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Biology

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

doi: 10.3791/51308 Published: March 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

Abstract

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 또는 디자인 1,2를 제공 할 수 있습니다. 여기, 펩타이드 MHC II 결합 분석은 384도 형식으로 조정됩니다. 축소 프로토콜 75 %의 시약 비용을 절감하고 이전에 96 - 웰 프로토콜 1,3-5 기술보다 더 높은 처리량입니다. 특히, 실험 설계는 384도 ELISA 플레이트 당 하나의 MHC II 대립 유전자에 대해 최대 15 펩티드의 강력하고 재현성있는 분석을 허용합니다. 하나의 액체 처리 로봇을 사용하여,이 방법은 하나의 연구자 미만 48 시간에서 여덟 농도와 네 MHC II 대립 유전자 유형의 범위 세중 약 구십 테스트 펩티드를 분석 할 수 있습니다. 단백질 deimmunization 또는 백신의 설계 및 개발 분야에서 일하는 다른 프로토콜이 자신의 작업을 촉진하는데 유용하게 찾을 수 있습니다. 특히, 단계별 지침과 시각적 형식주피터의 다른 사용자가 빠르고 쉽게 자신의 실험실에서이 방법을 확립 할 수 있도록해야한다.

Introduction

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단백질 치료제 6의 가장 빠르게 성장하고있는 클래스이며, biotherapeutic 파이프 라인의 급속한 확장은 단백질 의약품의 개발 및 사용과 관련된 문제에 대한 증가하는 관심을 집중하고있다. 하나의 고유 한 고려 사항은 건강 기능 면역 시스템의 모든 세포 단백질이 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 샘플링되고 있다는 사실에서 유래한다. 일단 장갑차에 의해 내면화, 단백질은 작은 펩타이드 조각으로 절단하고, 추정 면역 원성 세그먼트 클래스 II 주요 조직 적합성 복합체 단백질 (MHC II)의 홈에로드됩니다. 펩티드-MHC II 복합체 후 APC 표면 상에 표시하고, 진정한 면역 원성 펩티드는, 동족 CD4 T 세포 표면 수용체 7과의 삼원 MHC II-펩티드-T 세포 수용체 복합체를 형성하고, T 세포 에피토프를 지칭한다. 이 중요한 분자 인식 이벤트는 T 세포 활성화에 결과 복잡한 신호 폭포, 사이토 카인의 방출을 시작합니다의, CD4 T 세포 매개 성 B 세포의 성숙, 그리고 바인딩과 잘못된 외래 단백질을 취소의 IgG 항체를 순환 궁극적으로 생산. 따라서, 면역 원성 단백질을 구성하는 T 세포의 항원을 확인하고 MHC II 복합체 형성에 대한 책임이 키 잔류 돌연변이에 의해 deimmunized 될 수 있습니다. 이는 T 세포 에피토프가 많고 광범위 면역 원성 단백질에 걸쳐 분산 될 수 있다는 것은 주목 부담 및 에피토프 삭제 돌연변이의 대부분은 단백질 기능 또는 안정성의 부주의 손실이 발생할 가능성이있다. 따라서 엔지니어링 biotherapies가 복잡하고 기술적으로 도전적인 목표 일 수있다 deimmunized하지만, 성공적인 T 세포 에피토프 삭제 프로젝트 3,5,8-12의 몇 가지 예는 존재한다. 큰폭 항체 치료제에 한정되는 그라프 기반 "인간화"달리 에피토프 삭제 불문 서열, 구조, 기능을 본질적으로 임의의 단백질 표적에 적용될 수 있고, 또는 homologo의 가용성우리 인간의 골격. 이러한 접근 방식을 구현하는 첫 번째 단계는 표적 단백질 서열 내에 삽입 키 펩티드 에피토프의 확인이다.

