Stock pour ajouter (ml) 14.65 Vol. Reaction Buffer pour ajouter (ml): 2885,35 Concentration CMH II Master Mix (nM) 101

Tableau 2. Préparation du mélange maître CMH II.

4. Préparer les témoins négatifs et positifs (Jour 1)

  1. Ajouter 21,5 pi de tampon phosphate citrate au "contrôle négatif" puits de la plaque 384 puits en polypropylène de l'étape 2.1 (figure 1A).
  2. Ajouter 21,5 pi de tampon phosphate citrate au "contrôle positif" puits de la plaque de polypropylène 384 puits.
    Remarque: la "positioncontrôle tive "sera achevée à la section 5, ci-dessous.
  3. Retirer 49,5 pi du CMH II Master Mix de l'étape 3.2 et pipette dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.
  4. Ajouter 0,5 pi de tampon citrate aux 49,5 pi du CMH II Master Mix de l'étape 4.3.
  5. Ajouter 21,5 ul de la concentration ajustés CMH II Master Mix de l'étape 4.4 de l'"contrôle négatif" puits de la plaque de polypropylène 384 puits (figure 1A).
    Remarque: cet échantillon représente le zéro signal contrôle négatif contenant des protéines du CMH II, peptide N ° de commande, et NON peptide de test.

5. Ajouter le contrôle approprié de peptides à la CMH II Master Mix (Jour 1)

CMH II allèle DRB1 * Peptide biotinylé Contrôle (Résidus) Séquence
0101 Grippe-HA-B (306-318) Biotine (Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amide
0301 Myoglobine (137-148) Biotine (Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401 YAR-B (1-14) Biotine (Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) Biotine (Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 Grippe-HA-B (306-318) La biotine-(Ahx) (Ahx)-amide PRYVKQNTLKLAT
1501 MBP-B (84-102) Biotine (Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* Nous vous conseillons de commander échelle de 10 mg pour l'économie.
Tableau 3. Contrôle peptides pour divers allèles du CMH II. *

  1. Diluer le peptide de contrôle (stocké à 400 uM dans DMSO) 1:20 dans du DMSO frais pour obtenir un stock diluée à 20 pM.
    1. Ajouter 25 ul 400 contrôle uM peptide475 ul de DMSO. Remarque: il s'agit d'un grand excès, mais permet une manipulation précise des solutions de DMSO visqueux.
  2. Diluer ensuite le peptide de contrôle provenant de l'étape 5.1 (20 mM) à 1:100 dans le CMH II Master Mix à l'étape 3.2.
    1. Ajouter 28,8 pi de contrôle peptide dilué dans l'étape 5.2 pour les 2,850.5 pi restants du CMH II Master Mix.
  3. Ajouter 21,5 pi du CMH II Master Mix avec le peptide de commande (étape 5.2) pour le bien de contrôle positif de la plaque de polypropylène 384 puits (étape 4.2) (figure 1A). Remarque: cet échantillon représente le signal haut contrôle positif contenant des protéines du CMH II, un peptide de contrôle, et NON peptide de test.

6. Faire la réaction de liaison (jour 1)

  1. Ajouter le CMH II Master Mix contenant un peptide de contrôle (étape 5.2) de chacune des dilutions de test peptidiques (étape 2.1) à un rapport de 1:1 pour créer la réaction de liaison.
    1. Ajouter 21,5 pi de CMH II Master Mix contenant Concontrôle peptide de l'étape de 5,2 à 21,5 ul de chaque dilution test peptide de l'étape 2.1. (Robot de manipulation de liquide)
  2. Sceller la réaction de liaison avec un film de polyester et incuber 12-24 heures dans un incubateur contrôlé non-CO 2 à 37 ° C sans agitation.

7. Neutraliser et de transfert de la réaction de liaison (Jour 2)

  1. Retirer la plaque de polypropylène 384 puits contenant la réaction de liaison (étape 6.2) de l'incubateur à 37 ° C.
  2. Diluer la réaction 1:01 liaison avec neutralisation tampon. (Robot de manipulation de liquide)
    1. Ajouter 43 ul de tampon de neutralisation de la réaction de liaison à chaque puits.
  3. Retirer la plaque ELISA (étape 1.3) de 4 ° C et laver 3 fois avec 60 ml / puits de PBS-Tween 20 0,05%. (Laveur de plaques)
  4. Transférer 25 pl de chaque réaction de liaison neutralisé de l'étape 7.2 dans des puits en triple de 384 puits de la plaque ELISA revêtue d'anticorps provenant de l'étape 7.3. (Figure 1
  5. Couvrir la plaque ELISA avec un film de polyester et les placer dans un incubateur à 37 ° pendant 2,5 heures ou au réfrigérateur à 4 ° C pendant une nuit.