합성 펩티드 및 재조합 인간 MHC II 분자를 사용하여 높은 처리량 생화학 적 분석은 에피토프 식별 및 완화 1,3-5에 빠른 예비 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 ELISA 유형 분석은 다른 단백질 / 백신 설계와 개발 도구의 강력한 보완 할 수 있습니다. 예를 들어, 에피토프 매핑 한 잘 설립 된 실험 방법은 시간, 노동에 의존하고 집중적 인 생체 세포 증식 시험 법 (15) 자원. 요약하면, 표적 단백질의 기본 시퀀스가​​ 제 겹치는 펩타이드의 패널로 분할되고, 12 잔기 종종 15 머는 인접한 펩티드에 대한 중복. 펩티드 패널은 화학적으로 합성되는 각 펩티드의 면역 원성은 주연 bloo 사용해 여러 면역 분석법 중 하나에서 시험된다인간 공여자로부터 단리 13,14 D 단핵 세포 (PBMC). 결과에 더 큰 신뢰를 제공하기 위해, 펩티드는 일반적으로 50 개 이상의 다른 기증자로부터 PBMC와 복제에 시험한다. deimmunization 궁극적 인 목표입니다 경우, 작업은 변이 된 펩티드의 추가 패널을 생산하고 이후의 기능 분석 (10)의 전체 길이의 단백질로 어떤 deimmunizing 돌연변이를 도입하기 전에 PBMC의 분석에 새로운 펩타이드 패널을 테스트하기 위해 필요에 의해 더욱 악화된다. 이러한 세포의 분석은 인간의 환자에서 면역 원성 가능성을 평가하기위한 황금 표준 남아 있지만, 이러한 철저한 접근 방식의 효율성은 신속하고 높은 처리량 MHC II-펩타이드 결합 분석을 이용하여 추정 면역 원성 항원을 사전 필터링에 의해 개선 될 수 있습니다.

마찬가지로, 생화학 펩티드-MHC II 결합 분석은 라디칼 에피토프 식별 프로세스를 가속화하기 위해 실리 방법의 예측과 조합 될 수있다.T 세포 에피토프 예측을위한 전산 다양한 도구가 존재, 예 ProPred (16)를 포함, MHCPred 17 SVRMHC 18, ARB 19, 20 SMM-정렬, NetMHCIIpan 21뿐만 아니라 EpiVax (22)에 의해 같은 EpiMatrix 같은 독점 도구를 제공합니다. 마찬가지로, 에피토프의 예측은 최근에 다른 생물 정보학 및 deimmunizing 돌연변이가 단백질의 구조와 기능 23-26를 중단시킬 위험을 완화하도록 설계된 통합 단백질 deimmunization 알고리즘을 생성하는 분자 모델링 도구와 결합되었습니다. 여러 가지 에피토프 예측이 합리적으로 정확한 27,28 것으로 입증되었지만, 계산 결과는 변함없이 실험적인 검증을 필요로한다. 빠른, 높은 처리량 및 비용 효과적인 실험 방법은 실리 에피토프 예측에 대한 예비 필터로 가장 적합합니다.

비슷한 맥락에서, 에피토프 예측 역 vaccinolo에 대한 항원의 선택을 구동 할 수있다GY (29, 30). 예를 들어, 생물 정보학의 발전은 빠르게 병원체 프로테옴에서 추출한 전체 단백질이나 펩티드 에피토프의 형태로 백신 후보를 식별하는 전체 게놈 화면을 수득했다. 이 가능하게 기술 보호 백신의 발견과 개발을 재편하는 동안, 그것은 면역 백신 후보의 intractably 큰 목록의 형태로 새로운 도전을 소개합니다. 높은 처리량 펩티드-MHC II 결합 분석은 펩타이드 결합 친화도를 정량화하고 여러 MHC II 대립 유전자 사이에 성행위를 결합하여 항원의 선택을 안내 할 수 있습니다. 단백질 deimmunization와 마찬가지로, 이러한 실험 방법은 궁극적으로 유망한 백신 리드의 계산 예측을 검증해야합니다.

여기에, 384도 형식으로 축소 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 프로토콜은 고도로 병렬화 이전에 96 - 웰 플레이트 형식 1,3-5 설명에 비해 최대 75 %에 의해 시약 비용을 절감 할 수 있습니다. 단일 LIQUI 사용D 로봇을 처리,이 방법은 하나의 연구자가 쉽게 미만 48 시간에서 여덟 농도와 네 MHC II 대립 유전자 유형의 범위 세중 약 구십 테스트 펩티드를 분석 할 수 있습니다. 이 문서는 하나의 MHC II 대립 유전자에 대한 일곱 실험 펩타이드의 분석을위한 하나의 384 - 웰 ELISA 플레이트의 설치를 설명하지만 쉽게 원하는 펩타이드 및 / 또는 MHC의 숫자로 실험을 확장 할 수 있도록 확산 시트 계산기는 보충 자료로 제공됩니다 II 분자.

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Protocol

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네 개의 주요 활동은 펩티드-MHC II 결합 분석을 포함한다 : 1 바인딩 : 시험 펩티드 용액 상 용해 MHC II 단백질의 결합을 표지 제어 펩티드와 경쟁. 바인딩은 테스트 펩티드 농도의 넓은 범위에 걸쳐 측정된다. 2 - 화면 캡쳐 : 바인딩 반응이 평형에 도달 한 후, 펩타이드 MHC II 단지가 캡처 및 고정 된 항체와 형태에 의존하는 인식하여 결합되지 않은 펩타이드와 단백질에서 분리된다. 3 탐지 : 캡처 제어 펩타이드 정량적 시간 분해 형광을 이용하여 검출한다. 4 - 분석 : 분광 데이터를 처리 플롯 및 테스트 펩타이드와 MHC II 단백질의 농도 의존적​​ 결합 특성을 확인하기 위해 분석된다.

가능한 경우 다음 절차의 여러 단계에서, 액체 처리 로봇의 사용을 권장합니다. 특히 384도 형식으로 자동 분배 및 액체의 희석 더에 사용자 오류, 결과를 최소화일관된 잘 행 웰 볼륨 및 수동 96 - 웰 분석 (데이터 미도시)에 비해 IC 50 값 좁아 95 % 신뢰 구간을 산출한다. 액체 처리 로봇을 사용할 수없는 경우, "(액체 처리 로봇)"주석이 단계를 수동으로 수행 할 수 있습니다. 가능하면 마찬가지로, 384 - 웰 형식과 호환되는 자동화 된 와셔를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 효과적으로 플레이트 세척 공정을 표준화. 접시 세척기를 사용할 수없는 경우, "(와셔)"주석이 단계를 수동으로 수행 할 수 있습니다.

1. 코트 ELISA 플레이트 (1 일)

  1. 10 ㎍ / ㎖의의 작업 농도로 붕산 버퍼에있는 L243 항체 주식 (0.5 ㎎ / ㎖)을 희석.
    1. 코트에 하나의 384 - 웰 플레이트, 붕산염 완충액 9.8 ml로 주식 항체의 200 μl를 추가합니다. (대체 스케일링에 대한 보충 스프레드 시트 계산기를 참조하십시오.)
  2. 384 (W)의 각 웰에 L243 항체 용액 25 μl를 추가합니다엘 흰색 ELISA 플레이트 높은 결합. (액체 처리 로봇)
  3. 폴리 에스테르 필름과 플레이트를 밀봉하고 4 ℃에서 하룻밤 배양
    참고 : 각 384 잘 ELISA 판은 15 테스트 한 MHC II 대립 유전자 8 개의 희석에 펩티드뿐만 아니라 긍정적이고 부정적인 컨트롤까지 수용 할 수 있습니다. 이것은 궁극적 중으로 측정치를 산출 할 것이다.

2. 테스트 펩타이드 희석 (1 일)을 확인

  1. DMSO의 각 테스트 펩티드의 10 mM의 스톡부터는 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (표 1)를 사용 구연산염 포스페이트 완충액에서 다음 일련의 희석을 만든다. (액체 처리 로봇)
    참고 : 전체 384 웰 폴리 프로필렌 플레이트는 별도의 세 가지 ELISA 플레이트가 필요합니다. 폴리 프로필렌 플레이트의 3 분의 1은 하나의 ELISA 플레이트 (그림 1)이 필요합니다.
희석 수 볼륨 t오 전 희석 / 재고 걸릴 추가 볼륨 구연산 버퍼 진한. 희석의 진한. 바인딩 반응 진한. 중화 ELISA에
(μL) (μL) (μM) (μM) (μM)
1 0.7 35.1 195.531 97.765 48.883
2 14.3 14.3 97.765 48.883 24.441
3 7.1 28.7 19.389 9.695 4.847
4 14.3 14.3 9.695 4.847 2.424
5 7.1 28.7 1.923 0.961 0.481
6 14.3 14.3 0.961 0.481 0.24
7 7.1 28.7 0.191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
제거하고 희석 수 8 펩타이드 솔루션의 7.1 μl를 폐기합니다.

테스트 펩티드 희석 시리즈의 표 1. 제조.