8. Développement ELISA (Jour 2 ou 3)

  1. Retirer la plaque ELISA de l'étape 7.5, laver 3 fois avec 60 pl / puits de PBS-Tween 0,05%. (Laveur de plaques)
  2. Diluer la solution mère de streptavidine-europium (0,1 mg / ml de streptavidine, 7 Eu 3 + / streptavidine) mille fois dans le tampon de dosage DELFIA.
    1. Pour une plaque de 384 puits, diluer 10 pi de streptavidine-europium dans 10 ml de tampon de dosage.
  3. Ajouter 25 ul de la streptavidine-europium dilué à chaque puits de la plaque de 384 puits ELISA provenant de l'étape 8.1. (Robot de manipulation de liquide)
  4. Couvrir la plaque avec un film de polyester et du lieu dans l'obscurité à température ambiante pendant 1 heure. Remarque: Au cours de l'incubation de 1 h, enlever la solution d'amélioration du réfrigérateur et réserver 10 ml / plaque dans l'obscurité à rotempérature de l'OM.
  5. Après l'incubation de 1 h, laver la plaque 384 puits ELISA de l'étape 8.3 3x avec 60 pl / puits de PBS-Tween 0,05%. (Laveur de plaques)
  6. Ajouter 25 ul de solution de mise en valeur à chaque puits de la plaque 384 puits ELISA de l'étape 8.5. (Robot de manipulation de liquide)
  7. Couvrir la plaque 384 puits ELISA avec un film de polyester et laisser la plaque de s'asseoir dans l'obscurité à température ambiante pendant 10-15 min.
  8. Suite à la min d'incubation de 10-15, lire la fluorescence de la plaque 384 puits ELISA de l'étape 8.7 en utilisant un temps résolu de lecteur fluorescent de la plaque avec des paramètres d'europium (par exemple, début Int: 200, arrêt Int:. 1000, Ex 340 Em . 615, coupure: Aucun, PMT: Auto, Lit / Bien: 50).

9. Analyse des données

  1. Entrer les données dans un format graphique XY avec 3 valeurs répétées dans les colonnes côte à côte (X = test concentration de peptide, Y = mesure de fluorescence).
  2. Connectez-vous transformer les valeurs de X pour toutes les données: X = log (X)
  3. Monter les tra journauxnsformed données avec le modèle d'un site de liaison compétitive pour extraire la valeur de CI50.
  4. Contraindre la valeur inférieure à la valeur négative moyenne de commande.
  5. S'adapter à l'échelle mondiale la valeur supérieure et s'assurer que le paramètre global de l'ajustement est inférieur ou égal au contrôle positif.

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Representative Results

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La séquence peptidique mature de Enterobacter cloacae P99 bêta-lactamase (BLA) (Genbank ID # X07274.1) a été analysée avec ProPred 16 pour les liants peptidiques MHC II putatifs à l'allèle DRB1 * 1501 (tableau 4). ProPred identifié 117 peptides nonamères avec un résidu d'ancrage P1 obligatoire (soit un M, L, I, V, F, Y ou W à la position 1, qui est nécessaire pour CMH II de liaison 31). À un seuil de 5%, que des peptides avec des scores supérieurs ou égaux à 2,6 sont susceptibles liants. Ainsi, au seuil de 5%, seuls les 11 premiers peptides sont prévus pour lier CMH II DRB1 * 1501.

Tableau 4
Tableau 4. Haut-notation ProPred prédictions pour les peptides BLA et CMH II allèle DRB1 * 1501.

Un panel représentatif de épitope prédites a été sélectionné pour l'analyse de notre essai de liaison du CMH II (tableau 4, les entrées en gras). Fragments peptidiques BLA de quinze résidus ont été synthétisés chimiquement tels que épitopes nonamère putatif CMH II ont été intégrés dans les fragments de protéines synthétiques. Alors que le sillon de liaison du CMH II s'accommode seulement neuf acides aminés, les preuves suggèrent que les séquences d'accompagnement peuvent influencer les interactions peptide-CMH II, et des peptides synthétiques de 15-20 résidus sont donc couramment utilisé 15. Pour représenter la complexité du chevauchement des épitopes qui peuvent se produire dans des fragments de protéines biologiquement transformés, nous avons testé des séquences synthétiques qui contiennent (i) des liants simples prévus, (ii) nonbinders prévus simples, (iii) multiple prédit liants, (iv) multiple prédit nonbinders, ou (v) un mélange de liants et nonbinders prédits (Tableaux 4 et 5).

Tableau 5 Tableau 5. Liste des peptides synthétisés chimiquement.