그림 1
그림 1. 분석을 바인딩 펩타이드의지도를 접시. 폴리 프로필렌 384 - 웰 플레이트에서 펩타이드 희석 (A)지도. 각각의 폴리 프로필렌 판은 노래에 대한 경쟁 결합 반응에 15 펩티드의 세 그룹을 수용 할 수 르 MHC II 대립 유전자. 결합 반응이 평형에 접근 한 후 (B), 각 펩티드 기는 안티 MHC II 항체로 미리 코팅 된 별도의 384 - 웰 ELISA 플레이트에, 중으로 전사된다.

3. MHC II 마스터 믹스 (1 일)를 준비

  1. 반응 완충액 만들기
    1. 구연산 인산 버퍼의 3,920 μL에 1 ㎜ Pefa 공산권의 80 μL 및 옥틸-β-D-glucopyranaside 60 밀리그램을 추가합니다. (대체 스케일링에 대한 보충 스프레드 시트 계산기를 참조하십시오.)
  2. 15 ML 원뿔 튜브 (표 2)를 사용하여 반응 버퍼에서 101 nm의 선택 MHC II의 주식 솔루션을 희석.
    참고 : MHC II 농도는 궁극적으로 중화 ELISA 분석에서 결합 반응, 25 nm의 50 nm의 수 있습니다. MHC II의 주식 농도는 제조 로트 번호에 따라 달라집니다. (보충 스프레드 시트 계산기를 참조하십시오.)
"> MHC II 대립 유전자 DRB1 *이 : 1501 MHC II 스톡 농도 (㎎ / ㎖) 1.3 MHC II 스톡 농도 (MM) (20) 권. MHC II 재고 추가하는 (ML) 14.65 권. 반응 버퍼에 추가하는 (ML) : 2885.35 MHC II 마스터 믹스 농도 (NM) 101

MHC II의 마스터 믹스의 표 2. 준비.

4. 부정과 긍정적 인 컨트롤 (1 일)를 준비

  1. 2.1 단계에서 384 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (그림 1A)의 "대조군"잘에 구연산 인산 버퍼의 21.5 μl를 추가합니다.
  2. 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트의 "긍정적 인 제어"잘에 구연산 인산 버퍼의 21.5 μl를 추가합니다.
    참고 : "포지를TIVE 컨트롤 "아래 섹션 5에 완료됩니다.
  3. 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 단계 3.2 피펫에서 MHC II 마스터 믹스의 49.5 μl를 제거합니다.
  4. 4.3 단계에서 MHC II 마스터 믹스의 49.5 μL에 구연산 버퍼의 0.5 μl를 추가합니다.
  5. 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트의 "대조군"잘 (그림 1A)에 단계 4.4에서 MHC II 마스터 믹스를 조정 농도의 21.5 μl를 추가합니다.
    참고 :이 샘플은 MHC II 단백질, NO 제어 펩티드, 및 NO 테스트 펩타이드를 포함하는 제로 신호 음의 컨트롤을 나타냅니다.

5. MHC II 마스터 믹스에 적절한 제어 펩타이드 (1 일)를 추가

MHC II 대립 유전자 DRB1 * 바이오틴 제어 펩타이드 (잔류) 순서
0101 독감 HA-B (306-318) 비오틴 (AHX) (AHX) PRYVKQNTLKLAT - 아미드
0301 미오글로빈 (137-148) 비오틴 (AHX) - (AHX) LFRKDIAAKYKE-OH
0401 YAR-B (1-14) 비오틴 (AHX) (AHX) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) 비오틴 (AHX) (AHX) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 독감 HA-B (306-318) 비오틴 (AHX) (AHX) PRYVKQNTLKLAT - 아미드
1501 MBP-B (84-102) 비오틴 (AHX) (AHX) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* 우리는 경제를 위해 10 ㎎의 규모를 주문하는 것이 좋습니다.
표 3. 다양한 MHC II 대립 유전자에 대한 컨트롤 펩티드. *

  1. 20 μM에 희석 주식을 산출하는 신선한 DMSO에 (DMSO 400 μM에 저장) 제어 펩타이드 1:20 희석.
    1. 25 ㎕를 400 μM 제어 펩타이드에 추가475 μL의 DMSO. 주 :이 과량이지만 점성 DMSO 용액의 정확한 핸들링을 허용한다.
  2. 또한 단계 3.2에서 MHC II 마스터 믹스로 단계 5.1 (20 ㎜) 1:100에서 제어 펩타이드를 희석.
    1. MHC II 마스터 믹스의 나머지 2,850.5 μL에 단계 5.2에 희석 제어 펩타이드의 28.8 μl를 추가합니다.
  3. 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (4.2 단계) (그림 1A)의 양의 조절도에 제어 펩타이드 (단계 5.2)와 MHC II 마스터 믹스의 21.5 μl를 추가합니다. 주 :이 표본은 MHC II 단백질, 조절 펩티드, 및 NO 테스트 펩티드를 함유하는 높은 신호 양성 대조군을 나타낸다.

6. 바인딩 반응 (1 일)을 확인

  1. 바인딩 반응을 생성하기 위해 1:1 비율로 시험 펩타이드 희석 (2.1 단계)에 각각 제어 펩타이드 (단계 5.2)를 포함하는 MHC II 마스터 믹스를 추가합니다.
    1. 콘을 포함하는 MHC II 마스터 믹스의 21.5 μl를 추가2.1 단계에서 각각의 테스트 펩타이드 희석의 21.5 μL로 단계 5.2에서 TROL 펩타이드. (액체 처리 로봇)
  2. 폴리 에스테르 필름과 바인딩 반응을 밀봉하고 흔들림없이 37 ° C에서 비-CO 2 제어 배양기에서 12 ~ 24 시간을 배양한다.

7. 중화 바인딩 반응 (2 일)을 전송

  1. 37 ° C 배양기에서 바인딩 반응 (단계 6.2)를 포함 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트를 제거합니다.
  2. 중화 버퍼와 바인딩 반응 1:1 희석. (액체 처리 로봇)
    1. 물론 각 바인딩 반응에 중화 버퍼의 43 μl를 추가합니다.
  3. 4 ° C에서 ELISA 플레이트 (단계 1.3)를 제거하고 PBS-0.05 % 트윈 20 60 ㎖ / 잘으로 배를 세척한다. (와셔)
  4. 이전 단계 7.3에서 항체 코팅 된 384 웰 ELISA 플레이트의 세중의 우물에 단계 7.2에서 각 중화 바인딩 반응 25 μL. (그림 1
  5. 밤새 2.5 시간 동안 37 ° C의 배양기 또는 4 ° C 냉장고에있는 폴리 에스테르 필름 및 장소 ELISA 플레이트를 커버.

8. ELISA 개발 (2 일 또는 3)

  1. 단계 7.5에서 ELISA 플레이트를 제거, 60 μL / 잘 PBS-0.05 % 트윈로 3 회 세척한다. (와셔)
  2. DELFIA 분석 버퍼에 스트렙 타비 딘 - 유로퓸 원액 (0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙 타비 딘, 7 Eu를 3 + / 스트렙 타비 딘) 1,000 배 희석.
    1. 하나의 384 - 웰 플레이트를 들어, 10 ㎖ 분석 버퍼에 10 ㎕의 스트렙 타비 딘 - 유로퓸을 희석.
  3. 단계 8.1에서 384도 ELISA 플레이트의 각 웰에 희석 스트렙 타비 딘 - 유로퓸의 25 μl를 추가합니다. (액체 처리 로봇)
  4. 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서, 폴리 에스테르 필름 및 장소 플레이트 커버. 참고 : 1 시간 배양 동안 냉장고에서 향상 솔루션을 제거하고 RO의 어둠 속에서 10 ㎖ / 판 따로톰 온도.
  5. 1 시간 배양 한 후, 60 μL / 잘 PBS-0.05 % 트윈으로 단계 8.3 배에서 384도 ELISA 플레이트를 세척한다. (와셔)
  6. 단계 8.5에서 384도 ELISA 플레이트의 각 웰에 향상 솔루션의 25 μl를 추가합니다. (액체 처리 로봇)
  7. 폴리 에스테르 필름 : 384 - 웰 ELISA 플레이트를 커버 플레이트는 15 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 앉을 수있다.
  8. (200), 정지이자 :. 1,000 예 (340), 엠 15 분 배양 한 다음, 한 번 예를 들어, 유로퓸 설정으로 해결 형광 플레이트 리더 (시작이자를 사용하여 단계 8.7에서 384도 ELISA 플레이트의 형광을 읽고 . 615, 차단 : 없음, PMT : 자동 / 잘 읽습니다 : 50).