La capacité de ces peptides synthétiques de rivaliser avec le peptide biotinylé de contrôle MBP-B (tableau 3) pour la liaison au CMH II DRB1 * 1501 a été analysée comme décrit dans le protocole ci-dessus. Courbes de liaison compétitive pour les peptides synthétiques sont présentés dans la figure 2. IC 50 valeurs ont été calculées en ajustant les données log-transformées en utilisant la fonction d'un site de liaison compétitive, non linéaire en forme de prisme (tableau 6). Comme on le voit sur ​​la figure 2, les peptides partitionner naturellement en trois groupes: les solides des liants avec des CI50 <1 pM (peptides 2 et 10); liants modérés avec 1 ≤ uM CI50 <100 pM (peptides 4, 9, 11 et 24 ); liants faibles avec IC 50 ≥ 100 μ; M (peptide 31).

Figure 2
Figure 2. Courbe de liaison compétitive de BLA peptides CMH II pour l'allèle DRB1 * 1501. Liants serrées sont en forme avec des lignes orange, reliures modérés lignes vertes, et la faiblesse de liant une ligne marron.

Peptide Rang IC50 (uM) IC à 95% IC 50 (M) Qualité de l'ajustement (R 2)
2 0,1199 De 0,09404 à 0,1529 0,98
4 15.1 De 11,83 à 19,28 0,87
9 17.11 De 13,39 à 21,88 0,81
10 0,2743 0,2149 à 0,3502 0,98
11 10,49 8,252 à 13,34 0,98
24 4.787 3,769 à 6,082 0,96
31 190,6 137,7 à 263,9 0,80

Tableau 6. Calculées IC 50 des fragments peptidiques BLA pour DRB1 * 1501.

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Discussion

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Biotherapeutics se sont imposés comme une pierre angulaire de la médecine moderne, ce qui représente quatre des cinq premiers médicaments les plus vendus en 2012 32. Le secteur de la biopharmaceutique a connu une croissance soutenue depuis plusieurs années 6, et le développement continu de nouveaux agents ainsi que l'émergence des biosimilaires a élargi pipelines biopharmaceutiques. Pour l'avenir, l'évaluation et l'atténuation de l'immunogénicité des protéines thérapeutiques deviendra une partie intégrante du développement de biothérapeutique au stade précoce. Pour faciliter ce processus, les biotechnologistes peuvent se des méthodes de calcul pour la prédiction d'épitope 16-22 ainsi que des algorithmes de conception de protéines intégrées qui visent à réduire l'immunogénicité tout en conservant la fonction 3,23-26 prévaloir. De même, la conception et le développement de vaccins peuvent capitaliser sur la puissance des algorithmes prédictifs 4, et la maturation continue de la vaccinologie inverse devrait se produire de protectionvaccins pour un large éventail d'agents infectieux qui ont échappé efforts précédents 33. Bien que ces outils de calcul ont la capacité d'accélérer radicalement les processus de développement de médicaments et de vaccins, les résultats des prédictions en silico doivent finalement être filtrée davantage afin d'identifier un certain nombre de candidats dociles les plus performants. Les progrès récents en analyse quantitative peptide-CMH II ont inclus le développement de génie des systèmes d'affichage de surface de cellule de levure 34 et microbilles à base d'oxygène luminescent Manche immunoessais 35, mais in vitro ELISA essais de type restent le mode de quantification de la liaison entre le CMH II spécifique et paires de peptides. Ici, un procédé à l'échelle du microlitre pour l'analyse rapide et efficace, quantitative, et le coût du peptide épitope de liaison à des molécules du CMH II immunitaires humains est décrit. Ces procédés peuvent être utilisés comme outil expérimental un stade précoce du processus d'entonnoir.