9. 데이터 분석

  1. 나란히 열에서 3 복제 값 (, Y = 형광 측정 X = 테스트 펩타이드 농도)와 XY 형식의 그래프에 데이터를 입력합니다.
  2. 모든 데이터의 X 값을 변환 로그 : X = 로그 (X)
  3. 로그 TRA를 장착IC 50 값을 추출 할 수있는 하나의 현장 경쟁력있는 결합 모델과 데이터를 nsformed.
  4. 음성 대조군의 평균 값에 하한값을 제한.
  5. 세계적으로 최고 값에 맞게 글로벌 맞는 매개 변수 아래 또는 양성 대조군 같다는 것을 확실히한다.

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Representative Results

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엔테로 박터 클로 아카 P99 베타 - 락타 마제 (BLA) (Genbank에 ID 번호의 X07274.1)의 성숙 펩타이드 서열은 MHC II 대립 유전자 DRB1 * 1501 (표 4)으로 추정 펩타이드 바인더 ProPred (16)를 분석 하였다. ProPred은 필수 P1 앵커 잔류 물 117 nonamer 펩티드를 확인 (즉, M, L, I, V, F, Y, 31 바인딩 MHC II에 필요한 위치 1에서 W). 5 %의 임계 값으로 만보다 큰 득점 2.6 같은지 가능성 바인더와 펩티드이다. 따라서, 5 %의 문턱에서, 상위 11 펩티드 * 1501 MHC II의 DRB1을 결합 할 것으로 예상된다.

표 4
표 4. 높은 점수는 BLA 펩티드와 * 1501 MHC II 대립 유전자 DRB1에 대한 예측을 ProPred.

예측 epitop의 대표 패널ES는 우리의 MHC II 결합 분석 (표 4, 굵은 개 항목)에 분석을 위해 선정되었다. 십오 잔기의 BLA 펩티드 단편은 화학적으로 추정 nonamer MHC II 에피토프가 합성 된 단백질 단편 내에 삽입 하였다되도록 합성 하였다. MHC II 바인딩 홈 자체는 겨우 아홉 아미노산을 수용 할 수 있지만, 증거가 측면에서는 순서는 펩타이드 MHC II의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있다고 제안하고, 15 ~ 20 잔기의 합성 펩티드 따라서 일반적으로 15을 사용합니다. 생물학적으로 처리 된 단백질 조각에 발생할 수있는 항원을 중복의 복잡성을 표현하기 위해, 우리는, (I) 단일 예측 바인더, (ⅱ) 단일 예측 nonbinders, (III) 배수 바인더를 예측, (IV) 배수 nonbinders 예측을 포함 합성 시퀀스를 테스트 또는 (v) 결합제 및 예측 nonbinders (표 45)의 혼합물.

표 5 화학적으로 합성 펩티드의 표 5. 목록.

상기 프로토콜에 설명 된 MHC II DRB1 * 1501에 대한 결합을 위해 비 오티 닐화 MBP-B 제어 펩티드 (표 3)와 경쟁하는이 합성 펩타이드의 능력을 분석 하였다. 합성 펩타이드에 대한 경쟁 결합 곡선을 그림 2에 나타내었다. IC 50 값은 프리즘의 한 사이트 경쟁적 결합, 적당한 비선형 함수 (표 6)를 사용하여 로그 변환 된 데이터를 맞춤으로써 계산 하였다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 펩티드는 자연적으로 세 그룹으로 분할 : IC 50 강한 결합제를 <1 μM (펩티드 2 및 10), 1 μM 함께 적당한 바인더 IC 50 <100 μM (펩티드 4, 9, 11, 및 24 ≤ ) IC 50 ≥ 100 μ 약한 바인더, M (펩타이드 31).

그림 2
그림 2. MHC II 대립 유전자 DRB1에 대한 BLA 펩타이드의 경쟁 바인딩 곡선 * 1501. 단단한 바인더 오렌지 라인, 적당한 바인더 녹색 선하고 약한 바인더 적갈색 선이 적합합니다.

펩타이드 순위 IC 50 (μM) IC (50)에 대한 95 % 신뢰 구간 (μM) 적합 품질 (R 2)
2 0.1199 0.09404-0.1529 0.98
4 15.1 11.83-19.28 0.87
9 17.11 13.39-21.88 0.81
10 0.2743 0.2149-0.3502 0.98
11 10.49 8.252-13.34 0.98
(24) 4.787 3.769-6.082 0.96
31 190.6 137.7-263.9 0.80

표 6. DRB1 * 1501 BLA 펩티드 조각 (50) 값은 IC 계산.

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Discussion

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Biotherapeutics에 2012 년 32에서 상위 5 개 판매 약의 네를 대표하는 현대 의학의 초석로 자신을 설립했다. 바이오 의약 부문은 몇 년 6 지속 성장을 보여 왔으며, 새로운 에이전트의 지속적인 발전뿐만 아니라 바이오시 밀러의 등장은 바이오 의약품 파이프 라인을 확장했다. , 미래를 찾고 평가하고 단백질 치료제의 면역 원성을 완화하는 것은 초기 단계의 biotherapeutic 개발의 중요한 부분이 될 것입니다. 이 과정을 용이하게하기 위해, 생물 공학자는 에피토프 예측 16-22에 대한 계산 방법 중 자신뿐만 아니라 기능 3,23-26을 유지하면서 면역 원성을 줄이기 위해 노력 통합 단백질 설계 알고리즘을 도와 줄 수 있습니다. 마찬가지로, 백신 설계와 개발은 예측 알고리즘 4의 전원을 활용할 수 있으며, 역 신학의 지속적인 성숙을 보호 얻을 것으로 예상된다이전의 노력 33 회피 한 감염원의 광범위한 배열에 대한 백신. 이 계산 도구는 근본적으로 약물과 백신 개발 프로세스를 가속화 할 수있는 능력을 가지고 있지만, 실리 예측의 결과는 궁극적으로 더 이렇게 실적이 후보자의 다루기 쉬운 번호를 식별하기 필터링해야합니다. 정량적 펩타이드 MHC II 분석에서의 최근 발전은 발광 산소 면역 측정법 (35)을 채널링 기반 설계 효모 세포 표면 디스플레이 시스템 (34)과 마이크로 비드의 개발을 포함하지만, 시험 관내 ELISA 타입 분석법은 특정 MHC II 및 펩티드 쌍 사이의 바인딩 정량화 사역마 남아있다. 여기서, 인간 MHC II 면역 분자에 결합하는 펩티드 에피토프의 급속한 양적 및 비용 효과 분석을위한 마이크로 리터 규모 절차를 설명한다. 이들 방법은 깔때기 과정에서 초기 단계의 실험 도구로서 사용될 수있다.

PU에 대한데모 rposes는 BLA의 순서는 ProPred 웹 서버를 사용하여 추정 MHC II 바인딩 펩타이드를 분석 하였다. 이 펩티드의 세븐은 화학적으로 합성 실험적으로 용해 인간의 MHC II DRB1 * 1501에 바인딩에 대한 검사를했다. 예측 정확도 28의 다른 분석과 유사하게, ProPred 바인딩 예측 DRB1 * 1501 MHC II 대립 유전자에 대해 실험적으로 측정 IC (50)와 합리적 상관 관계. 그것은 정확한 MHC의 희석, 제어 펩티드 및 테스트 펩티드를 확인하기 위해주의해야한다 결과 농도 및 관리의 변화에​​ 민감한 것을주의하는 것이 중요하다. 마찬가지로,이 방법의 한계는 IC 50 값은 MHC의 농도 및 제어 펩티드를 기준으로한다는 것입니다. BLA 펩타이드 테스트 세트 중, 가장 높은 ProPred 에피토프 재조합 DRB1의 * 1501 바인딩 강한 전시 위를 차지했다. 마찬가지로, 다른 모든 예측 에피토프 바인더는 높은 MHC II 선호도에 온건 보였다. 예상 한 바와 같이,중복 예측 결합 에피토프 및 구속력 에피토프를 포함하는 합성 펩티드는 모든 경우에 MHC II에 결합하는 것으로 확인되었다. 예측 에피토프 위를 가장 낮은 두 스팬 펩타이드 (31)는, 가장 약한 MHC II 바인더 것으로 판명. 펩티드 24는, 그러나, 오직 그 높은 순위 구성 에피토프 (에피토프 24)는 5 % 임계에 예측 바인더 아니라고하는 사실에도 불구하고, 적당한 친 화성으로 MHC II를 결합하는 것으로 하였다. 흥미롭게도, 에피토프 (24) BLA 10 deimmunizing 목표로 이전 연구에서 확인되었다. 그 실험에서, 합성 펩티드 (24)는 인간 PBMC의 분석에서 높은 면역 원성 것으로 나타났다. 따라서,이 경우에, 우리의 MHC II 결합 분석은 ProPred하지 않았지만 면역 원성의 예측 것으로 판명. 집계의 결과는 가능성이 면역 원성 항원으로 연구자를 안내에 전산 예측의 유용성을 설명하지만, 그들은 또한의 중요한 구성 요소로 높은 처리량 실험 방법의 중요성을 강조단백질 / 백신 디자인 프로세스.