Pour l'unité centralerposes de démonstration, dont la séquence a été analysée pour BLA peptides putatifs de liaison du CMH II en utilisant le serveur Web ProPred. Sept de ces peptides ont été synthétisés chimiquement et testées expérimentalement pour la liaison à soluble humaine CMH II DRB1 * 1501. Semblable à d'autres analyses de la précision de prédiction 28, la prédiction de liaison ProPred corrélation assez bien avec mesurée expérimentalement IC 50 pour le DRB1 * 1501 CMH II allèle. Il est également important de noter que les résultats sont sensibles aux variations de concentrations et les soins devraient être prises pour assurer une dilution exacte de CMH, les peptides de contrôle, et des peptides de test. De même, une limitation de cette méthode est que les valeurs de CI50 sont liés à des concentrations de peptides du CMH et de contrôle. Parmi le peptide ensemble de test BLA, le mieux classé ProPred épitope présenté la plus forte liaison aux recombinant DRB1 * 1501. De même, tous les autres liants d'épitopes exposés prévus modérée à affinités élevées CMH II. Comme prévu,peptides synthétiques contenant chevauchent épitopes de liaison prédites et des épitopes non contraignants ont été trouvés pour lier CMH II dans tous les cas. Peptide 31, qui a duré deux du rang le plus bas épitopes prédits, s'est avéré être le plus faible liant CMH II. Peptide 24, cependant, a été trouvé à se lier CMH II avec une affinité modérée en dépit du fait que son épitope constituant seulement bien classés (épitope 24) n'était pas un liant prévu au seuil de 5%. Fait intéressant, 24 épitope a été identifié dans une étude précédente visant à deimmunizing BLA 10. Dans ces expériences, le peptide synthétique 24 s'est révélée être hautement immunogène dans des dosages de PBMC humaines. Ainsi, dans ce seul cas, notre analyse de liaison du CMH II s'est avéré être un facteur prédictif de l'immunogénicité tout ProPred fait pas. Dans l'ensemble les résultats démontrent l'utilité des prévisions de calcul pour guider les chercheurs vers des épitopes immunogènes susceptibles, mais ils soulignent également l'importance de haut débit des méthodes expérimentales comme une partie intégrante dele processus de conception de la protéine / du vaccin.

Fait important, cette conception de 384 puits expérimental est hautement parallélisée et permet l'analyse rigoureuse d'un maximum de 15 peptides et un allèle du CMH II à 384 puits par plaque ELISA. L'utilisation d'un seul robot de manipulation de liquide, cette méthode permet un chercheur à analyser quatre-vingt dix peptides d'essai contre quatre types d'allèles du CMH II dans moins de 48 heures. Cette conception inclut huit concentrations peptidiques d'essai différents et mesure de triple à chaque concentration. Par conséquent, l'utilisateur est assuré résultats quantitatifs reproductibles et fiables. Autres personnes travaillant dans les domaines de protéines thérapeutiques ou de la conception et le développement de vaccins peuvent trouver ce protocole à être utile pour faciliter leur travail dans deimmunization de protéine ou d'analyse de l'immunogénicité.

Citrate de tampon phosphate (mM d'acide citrique 22,2, 55,6 mM Dibasique Na 2 HPO 4, pH 5,4)
222 ml 0,1 M d'acide citrique
278 ml 0,2 M dibasique Na 2 HPO 4
500 ml MilliQ H 2 O
Mélanger l'acide citrique, le phosphate de sodium et 450 ml de H 2 O. MilliQ Ajuster le pH à 5,4 et qs à 1 L.
Cette solution est stable à la température ambiante.
Binding Buffer de réaction
Citrate de tampon phosphate, pH 5,4 avec 2% v / v à 1 mM Pefabloc
1,5% p / v d'octyl-β-D-glucopyranaside
Utiliser tout de suite.
1 mM Pefabloc
1 ml MilliQ H 2 O
25 mg Pefabloc SC (poudre)
Faire aliquotes et conserver à -20 ˚ C.
Tampon borate formule (tétraborate de sodium 12,5 mMdécahydraté, pH 8,2)
Tétraborate 1,19 g de sodium décahydraté (Sigma)
250 ml MilliQ H 2 O
Dissoudre le tétraborate de sodium décahydraté dans 225 ml d'eau MilliQ H 2 O. Ajuster le pH à 8,2 et qs pour 250 ml.
Cette solution est stable à la température ambiante.
PBS-Tween (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, NaCl 136,9 mM, 8,9 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,05% de Tween, pH 7,4)
4,5 L MilliQ H 2 O 500 ml 10x PBS (DPBS) de Dulbecco
2,5 ml de Tween 20
Cette solution est stable à la température ambiante.
Tampon de neutralisation (HCl Trizma 50 mM, pH 8,0)
475 ml MilliQ H 2 O
25 ml de HCl 1 M Trizma
Mélanger et ajuster le pH à 8,0
Cette solution est stable à 4 ° C.

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Disclosures

Leonard Moise est employé par et détient des options d'achat d'actions dans EpiVax, Inc., une société privée de biotechnologie située à Providence, RI. Le travail présenté dans ce rapport de recherche est libre de tout préjugé qui pourrait être associé avec les objectifs commerciaux de l'entreprise.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par des subventions du NIH R01-GM-098 977 et R21-AI-098 122 à CBK et KEG. RSS a été financé en partie par une fondation Luce Bourse et en partie par une bourse du Programme d'innovation de l'École Thayer Thayer de génie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
Un essai de liaison à haut débit CMH II pour l&#39;analyse quantitative du peptide épitopes
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Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

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