중요한 것은,이 384도 실험 설계는 고도의 병렬화와 최대 15 펩티드 384 - 웰 ELISA 플레이트 당 하나의 MHC II 대립 유전자의 엄격한 분석을 허용합니다. 하나의 액체 처리 로봇을 사용하여,이 방법은 한 연구자가 48 시간 미만의 네 MHC II 대립 유전자 유형에 대한 아흔 시험 펩티드를 분석 할 수 있습니다. 이 디자인은 각각의 농도에서 8 개의 서로 다른 테스트 펩타이드 농도와 세중의 측정을 포함한다. 따라서, 사용자는 강력하고 재현 가능한 정량 결과를 보장합니다. 단백질 치료제 나 백신의 설계 및 개발 분야에서 일하는 사람들이 프로토콜은 단백질 deimmunization 또는 면역 원성 분석에 자신의 작업을 촉진하는데 유용하게 찾을 수 있습니다.

구연산 인산 버퍼 (22.2 mM의 구연산, 55.6 mM 이염 나 2 HPO 4, 산도 5.4)
222 ㎖의 0.1 M 시트르산
278 ml의 0.2 M 이염 나 2 HPO 4
500 ml의 H 2 O를 MilliQ
시트르산 나트륨, 인산, 및 H를 MilliQ 2 O. 450 ㎖의 혼합 5.4으로 산도를 조정하고 1 L.에 QS
이 용액을 실온에서 안정하다.
바인딩 반응 버퍼
구연산 인산 버퍼, pH를 5.4 2 % V / V 1 ㎜ PefaBloc
1.5 % W / V 옥틸-β-D-glucopyranaside
바로 사용합니다.
1 ㎜ PefaBloc
1 ㎖를 MilliQ H 2 O
25 밀리그램 PefaBloc의 SC (분말)
-20 ˚ C에서 분주하고 저장을
붕산 버퍼 식 (12.5 mM의 나트륨 사중수화물, pH를 8.2)
1.19 g의 나트륨 테트라 보레이트 데카 하이드레이트 (시그마)
250 밀리리터를 MilliQ H 2 O
를 MilliQ H 2 O의 225 ㎖에 나트륨 붕산 수화물을 녹여 250 ml로 8.2 QS로 산도를 조정합니다.
이 용액을 실온에서 안정하다.
PBS-트윈 (2.7 밀리미터의 KCl, 1.5 mM의 KH 2 PO 4, 136.9 밀리미터의 NaCl, 8.9 mM의 나 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0.05 % 트윈, 산도 7.4)
4.5 L를 MilliQ H 2 O 500 ㎖의 10 배 둘 베코의 PBS (DPBS)
2.5 ㎖의 트윈 20
이 용액을 실온에서 안정하다.
중화 버퍼 (50 mM의 Trizma 염산, 산도 8.0)
475 밀리리터를 MilliQ H 2 O
25 ㎖의 1 M 염산 Trizma
혼합 및 8.0으로 산도를 조정
이 솔루션은 4 ℃에서 안정

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Disclosures

레너드 모이는에 의해 고용 및 EpiVax, 주식, 프로비던스,로드 아일랜드에있는 개인 소유의 생명 공학 회사의 스톡 옵션을 보유하고 있습니다. 이 연구 보고서에 포함 된 작품은 회사의 상업적인 목표와 연관 될 수있는 편견이다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH 보조금 R01-GM-098977 및 CBK와 KEG에 R21-AI-098122에 의해 지원되었다. RSS는 공학 이어 학교에서 이어 혁신 프로그램 원정대에 의해 루스 재단 원정대에 의해 부분적으로 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석
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Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

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